泛素特異性蛋白酶USP研究進展

泛素特異性蛋白酶46（ubiquitin-specificprotease46,USP46）研究進展一.真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解途徑介紹溶酶體途徑---非特異性的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，真核細胞內(nèi)90%以上的長壽蛋白和一部分短壽命蛋白都是在溶酶體中降解的。泛素-蛋白酶體途徑---是真核細胞中具高效和高度選擇性的特異性降解蛋白質(zhì)的重要途徑，廣泛參與機體多種代謝活動。胱天蛋白酶(caspase)途徑---蛋白酶以酶原的形式存在于正常細胞中，細胞凋亡啟動后被激活。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)由泛素、泛素化酶（包括泛素活化酶E1、泛素偶聯(lián)酶E2、泛素連接酶E3）、蛋白酶體和去泛素化酶組成。泛素化酶為底物蛋白加上泛素標簽，泛素化的蛋白質(zhì)被運送到蛋白酶體降解。蛋白質(zhì)的泛素化是一個可逆的過程，去泛素化酶通過對底物蛋白的去泛素化來調(diào)控蛋白質(zhì)的壽命。二.蛋白質(zhì)泛素化與去泛素化介紹泛素是一個含76個氨基酸在結(jié)構(gòu)和序列上都高度保守的蛋白質(zhì)分子，分子量大概8.5kDa。蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一種廣泛存在且非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。調(diào)控許多生物學功能包括細胞周期、細胞凋亡、DNA損傷修復、細胞免疫以及神經(jīng)元退化等方面都發(fā)揮著重要作用。1.蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一個泛素分子(ubiquitin)通過其羧基端結(jié)合到目的蛋白賴氨酸(Lys,K)上的共價反應過程。泛素本身有7個賴氨酸殘基位點，分別是K6、K11、K27、K29、K33、K48以及K63位，并且泛素本身的賴氨酸殘基也可以再與泛素分子相互結(jié)合。二.蛋白質(zhì)泛素化與去泛素化介紹1.蛋白質(zhì)的泛素化修飾首先,在E1催化下泛素的羧基端與E1的半胱氨酸激活位點以硫酯鍵結(jié)合,此過程需要ATP;其次,泛素被轉(zhuǎn)運到E2的半胱氨酸殘基,同樣是以硫酯鍵的形式接合;最后,在E3的作用下,泛素的羧基端與底物蛋白的賴氨酸-ε氨基基團之間形成肽鍵從而將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白上。E3具底物特異性二.蛋白質(zhì)泛素化與去泛素化介紹1.蛋白質(zhì)的泛素化修飾步驟/bst/032/0724/bst0320724f01.htm?resolution=HIGH二.蛋白質(zhì)泛素化與去泛素化介紹蛋白質(zhì)的泛素化修飾與衰老/

去泛素化酶在維持游離泛素和泛素結(jié)合蛋白的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。細胞內(nèi)廣泛存在多種去泛素化酶，按結(jié)構(gòu)不同分為5種類型。包括泛素特異性蛋白酶（USPs）泛素羧基末端水解酶（UCHs）Machado-Josephdiseaseproteindomainproteases（MJDs），卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶（OTUs）MPN（+）/JAMM蛋白酶（JAMMs）泛素特異性蛋白酶（USPs）是去泛素化酶中成員最多，且結(jié)構(gòu)最具多樣性的一類。二.蛋白質(zhì)泛素化與去泛素化介紹2.蛋白質(zhì)的去泛素化修飾二.蛋白質(zhì)泛素化與去泛素化介紹2.蛋白質(zhì)的去泛素化修飾（1）親核體如谷胱甘肽上泛素解離（2）泛素加合到細胞內(nèi)其他蛋白上（3）降解蛋白泛素寡聚體循環(huán)利用（4）未錨定泛素寡聚體的解離AlexanderY,etal.BiochimicaetBiophysicaActa2004,(1695)189–2073.去泛素化酶USP蛋白家族介紹二.蛋白質(zhì)泛素化與去泛素化介紹含有兩個短的高度保守的序列，稱為Cys結(jié)構(gòu)域和His結(jié)構(gòu)域序列中具有起催化作用的三聯(lián)殘基，即半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺，能將泛素分子從大的蛋白上移除。V.Quesadaetal.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2004,314:54–62Multi-tissueexpressionofUsp46mRNAinRattusnorvegicus3.泛素特異性蛋白酶USP46介紹二.蛋白質(zhì)泛素化與去泛素化介紹WeiZhang，etal.PLoSONE,2011,6(10),e26297.USP46調(diào)控抑郁usp46為懸尾試驗（TailSuspensionTest，TST）和強迫游泳試驗（ForcedSwimmingTest，F(xiàn)ST）中調(diào)節(jié)小鼠不動行為的數(shù)量性狀基因。CS和B6.CSNgu1053鼠在TST和FST實驗中不動時間明顯更短ShigeruTomida,etal.naturegenetics,2009,41(6):688-695.ShigeruTomida,etal.naturegenetics,2009,41(6):688-695.USP46調(diào)控抑郁CS小鼠Usp46第92號賴氨酸缺失是造成小鼠不動時間短于C57BL/6J小鼠的主要原因CS鼠5號染色體上Usp46基因有編碼一個賴氨酸的3個堿基缺失ShigeruTomida,etal.naturegenetics,2009,41(6):688-695.USP46調(diào)控抑郁細菌人工染色體Usp46轉(zhuǎn)基因鼠可以逆轉(zhuǎn)CS鼠的抗抑郁狀態(tài)Usp46第92號賴氨酸缺失導致酶活下調(diào)WeiZhang,etal.PLoSONE,2011,6(10),e26297.USP46基因標簽SNP的單倍型

與重度抑郁癥相關(guān)FukuoY,etal.Journalofaffectivedisorders,2011,133(1-2):150-157.ThedeubiquitinationenzymeUSP46functionsasatumorsuppressorbycontrollingPHLPP-dependentattenuationofAktsignalingincoloncancer去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥讀書報告：XinLi,etal.Oncogene.2013January24;32(4):471–478.報告人：林萬華時間：2013年11月16日三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥1.細胞內(nèi)PHLPP與USP46特異性相互作用

HA-PHLPP1分別與USP46、USP7、USP16共轉(zhuǎn)染293T細胞，USP蛋白帶有Flag和HA標簽，anti-Flag瓊脂糖免疫共沉淀。(Flag抗體拉USP,USP拉PHLPP1，結(jié)果只有USP46拉下了PHLPP1，而USP7和USP16沒有拉下PHLPP1，說明只有USP46與PHLPP1作用)。同樣，只有USP46與PHLPP2相互作用。在DLD1細胞中，內(nèi)源性的USP46可與內(nèi)源性的PHLPP1、2相互作用。

293T細胞中，GST,GST-PHLPP1，GST-PHLPP2片段拉USP46，只有PHLPP蛋白的C端與USP46相互作用。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥1.細胞內(nèi)PHLPP與USP46特異性相互作用

D.USP46與PHLPP相互作用的最小作用區(qū)段是C端的1139-1172，PHLPP1與PHLPP2的1139-1172區(qū)段是保守的E.同樣，在PHLPP2中，也是這個保守區(qū)段1268-1301與USP46相互作用。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥1.細胞內(nèi)PHLPP與USP46特異性相互作用

Fig.2Aand2B：在HCT116細胞中，超表達WTUSP46可以顯著提高PHLPP的蛋白水平，其效應是減少了70%的Akt磷酸化水平。將USP46催化區(qū)段Cys突變?yōu)镾er后，突變體USP46則失去了調(diào)控PHLPP表達水平和Akt磷酸化水平能力。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥2.

USP46調(diào)控PHLPP的表達水平

在HCT116細胞中，野生型USP46可以上調(diào)PHLPP1的表達水平，而Δ1139突變體和USP46-C44S沒有效應(Fig.2C)失去了磷酸化位點的PHLPP1-4A突變體，由于有抗泛素化降解作用而使其蛋白水平遠遠高于WTPHLPP1。USP46不能進一步提高PHLPP1-4A突變體的表達水平，表明USP46通過去泛素化來提高PHLPP蛋白的表達三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥2.

USP46調(diào)控PHLPP的表達水平

USP46敲低后，PHLPP降解大大加快。PHLPP1和PHLPP2的半衰期分別由4.6h降為2.3h，和6.1h降為3.3h(Fig.2Fand2G)。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥2.

USP46調(diào)控PHLPP的表達水平

體外檢測，經(jīng)WTUSP46處理后，PHLPP1的泛素化水平下降，但USP46-C44S突變體無此效應(Fig.3A)經(jīng)MG-132(蛋白酶抑制劑)處理后提取蛋白樣品檢測，發(fā)現(xiàn)超表達WTUSP46顯著下調(diào)PHLPP1的泛素化水平，而USP46-C44S突變體無此效應(Figure3B)。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥3.

USP46直接調(diào)控PHLPP1的泛素化

USP46敲低后PHLPP1的泛素化水平顯著上升(Fig.3C，3D)。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥3.

USP46直接調(diào)控PHLPP1的泛素化

當僅超表達PHLPP1時，Akt的去磷酸化水隨PHLPP1的表達增加而下調(diào)。然而，Akt的去磷酸化程度很低(Fig.4A,lanes1-4)。共表達USP46和PHLPP1可以很顯著地下調(diào)PHLPP1作用的Akt去磷酸化，因為USP46可以穩(wěn)定PHLPP1蛋白水平(Fig.4A,lanes5-6)。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥4.

USP46可以增強PHLPP的Akt去磷酸化能力

在測定PHLPP1和USP46基因?qū)CT116細胞增殖的影響時，我們發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化水平與細胞增殖速率密切相關(guān)(Fig.4B)。超表達PHLPP1可以劑量性的抑制細胞增殖，USP46共表達則可以增強這個效應(Fig.4B)。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥4.

USP46可以增強PHLPP的Akt去磷酸化能力,抑制細胞增殖敲低USP46可以提高Akt的磷酸化水平，敲低USP46后WTPHLPP1的Akt去磷酸化能力大大下降，而抗泛素化的PHLPP1-4A的Akt去磷酸化能力不變(Fig.4C)。在敲低USP46的細胞內(nèi)，PHLPP1很難抑制細胞增殖(Fig.4D)。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥4.

USP46可以增強PHLPP的Akt去磷酸化能力,抑制細胞增殖

構(gòu)建

載體、USP46、PHLPP1、及共表達PHLPP1和

USP464種HCT116細胞穩(wěn)定株。將細胞株注射入裸鼠皮下，觀察其后32天的成瘤性。如圖A所示，參照組細胞能有效的成瘤，到實驗結(jié)束時瘤體積達到1600mm3，超表達USP46后瘤體積明顯減小，但差異不顯著。而超表達PHLPP1則顯著減小瘤體積。共表達USP46則可顯著提高PHLPP1的抑瘤能力?？蓮姆蛛x的瘤內(nèi)檢測到PHLPP1和USP46的表達。在超表達USP46的細胞中PHLPP1的表達增加，而Akt磷酸化水平下降(Fig.5B)。三.去泛素化酶USP46通過控制PHLPP依賴性的Akt信號通路而抑制結(jié)腸癌癥5.

USP46增強PHLPP1腫瘤抑制能力以K