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文檔簡介
第八章分子定向進化育種
一、酶定向進化發(fā)展歷史
定向進化是近20年發(fā)展起來的一項新技術,是達爾文的進化論思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和應用。它不需要深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構功能關系,在實驗室條件下人工模擬生物大分子自然進化過程,在體外對基因進行隨機誘變,使基因發(fā)生大量變異,并定向選擇出所需性質(zhì)的突變體,從而可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)自然界幾百萬年才能完成的進化過程。二、理性設計寡核苷酸引物介導的定點突變PCR介導的定點突變盒式突變
點飽和突變技術是通過對目的蛋白的編碼基因進行改造,短時間內(nèi)獲取靶位點氨基酸分別被其它19種天然氨基酸所替代的突變子。它不是定點突變技術的簡單延伸,而是蛋白質(zhì)設計理念的全面升華,廣泛地應用于蛋白質(zhì)改造及結(jié)構—功能關系研究中,并取得了一系列令人矚目的成績。如利用點飽和突變技術鑒定蛋白質(zhì)功能位點,提高酶比活力,改善酶熱穩(wěn)定性、底物結(jié)合特異性及立體異構特異性等多方面性質(zhì)。1、寡核苷酸定向誘變該方法于上世紀70年代末建立,將目的基因克隆到噬菌體M13單鏈表達載體上,然后合成一段在靶位點處含突變寡核苷酸的引物,使其與目的基因配對,再加入四種dNTP和KlenowDNA聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全長基因,獲得的重組雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)染細菌后大量復制,進而篩選出陽性突變子。優(yōu)點:目的基因可插入到噬菌體衣殼蛋白編碼基因內(nèi),通過噬菌體表面展示技術可方便地篩選出重組子。不足之處:(1)對19種氨基酸須分別設計各自寡核苷酸引物,費用較大;(2)大腸桿菌宿主細胞存在自身修復系統(tǒng),因突變修復而難以篩選出突變子;(3)不適合多點飽和突變。2、盒式誘變
該法利用一種含有突變靶位點和特殊酶切位點序列的密碼子盒(codoncassette)來引入突變序列。由于密碼子盒可從正反兩方向插入目的基因,因此只須11種密碼子盒就可替換產(chǎn)生全部20種氨基酸以達到點飽和突變的效果。該法突出優(yōu)點是:一個靶位點兩側(cè)的酶切位點經(jīng)過改造可替換成其它氨基酸,相對于寡核苷酸定向誘變而言節(jié)省了引物合成的費用,而且可對多個非鄰近位點同時進行點飽和突變。不足之處是:(1)每個靶位點兩側(cè)需分別設計酶切位點;(2)密碼子盒兩端存在重復序列,因自連而增加突變子篩選難度。3、基于PCR的點飽和突變1)、突變引物誘變當靶位點位于基因兩端時,可設計這樣一對引物擴增目的基因,正向引物為靶位點突變的兼并引物,反向引物為目的基因序列引物。突變引物誘變是基于PCR的點飽和突變中最簡單、最快速的方法,但難以對基因中間的靶位點進行點飽和突變。2)、重疊延伸PCR
設計一對簡并引物,使其在靶位點附近有一定程度的重疊(圖2中的B、C引物),分別與基因5′和3′端引物(圖2中的A、D引物)組合,擴增含突變靶位點的上游片段和下游片段,然后將上下游片段在靶位點處交錯,互為模板重疊延伸成全長基因。
圖2重疊延伸PCR技術流程A、D分別表示基因上下游引物;B、C分別表示靶位點正反向突變引物;基因上的黑色區(qū)域為靶位點,NNN表示兼并引物或突變核苷酸該法主要優(yōu)點:(1)能方便地對基因中間的靶位點進行點飽和突變,解決中間靶位點不易突變的難題;(2)突變與重組同時完成,大大縮短實驗周期;(3)不存在突變修復問題,容易篩選出全部突變子;(4)可方便地進行多點飽和突變。不足之處是:當靶位點靠近目的基因末端時,分段擴增的片段過小而不易回收;分別擴增上下游片段時,不能使用具有無模板加尾性能的polI型耐熱DNA聚合酶,而應使用無加尾性能的高保真α型或混合型耐熱DNA聚合酶。3、質(zhì)粒擴增誘變
在靶位點處設計一對反向兼并引物,擴增質(zhì)粒全長片段,然后用DpnI消化含甲基化位點的親本鏈,新合成鏈由于沒有甲基化位點而被保護。由于此法需要擴增質(zhì)粒全長序列,因此在PCR反應中應特別注意擴增的保真性,一般采用高保真α型或混合型耐熱DNA聚合酶。常用點飽和突變技術特性的比較三、非理性設計—蛋白質(zhì)(酶)定向進化
(一)進化策略特征:(1)進化的每一關鍵步驟都受到嚴密控制。(2)除修飾改善蛋白質(zhì)已有特性和功能外,還可引入一個全新的功能,來執(zhí)行從不被生物體所要求的反應;甚至為生物體策劃一個新的代謝途徑;(3)能從進化結(jié)果中探索蛋白質(zhì)結(jié)構和功能的基本特征。(二)定向進化常用方法1.易錯PCR為代表的無性進化2.DNA改組技術為代表的有性進化3.基因家族之間的同源重組4.雜合酶(1)雜合酶(2)構建策略
1、易錯PCR是一種簡便快速地在DNA序列中隨機制造突變的方法,它通過改變傳統(tǒng)PCR反應體系中某些組分的濃度,使堿基在一定程度上隨機錯配而引入多點突變。本法的關鍵在于選擇適當?shù)耐蛔冾l率,當突變頻率太高時,幾乎無法篩選到有益突變;若突變頻率太低,野生型將占據(jù)突變?nèi)后w的優(yōu)勢,也很難篩選到理想的突變體。費力、費時,且易出現(xiàn)同型堿基轉(zhuǎn)換
2、DNAshuffling
1994年,Stemmer在Nature發(fā)表了一篇題為RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling的文章,首次提出了DNA改組(DNAshuffling)技術。Stemmer以β-內(nèi)酰胺酶系統(tǒng)為試驗對象,用DNA改組,經(jīng)過三輪篩選和兩次回交得到一新菌株,其頭孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制濃度比原始菌株提高了32,000倍,也遠高于易錯PCR的突變篩選結(jié)果。
DNA改組是DNA分子的體外重組,是基因在分子水平上有性重組。通過改變單個基因(或基因家族)原有核苷酸序列,創(chuàng)造新基因,并賦予表達產(chǎn)物以新功能。實際上,該技術是一種分子水平上的定向進化。因此也稱為分子育種。在創(chuàng)造新基因的過程中,要設法產(chǎn)生各種變異。這主要通過有性PCR、交錯延伸PCR完成。值得指出的是,DNA改組的效果必須由改組后的基因表達產(chǎn)物的功能來驗證。因此,靈敏可靠的篩選方法是DNA改組技術成功與否的關鍵。DNA改組是基因在分子水平上進行的有性重組,是一種反復性突變、重組的過程。主要包括以下步驟:(1)目的DNA片段的獲得;(2)目的基因的隨機片段化,即將目的基因(可以是單個基因或一組相關基因)酶切成隨機片段,這些隨機片段集合包含了來自不同的同源序列的寡核苷酸,這些寡核苷酸具有不同的3’末端,從而為下一步的無引物PCR提供了條件;(3)無引物PCR,即具有互補3’末端的寡核苷酸互為引物,各為模板,通過不斷的PCR循環(huán),在不同模板上隨機互補結(jié)合并進一步延伸;(4)有引物PCR,即以上輪無引物PCR的產(chǎn)物為模板,加入基因兩端序列為引物,經(jīng)過多輪PCR得到重排產(chǎn)物的集合,稱為突變文庫;(5)克隆、篩選、分析及多輪篩選,即進一步對突變文庫進行篩選,選擇改良的突變體組成下一輪改組的模板,重復上述步驟進行多次重排和篩選,最終獲得性狀比較理想的突變體。優(yōu)點:①DNA改組可在短時間內(nèi)通過重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列,從而大大加快進化速度;而且對可操作的靶序列沒有任何要求,長度可以達到幾十kb;②通過多輪篩選或選擇,可以使有益突變迅速積累,導致功能的明顯提高;③DNA改組從表型上早期進行選擇,而不必了解DNA片斷上序列的信息,簡化了操作程序;④DNA改組比隨機突變顯著提高了良性突變的概率。研究表明,DNA改組比隨機突變具有較大的優(yōu)勢,隨機突變的方法一般產(chǎn)生1%的良性突變,但DNA改組可產(chǎn)生13%的良性突變。
Canada等通過對BurkholderiacepaciaG4來源的甲苯單加氧酶進行體外定向分子進化,以提高其對氯乙烯和萘氧化物的活性。經(jīng)過體外分子進化,獲得活性提高的突變酶。在大腸桿菌中表達突變的突變酶,其降解三氯乙烯、二氯乙烯速率明顯加快。表達突變酶的整個細胞的合成1-萘酚速度比野生型的突變酶快6倍,而且突變酶其區(qū)域?qū)R恍詻]有改變。進一步研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌中表達的突變酶表現(xiàn)出對三環(huán)復合物菲、芴和蒽較野生型更快的氧化效率。Dai等使用基因改組提高了S.chlorophenolicum降解五氯苯酚的水解能力和對高濃度五氯苯酚的耐受力。Bosma等構建了一個能夠在三氯丙烷培養(yǎng)基中生長的生物體。在亞甲基曙紅蘭的平板上選擇對降解三氯丙烷活性提高的鹵代烷脫鹵酶,經(jīng)過兩輪體外定向進化,獲得含有兩個氨基酸位點的突變,Cys176Tyr和Tyr273Phe,表現(xiàn)出比野生型對三氯丙烷脫鹵效率提高8倍的鹵代烷脫鹵酶。
Crameri等通過DNAshuffling技術來改造砷抗性基因,通過三輪的改組和篩選,得到了對砷的抗性提高40倍的突變體,雖然在還原酶的基因里并未發(fā)現(xiàn)突變,但還原酶的活性提高了近10倍,推測可能是側(cè)翼序列突變引起的。Suenaga等在序列分析的基礎上,結(jié)合推理設計,構建了12個定點的bphA1突變,其中3個突變酶改變了多氯聯(lián)苯復合物的降解特異性區(qū)域。尤其是Ile335Phe突變體在提高了降解多氯聯(lián)苯的能力外,還具備了降解2,3-雙加氧酶和3,4-雙加氧酶的活性。Keenan等還獲得了活性提高11、14、15倍的萘雙加氧酶,另外在單加氧酶的功能改進方面取得了較好的進展。
3、DNA家族改組
Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改組”的概念。他們發(fā)現(xiàn),采用傳統(tǒng)的DNA改組方法雖然能完成定向進化的目的,但其中隨機產(chǎn)生的多為點突變,且有益突變頻率低,導致篩選工作艱巨且進展緩慢。
該技術打破不同種、屬間的遺傳界限,利用同源基因之間的同源序列進行DNA改組,通過提高親本基因群中差異的組合頻率和改組子代的雜合度,以增加突變文庫的多樣性,提高突變文庫的質(zhì)量,進而有效地產(chǎn)生滿足需要的突變體。與其他DNA改組技術相比,DNA家族改組技術不僅可以顯著加速有益突變的累積,還易于實現(xiàn)目的蛋白多種特性的共進化。
進行基因組改組首先需要有一個含有各種不同正突變的基因組庫(例如:通過經(jīng)典的誘變育種得到目的性狀發(fā)生改進的不同的正突變菌株就構成了所需的基因組庫),隨后通過原生質(zhì)體融合將這些正突變菌株的全基因組進行隨機重組,并篩選目的性狀得到進一步改進的菌株來進行下一輪基因組改組,這樣,通過循環(huán)多輪的隨機重組可以快速、高效地選育出表型得到較大改進的雜交菌種。DNA家族改組的經(jīng)典技術路線
Kumamaru等對P.pseudoalcaligenesKF707的bphA1(聯(lián)二苯雙加氧酶)基因和Burkholderia
sp.strainLB400的bphA基因進行了體外分子進化改造,提高了菌株對多氯聯(lián)苯的降解能力,還擴大了菌株的降解范圍。經(jīng)改組和篩選獲得的bph突變基因在大腸桿菌細胞培養(yǎng),對乙苯、丁苯和異丙苯降解能力較野生型高。successfuluses
Barriault等針對聯(lián)二苯雙加氧酶基因的片段進行改組。其中聯(lián)二苯雙加氧酶的同源基因片段分別來源于Burkholderiasp.,Comamonastestosteroni和Rhodococcusgloberulus。研究者在較小的庫容內(nèi)篩選到的新酶不僅對2,2-二氯聯(lián)苯、3,3-二氯聯(lián)苯和4,4-二氯聯(lián)苯活力提高,而且對不易分解的2,6-二氯聯(lián)苯也具有良好的氧化能力。
基因組改組重組幾個菌株同源染色體可以提高整個生物體的活性。該方法已用于生物修復中五氯酚的降解,Dai等通過三輪基因組改組將Sphingobilumchlorophenolicum對劇毒殺蟲劑五氯苯酚的耐受濃度提高了10倍以上,并可將培養(yǎng)基中所含的3mmol·L-1五氯苯酚完全降解。
Vezina等借助DNA家族改組技術探索了苯雙加氧酶BPDOs底物的立體專一性和結(jié)構之間的關系,獲得了對2,2’-CB(2,2’-二氯聯(lián)苯)中C5和C6的氧化活性
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