第九章 分子定向進(jìn)化

第八章分子定向進(jìn)化育種

一、酶定向進(jìn)化發(fā)展歷史

定向進(jìn)化是近20年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，是達(dá)爾文的進(jìn)化論思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和應(yīng)用。它不需要深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)室條件下人工模擬生物大分子自然進(jìn)化過(guò)程，在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)誘變，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變體，從而可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)自然界幾百萬(wàn)年才能完成的進(jìn)化過(guò)程。二、理性設(shè)計(jì)寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變盒式突變

點(diǎn)飽和突變技術(shù)是通過(guò)對(duì)目的蛋白的編碼基因進(jìn)行改造,短時(shí)間內(nèi)獲取靶位點(diǎn)氨基酸分別被其它19種天然氨基酸所替代的突變子。它不是定點(diǎn)突變技術(shù)的簡(jiǎn)單延伸,而是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)理念的全面升華,廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)改造及結(jié)構(gòu)—功能關(guān)系研究中,并取得了一系列令人矚目的成績(jī)。如利用點(diǎn)飽和突變技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)功能位點(diǎn),提高酶比活力,改善酶熱穩(wěn)定性、底物結(jié)合特異性及立體異構(gòu)特異性等多方面性質(zhì)。1、寡核苷酸定向誘變?cè)摲椒ㄓ谏鲜兰o(jì)70年代末建立,將目的基因克隆到噬菌體M13單鏈表達(dá)載體上,然后合成一段在靶位點(diǎn)處含突變寡核苷酸的引物,使其與目的基因配對(duì),再加入四種dNTP和KlenowDNA聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全長(zhǎng)基因,獲得的重組雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)染細(xì)菌后大量復(fù)制,進(jìn)而篩選出陽(yáng)性突變子。優(yōu)點(diǎn):目的基因可插入到噬菌體衣殼蛋白編碼基因內(nèi),通過(guò)噬菌體表面展示技術(shù)可方便地篩選出重組子。不足之處:(1)對(duì)19種氨基酸須分別設(shè)計(jì)各自寡核苷酸引物,費(fèi)用較大;(2)大腸桿菌宿主細(xì)胞存在自身修復(fù)系統(tǒng),因突變修復(fù)而難以篩選出突變子;(3)不適合多點(diǎn)飽和突變。2、盒式誘變

該法利用一種含有突變靶位點(diǎn)和特殊酶切位點(diǎn)序列的密碼子盒(codoncassette)來(lái)引入突變序列。由于密碼子盒可從正反兩方向插入目的基因,因此只須11種密碼子盒就可替換產(chǎn)生全部20種氨基酸以達(dá)到點(diǎn)飽和突變的效果。該法突出優(yōu)點(diǎn)是:一個(gè)靶位點(diǎn)兩側(cè)的酶切位點(diǎn)經(jīng)過(guò)改造可替換成其它氨基酸,相對(duì)于寡核苷酸定向誘變而言節(jié)省了引物合成的費(fèi)用,而且可對(duì)多個(gè)非鄰近位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行點(diǎn)飽和突變。不足之處是:(1)每個(gè)靶位點(diǎn)兩側(cè)需分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn);(2)密碼子盒兩端存在重復(fù)序列,因自連而增加突變子篩選難度。3、基于PCR的點(diǎn)飽和突變1）、突變引物誘變當(dāng)靶位點(diǎn)位于基因兩端時(shí),可設(shè)計(jì)這樣一對(duì)引物擴(kuò)增目的基因,正向引物為靶位點(diǎn)突變的兼并引物,反向引物為目的基因序列引物。突變引物誘變是基于PCR的點(diǎn)飽和突變中最簡(jiǎn)單、最快速的方法,但難以對(duì)基因中間的靶位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)飽和突變。2）、重疊延伸PCR

設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物,使其在靶位點(diǎn)附近有一定程度的重疊(圖2中的B、C引物),分別與基因5′和3′端引物(圖2中的A、D引物)組合,擴(kuò)增含突變靶位點(diǎn)的上游片段和下游片段,然后將上下游片段在靶位點(diǎn)處交錯(cuò),互為模板重疊延伸成全長(zhǎng)基因。

圖2重疊延伸PCR技術(shù)流程A、D分別表示基因上下游引物；B、C分別表示靶位點(diǎn)正反向突變引物；基因上的黑色區(qū)域?yàn)榘形稽c(diǎn)，NNN表示兼并引物或突變核苷酸該法主要優(yōu)點(diǎn):(1)能方便地對(duì)基因中間的靶位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)飽和突變,解決中間靶位點(diǎn)不易突變的難題;(2)突變與重組同時(shí)完成,大大縮短實(shí)驗(yàn)周期;(3)不存在突變修復(fù)問(wèn)題,容易篩選出全部突變子;(4)可方便地進(jìn)行多點(diǎn)飽和突變。不足之處是:當(dāng)靶位點(diǎn)靠近目的基因末端時(shí),分段擴(kuò)增的片段過(guò)小而不易回收;分別擴(kuò)增上下游片段時(shí),不能使用具有無(wú)模板加尾性能的polI型耐熱DNA聚合酶,而應(yīng)使用無(wú)加尾性能的高保真α型或混合型耐熱DNA聚合酶。3、質(zhì)粒擴(kuò)增誘變

在靶位點(diǎn)處設(shè)計(jì)一對(duì)反向兼并引物,擴(kuò)增質(zhì)粒全長(zhǎng)片段,然后用DpnI消化含甲基化位點(diǎn)的親本鏈,新合成鏈由于沒(méi)有甲基化位點(diǎn)而被保護(hù)。由于此法需要擴(kuò)增質(zhì)粒全長(zhǎng)序列,因此在PCR反應(yīng)中應(yīng)特別注意擴(kuò)增的保真性,一般采用高保真α型或混合型耐熱DNA聚合酶。常用點(diǎn)飽和突變技術(shù)特性的比較三、非理性設(shè)計(jì)—蛋白質(zhì)（酶）定向進(jìn)化

（一）進(jìn)化策略特征：（1）進(jìn)化的每一關(guān)鍵步驟都受到嚴(yán)密控制。（2）除修飾改善蛋白質(zhì)已有特性和功能外，還可引入一個(gè)全新的功能，來(lái)執(zhí)行從不被生物體所要求的反應(yīng)；甚至為生物體策劃一個(gè)新的代謝途徑；（3）能從進(jìn)化結(jié)果中探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基本特征。（二）定向進(jìn)化常用方法1.易錯(cuò)PCR為代表的無(wú)性進(jìn)化2.DNA改組技術(shù)為代表的有性進(jìn)化3.基因家族之間的同源重組4.雜合酶(1)雜合酶(2)構(gòu)建策略

1、易錯(cuò)PCR是一種簡(jiǎn)便快速地在DNA序列中隨機(jī)制造突變的方法，它通過(guò)改變傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中某些組分的濃度，使堿基在一定程度上隨機(jī)錯(cuò)配而引入多點(diǎn)突變。本法的關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)耐蛔冾l率，當(dāng)突變頻率太高時(shí)，幾乎無(wú)法篩選到有益突變；若突變頻率太低，野生型將占據(jù)突變?nèi)后w的優(yōu)勢(shì)，也很難篩選到理想的突變體。費(fèi)力、費(fèi)時(shí)，且易出現(xiàn)同型堿基轉(zhuǎn)換

2、DNAshuffling

1994年,Stemmer在Nature發(fā)表了一篇題為RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling的文章,首次提出了DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)。Stemmer以β-內(nèi)酰胺酶系統(tǒng)為試驗(yàn)對(duì)象,用DNA改組,經(jīng)過(guò)三輪篩選和兩次回交得到一新菌株,其頭孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制濃度比原始菌株提高了32,000倍,也遠(yuǎn)高于易錯(cuò)PCR的突變篩選結(jié)果。

DNA改組是DNA分子的體外重組,是基因在分子水平上有性重組。通過(guò)改變單個(gè)基因(或基因家族)原有核苷酸序列,創(chuàng)造新基因,并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能。實(shí)際上,該技術(shù)是一種分子水平上的定向進(jìn)化。因此也稱為分子育種。在創(chuàng)造新基因的過(guò)程中,要設(shè)法產(chǎn)生各種變異。這主要通過(guò)有性PCR、交錯(cuò)延伸PCR完成。值得指出的是,DNA改組的效果必須由改組后的基因表達(dá)產(chǎn)物的功能來(lái)驗(yàn)證。因此,靈敏可靠的篩選方法是DNA改組技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。DNA改組是基因在分子水平上進(jìn)行的有性重組，是一種反復(fù)性突變、重組的過(guò)程。主要包括以下步驟：（1）目的DNA片段的獲得；（2）目的基因的隨機(jī)片段化，即將目的基因（可以是單個(gè)基因或一組相關(guān)基因）酶切成隨機(jī)片段，這些隨機(jī)片段集合包含了來(lái)自不同的同源序列的寡核苷酸，這些寡核苷酸具有不同的3’末端，從而為下一步的無(wú)引物PCR提供了條件；（3）無(wú)引物PCR，即具有互補(bǔ)3’末端的寡核苷酸互為引物，各為模板，通過(guò)不斷的PCR循環(huán)，在不同模板上隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合并進(jìn)一步延伸；（4）有引物PCR，即以上輪無(wú)引物PCR的產(chǎn)物為模板，加入基因兩端序列為引物，經(jīng)過(guò)多輪PCR得到重排產(chǎn)物的集合，稱為突變文庫(kù)；（5）克隆、篩選、分析及多輪篩選，即進(jìn)一步對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，選擇改良的突變體組成下一輪改組的模板，重復(fù)上述步驟進(jìn)行多次重排和篩選，最終獲得性狀比較理想的突變體。優(yōu)點(diǎn)：①DNA改組可在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進(jìn)化速度；而且對(duì)可操作的靶序列沒(méi)有任何要求，長(zhǎng)度可以達(dá)到幾十kb；②通過(guò)多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高；③DNA改組從表型上早期進(jìn)行選擇，而不必了解DNA片斷上序列的信息，簡(jiǎn)化了操作程序；④DNA改組比隨機(jī)突變顯著提高了良性突變的概率。研究表明，DNA改組比隨機(jī)突變具有較大的優(yōu)勢(shì)，隨機(jī)突變的方法一般產(chǎn)生1%的良性突變，但DNA改組可產(chǎn)生13%的良性突變。

Canada等通過(guò)對(duì)BurkholderiacepaciaG4來(lái)源的甲苯單加氧酶進(jìn)行體外定向分子進(jìn)化,以提高其對(duì)氯乙烯和萘氧化物的活性。經(jīng)過(guò)體外分子進(jìn)化,獲得活性提高的突變酶。在大腸桿菌中表達(dá)突變的突變酶,其降解三氯乙烯、二氯乙烯速率明顯加快。表達(dá)突變酶的整個(gè)細(xì)胞的合成1-萘酚速度比野生型的突變酶快6倍,而且突變酶其區(qū)域?qū)Ｒ恍詻](méi)有改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌中表達(dá)的突變酶表現(xiàn)出對(duì)三環(huán)復(fù)合物菲、芴和蒽較野生型更快的氧化效率。Dai等使用基因改組提高了S.chlorophenolicum降解五氯苯酚的水解能力和對(duì)高濃度五氯苯酚的耐受力。Bosma等構(gòu)建了一個(gè)能夠在三氯丙烷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物體。在亞甲基曙紅蘭的平板上選擇對(duì)降解三氯丙烷活性提高的鹵代烷脫鹵酶,經(jīng)過(guò)兩輪體外定向進(jìn)化,獲得含有兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變,Cys176Tyr和Tyr273Phe,表現(xiàn)出比野生型對(duì)三氯丙烷脫鹵效率提高8倍的鹵代烷脫鹵酶。

Crameri等通過(guò)DNAshuffling技術(shù)來(lái)改造砷抗性基因,通過(guò)三輪的改組和篩選,得到了對(duì)砷的抗性提高40倍的突變體,雖然在還原酶的基因里并未發(fā)現(xiàn)突變,但還原酶的活性提高了近10倍,推測(cè)可能是側(cè)翼序列突變引起的。Suenaga等在序列分析的基礎(chǔ)上,結(jié)合推理設(shè)計(jì),構(gòu)建了12個(gè)定點(diǎn)的bphA1突變,其中3個(gè)突變酶改變了多氯聯(lián)苯復(fù)合物的降解特異性區(qū)域。尤其是Ile335Phe突變體在提高了降解多氯聯(lián)苯的能力外,還具備了降解2,3-雙加氧酶和3,4-雙加氧酶的活性。Keenan等還獲得了活性提高11、14、15倍的萘雙加氧酶,另外在單加氧酶的功能改進(jìn)方面取得了較好的進(jìn)展。

3、DNA家族改組

Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改組”的概念。他們發(fā)現(xiàn),采用傳統(tǒng)的DNA改組方法雖然能完成定向進(jìn)化的目的,但其中隨機(jī)產(chǎn)生的多為點(diǎn)突變,且有益突變頻率低,導(dǎo)致篩選工作艱巨且進(jìn)展緩慢。

該技術(shù)打破不同種、屬間的遺傳界限,利用同源基因之間的同源序列進(jìn)行DNA改組,通過(guò)提高親本基因群中差異的組合頻率和改組子代的雜合度,以增加突變文庫(kù)的多樣性,提高突變文庫(kù)的質(zhì)量,進(jìn)而有效地產(chǎn)生滿足需要的突變體。與其他DNA改組技術(shù)相比,DNA家族改組技術(shù)不僅可以顯著加速有益突變的累積,還易于實(shí)現(xiàn)目的蛋白多種特性的共進(jìn)化。

進(jìn)行基因組改組首先需要有一個(gè)含有各種不同正突變的基因組庫(kù)(例如:通過(guò)經(jīng)典的誘變育種得到目的性狀發(fā)生改進(jìn)的不同的正突變菌株就構(gòu)成了所需的基因組庫(kù)),隨后通過(guò)原生質(zhì)體融合將這些正突變菌株的全基因組進(jìn)行隨機(jī)重組,并篩選目的性狀得到進(jìn)一步改進(jìn)的菌株來(lái)進(jìn)行下一輪基因組改組,這樣,通過(guò)循環(huán)多輪的隨機(jī)重組可以快速、高效地選育出表型得到較大改進(jìn)的雜交菌種。DNA家族改組的經(jīng)典技術(shù)路線

Kumamaru等對(duì)P.pseudoalcaligenesKF707的bphA1（聯(lián)二苯雙加氧酶）基因和Burkholderia

sp.strainLB400的bphA基因進(jìn)行了體外分子進(jìn)化改造,提高了菌株對(duì)多氯聯(lián)苯的降解能力,還擴(kuò)大了菌株的降解范圍。經(jīng)改組和篩選獲得的bph突變基因在大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng),對(duì)乙苯、丁苯和異丙苯降解能力較野生型高。successfuluses

Barriault等針對(duì)聯(lián)二苯雙加氧酶基因的片段進(jìn)行改組。其中聯(lián)二苯雙加氧酶的同源基因片段分別來(lái)源于Burkholderiasp.,Comamonastestosteroni和Rhodococcusgloberulus。研究者在較小的庫(kù)容內(nèi)篩選到的新酶不僅對(duì)2,2-二氯聯(lián)苯、3,3-二氯聯(lián)苯和4,4-二氯聯(lián)苯活力提高,而且對(duì)不易分解的2,6-二氯聯(lián)苯也具有良好的氧化能力。

基因組改組重組幾個(gè)菌株同源染色體可以提高整個(gè)生物體的活性。該方法已用于生物修復(fù)中五氯酚的降解，Dai等通過(guò)三輪基因組改組將Sphingobilumchlorophenolicum對(duì)劇毒殺蟲(chóng)劑五氯苯酚的耐受濃度提高了10倍以上,并可將培養(yǎng)基中所含的3mmol·L-1五氯苯酚完全降解。

Vezina等借助DNA家族改組技術(shù)探索了苯雙加氧酶BPDOs底物的立體專一性和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,獲得了對(duì)2,2’-CB(2,2’-二氯聯(lián)苯)中C5和C6的氧化活性