細胞生物學實驗操作指南

細胞生物學實驗操作指南目 錄洗滌與滅菌細胞培育瓶小燒杯、吹管鹽水瓶瓶蓋、膠塞塑料器皿附注：洗液配方〔次強酸液〕配置常用溶液平衡鹽溶液pH調整液抗生素液2.3.1青霉素+鏈霉素2.3.2兩性霉素2.3.3G4182.3.4潮霉素2.4消化液2.5培育基2.5.1配置2.5.2使用培育操作根本要求無菌操作一．洗滌與滅菌在組織培育中，離體細胞對任何有害物質都格外敏感。有害物質包括微生物、細胞剩余物以及非養(yǎng)分成分的化學物質。因此對承受和重使用的培育器皿，都要嚴格清洗。細胞培育瓶：浸泡：璃器皿，玻面常帶有很多枯槁的灰塵，同時在生產過程中，玻璃外表常呈堿性并帶有一些對(5%)浸泡過夜，以中和其中的堿性物質。培育后的玻璃器皿往往附有大量蛋白質，枯槁后不易刷洗掉，故用后要馬上浸入清水中；留意讓水能完全進入瓶皿中，不應留有氣泡。刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般仍舊要用毛刷沾洗滌劑洗滌，以除去器皿外表的附著較牢的雜質。刷洗次數太多，能損害器皿外表光澤度，所以應選用軟毛刷和優(yōu)質的洗滌劑〔如高級洗衣粉或洗潔精，確定不能使用含沙粒的去污粉！洗刷時特別留意洗刷瓶角部位。可以將洗滌劑倒入浸泡培育瓶的清水中，直接在水中進展刷洗，然后再以清水沖洗干凈。泡酸：器皿無腐蝕作用，去污力量很強，是清洗過程中關鍵的一環(huán)。浸泡時，器皿要布滿洗液，勿留氣泡。浸泡時間不應少于6小時，一般應浸泡過夜。留意，泡酸時要戴防酸手套，否則將損傷皮膚。沖洗：泡酸后必需用水充分沖洗，使之不留任何殘跡。沖洗時每瓶都要用水灌滿，倒掉。沖洗程2010遍，最終用雙蒸水沖洗兩遍。干烤：以鋁鉑封好瓶口，放入烘烤罐中，1602小時，完成干熱滅菌方能使用。返回名目小燒杯、吹管：(1)浸泡：初次使用和培育用后的小燒杯、吹管一樣需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶解掉。的玻璃器皿，同培育瓶一樣用鹽酸浸泡。泡酸：〔依據狀況可省略這一步〕刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗燒杯壁，吹管內壁也可用極細的軟毛刷刷洗。沖洗：104遍，最終用雙蒸水沖洗兩遍。干烤：蓋上筒蓋，1602小時，完成干熱滅菌方能使用。鹽水瓶：鹽水瓶主要用于放置培育基、Versen、D-Hanks等，一般購自醫(yī)院，原來已經盛放過溶液，為保證使用液的純潔，應充分洗滌、滅菌。用過的鹽水瓶先要裝滿水，以防內壁上的附著物枯槁；使用前倒去內容水，以洗液浸泡過夜，然后沖洗，自來水2010遍，雙蒸2遍，再以鋁鉑包裹瓶口，外包報紙，1602小時，完成干熱滅菌備用。瓶蓋、膠塞：2%NaOH10~201%30分鐘，最終104次，晾干，以紙包好，濕熱滅菌備用。塑料器皿：目前我試驗室組織培育使用的塑料器皿主要是從國外購置的，是一種無毒并已經輻照滅菌、密封包裝的商品。用時，只要翻開包裝即可，是一次使用性物品。必要時，用后經過無菌處理后，尚可反復使用2~3次，但不宜過多。再用時仍舊需要清洗和滅菌處理。塑料器皿質地軟，不宜用毛刷刷洗，造成清洗困難。為此使用中一是防止劃痕，二是用后要馬上浸入水中嚴防附著物枯槁；如殘留有附著物，可在洗液中浸泡過夜，用流水沖洗干凈，再用蒸餾2小時以上，置無菌處〔如超凈臺〕備用。凍存管可不必用紫外線滅菌，泡酸、清洗干凈后，旋上管蓋〔留意不要旋緊裹后裝入飯盒中濕熱滅菌備用。附注：洗液配方〔次強酸液〕重鉻酸鉀 120g濃硫酸 200mL蒸餾水 1000mL配置時先將濃硫酸倒入蒸餾水中，邊加邊攪拌，再將重鉻酸鉀晶體溶解入。返回名目二．配置溶液全部細胞培育用液都必需以三蒸水配置，在本試驗室的條件下以雙蒸水配置。平衡鹽溶液：PBS

(g/L)

D-HanksKCl 0.2

KClKHPOKHPO

0.2 2 42 4 NaClNaCl 8.0 NaHCONaHPO·12H0

2.08

3NaHPO·12H02 4 2

2 4 2酚 紅(g/L)0.40.068.00.350.080.0210×濃度的儲存液，在儲存液內加少許氯仿〔2-3mL〕防腐；氯仿在高壓滅菌時可揮發(fā)掉，不影響使用；加氯仿后要用力混勻，在室溫或4℃儲存。用時按比例稀釋，塞上膠塞，膠塞上插(g/L)0.40.068.00.350.080.02pH調整液：HEPES〔238.31〕200mL47.6HEPES1NNaOHpH7.5~8.04℃1M抗生素液：培育基液內參加適量的抗生素，以預防由于操作不慎而產生的微生物污染。常用的1100×的儲藏液，-20℃保存。青霉素+鏈霉素：取注射用青霉素鈉鹽粉末和注射用硫酸鏈霉素粉末，依據1萬單位每毫升的比例用D-Hanks100×的儲藏液，-20℃保存。兩性霉素：15mgB50mLD-Hanks100×的儲藏液，-20℃保存。留意由于兩性霉素非水溶性，儲藏液是渾濁的，稀釋使用時可恢復澄清。〔3〕G418：G418neo1G4181mL1MHEPES10mL，過濾消毒，4℃保存?！?〕潮霉素：用于轉染帶有hyg基因的載體質粒后陽性克隆的篩選。購置的潮霉素B原液為14.82mg/mL2615mg/mL，4℃保存。消化液：Versen：即EDTA溶液，對細胞有肯定的離解作用，并且毒性小，價格低廉，使用便利。配1000mLD-Hanks0.2gEDTA，高壓滅菌即可，4℃儲存?zhèn)溆?。胰蛋白酶溶液〔Trypsi：胰蛋白酶主要來自?；蜇i的胰臟，是一種黃白色粉末，易潮解，應放置冷暗枯燥處保存，本試驗室保存于-200.25克置燒杯中，先用少100mL，NaHCO3pH至7.244℃儲存?zhèn)溆?。其主要作用是使細胞相互離散。胰蛋白酶對細胞的分別作用與細胞的類型和細胞的特征有親熱的關系，不同的細胞系對胰蛋白酶溶液的濃度、溫度和作用時間等的要求也不一樣。一般來講，濃度大、溫度高、作用時間越長，對細胞的分別力量也越大，但超過肯定的限度也會損傷細胞。對不同的細胞系要進展梯度嘗試。培育基：細胞在體外的生存環(huán)境是人工模擬的，除需無菌、溫度、空氣等條件外，最主要的是培育基。它是供給細胞養(yǎng)分和保證細胞生長增殖的物質，細胞生長在培育基中，故培育基也是細胞的生存環(huán)境。培育基的種類很多，按其性質狀態(tài)，分半固體培育基〔如軟瓊脂培育基〕和液體培育基。液體培育基是最主要的，按其來源，則分自然培育基和合GIBCOHyClone配置〔1〕DMEM：哺乳動物細胞培育基，每包干粉可以配置1950mL3.7gNaHCO3pH到7〔用1NNaOH或1NHCl，邊攪拌邊參加，直至適宜的pH值，加蒸餾水補充體積到1〔1mL〕25mL37℃恒溫箱中放置一星期，其余4℃保存。確定37℃中的培育基未長菌后，保存的培育基才可以使用。〔2〕RPMI1640：1950mL2gNaHCO3pH7.0〔1NNaOH1NHCl，pH1〔約1mL〕置25mL培育瓶中，將培育瓶在37℃恒溫箱中放置一星期，其余4℃保存。確定37℃中的培育基未長菌后，保存的培育基才可以使用?！?〕Grace”s：1950mL3.3g3.3gpH6.0(用1NNaOH或1NHCl，邊攪拌邊參加，直至適宜的pH值，加蒸餾水補充體積到1升，過濾除菌，取出小量〔約1mL〕25mL培育瓶中，將培育瓶在37℃恒溫箱中放置一星期，4℃37℃中的培育基未長菌后，保存的培育基才可以使用。使用配置完全培育基合成培育基〔無血清培育基，serumfreemedium，SFM〕使用前應參加血清，以供給足夠的養(yǎng)分。細胞培育用血清常用的有胎牛血清〔fetalbovineserum,FBS〕和小牛血清(calfserum/bovineserum,CS/BS)，假設針對培育細胞的物種來源選擇同種動物的血清對細胞更有利，但由于價格、個體差異、易污染等緣由而不行能。使用進口的胎牛血清可以保證無支原體的污染，且小牛血清中可能含有哺乳后生物活性物質的污染，質量不如胎牛血清，因此本試驗室目前根本上使用胎牛血清。參加血清的濃度依試驗要5%-20%10%的，為掌握細胞的生長速度，可以降低血清的濃度到5%，細胞生長狀況不佳時可以將血清濃度提高到15%，20%血清濃度的培育基一般只在轉染時使用。菌，可以不加抗生素，不過在當前試驗條件下還是提倡參加抗生素),參加抗生素的比例1:100，100mL1mL100×)。一般一次配置適量的完全培育基(50-100mL)，以減小和避開由可能發(fā)生的污染而引起的損失。附注：常用抗生素用量和效應抗生素使用濃度作用對象G100U/ml革蘭氏陽性菌鏈霉素100μg/ml革蘭氏陰性菌B3μg/ml局部革蘭氏陽性菌、霉菌完全培育基配方〔50mL，10%血清：無血清培育基 45mL血清 5mL青霉素G+鏈霉素 0.5ml兩性霉素B 0.5ml配制前先取出-20℃56℃30min〔熱滅〕化凍后再開紫外燈滅菌，做操作前的預備工作。血清和培育基應避開紫外線的過多照耀，以免輻射造成成分的轉變。配制時取一較大容積的無菌燒杯，先倒入約一半體積的無血清培育基，參加足量4℃保存?zhèn)溆?。培育基的選擇不同的細胞系有各自最適合的培育基，選擇培育基可通過閱歷和試驗來確定。本試驗室常用的特定細胞的培育基細胞系 培育基Hela RPMI1640DMEMHepG2 DMEMJC RPMI1640NIH3T3 DMEMCHO RPMI1640對于不生疏的細胞系，可以用不同的培育基同時進展培育，看哪種最適于細胞的生長。最終固定下來。三．培育操作根本要求1．：防止污染是打算培育是否成功的首要條件，由于體外培育細胞缺乏抗感染力量，故在安全牢靠。培育前預備：操作開頭前應清點所需的全部用品，并放置于操作場地，然后進展消毒，一方面可以的時機。操作前翻開紫外燈對操作野進展消毒。用3030分鐘以上，但時間置，否則物品相互遮擋射線，會降低消毒效果。利用超凈工作臺操作時，由于整個前臂要伸入臺內，可先清洗手部和肘部，再以75%酒精棉球擦拭消毒，然后進展操作。假設在無菌室內進展操作，要穿消毒的衣帽，戴口罩和手套進展。在無菌環(huán)境進展培育或做其他無菌操作時，首先要點燃酒精燈，以后一切操作，如安裝吸管帽、啟開或封閉瓶口等，都需經過火焰燒灼進展。留意：燒灼不行過頭，以免消滅碳化、變形等現象，玻璃用品可燒灼2-3分鐘，塑料用96%的不含雜質的酒精。培育操作：進展培育操作時，動作要準確快速，但又不必太快，以防空氣流淌增加污染時機。盡量不要用手觸及已消毒的器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒觸及部，或取性，一般先將D-Hanks、Versen等倒入小燒杯中，再取細胞培育瓶以燒杯中的液體進展操作，用過后馬上蓋上。吸取不同的液體要使用不同的吸管，不能混用，以防擴大污染或面發(fā)生污染。操作后整理操作完畢后應清理超凈臺，將臺面上剩余的液體擦干，廢棄物取出，培育基、胰酶等放回1/3凈臺、培育間開紫外燈滅菌半小時以削減污染。四．復蘇細胞的凍存和復蘇要遵循慢凍快融的原則，即冷凍的速度慢而溶解的速度快，以避開冰晶的形成損壞細胞。預備較干凈的熱水浴〔自來水或蒸餾水，水溫37℃-42℃。復蘇哺乳動物細胞選擇42℃37400ml3/4插入溫度計，以便隨時觀看水溫。在電爐上將水燒至適宜的溫度〔可略高一、兩度，以防降溫，再移至液氮罐旁。確定所需復蘇的細胞在凍存盒中的位置，快速取出投入熱水浴中，反復搖動細胞凍存管使〔戴手套操作以防凍傷〕翻開液氮罐取出裝有凍存盒的支架的動作要慢，支架向液氮罐內傾斜，使掛在支架上的液氮流回液氮罐，削減鋪張。但應盡量削減凍存盒在空氣中暴露的時間，以削減溫度的變化。取出熱水浴中的凍存管，以酒精棉球消毒外部。在無菌環(huán)境下吸出凍存管中的液體移入預備4mL50mL12小時后大局部細胞都已貼壁，傾倒去舊的培育基〔含有DMSO，會影響細胞生長5mL五．換液細胞在生長的過程中會消耗培育基中的養(yǎng)分成分并把代謝產物釋放到培育基中去。呼吸放出的二氧化碳將使培育基變黃，假設細胞數量尚未到達傳代的程度〔鋪滿70%以上的培育瓶底可傳代，這時必需進展換液。倒出舊的培育基，換上等量培育基即可。以免濺起其它廢液造成污染。六．細胞傳代細胞生長至貼滿90%〔一般三到四天乃至死亡〔細胞變圓、收縮，細胞內顆粒明顯，細胞貼壁不牢，培育基顏色變黃等。為保證細胞的狀態(tài)良好，可以在細胞生長到對數生長中期，即70%滿瓶時就進展傳代。(1)觀看：當觀看到細胞生長到對數生長中期，70-80%滿瓶，同時細胞狀態(tài)良好時即可傳代。留意在進入細胞間觀看前，至少要開半小時的紫外，但時間也不行過長，以免臭氧通過換氣進入培育箱影響細胞生長。進入前，須先清洗干凈手部和肘部，再以75%酒精棉球擦拭消毒后(不得偷懶)再進展觀看。*CO2

培育箱時，要動作快速準確，以免CO2

泄漏過多。取出培育瓶時，不要遺忘要快速擰緊培育瓶蓋。*在顯微鏡下觀看時，為了要觀看貼壁細胞，必需將培育瓶倒置，在倒置時要留意動作不要過大，留神盡量不要讓培育基流到瓶口部位。*CO2

培育箱時，不要遺忘將瓶口擰松后再放回。預備：在觀看完細胞后，假設打算要做傳代，則要將傳代所需要的培育基、胰酶等從冰箱取出放于培育間內待用，并需留意在超凈工作臺內是否有足量的D-Hanks、Versen液，如不夠也必需從冰箱中取出儲藏液預備補加，取出后也先置于培育間內待用。細胞間及超凈工作臺紫外照耀至少半小時。傳代:在進入細胞培育間進展操作前，請務必按前面所寫的要求進展消毒處理。同時為了您的安康也請別遺忘，在進入細胞間內操作時要關了紫外燈再進去。*留意在消毒了雙手和肘部進入細胞操作間之后，請勿再接觸其它未消毒的物品。*在關閉超凈工作臺的紫外，翻開有機玻璃擋板后，請先點燃酒精燈再做其它操作。從筒中用止血鉗取出一枝滅菌過的玻璃吹管，先將吸頭部位在火上燒灼，再套上橡皮膠頭，之后再將玻璃吹管的其它局部在火上過幾遍，尤其是手曾接觸過的局部。消毒后先放置一旁待用。200uL200uL的槍頭，置于一旁待用〔用于一會吸取胰酶。CO2

培育箱，在超凈工作臺內將舊培育基倒入廢液缸，先倒入適量〔約4ml〕D-Hank`s液洗一下，再倒去D-Hank`s液，參加適量〔約1.5ml〕Versen液，假設需用胰酶消化，則可再用槍參加200uL胰酶，輕輕混勻后，平置消化。最好記時，一般五分鐘左右即適宜。當細胞形態(tài)收縮趨圓，細胞間隙擴大，細胞相互分別時即可終止消化。將消化液留神倒入廢液缸，再參加適量的培育基，用吹管留神將細胞從壁上吹下，并吹勻后再進展分裝一般可一瓶細胞可傳為二或三瓶)，分裝好的各瓶要補足培育基，再取滅菌后的蓋子蓋嚴，放回CO2

培育箱，固然在放入前要將蓋子擰松。對于半貼壁細胞，如H9101，不必使用消化液，D-Hanks沖洗一遍后，直接參加培育基，以吹管將細胞從壁上吹下，吹勻、分裝即可。昆蟲細胞 SF9也是半貼壁細胞，傳代時只需傾去舊的培育基，參加的培育基，以吹管將細胞從壁上吹下，吹勻、分裝即可。收尾:4℃，同時將超凈工作臺和細胞間內整理干凈，假設廢液缸已滿，請將其取出洗凈，滅菌后再放回細胞間內。當操作完從細胞間出來后，最好翻開紫外再消毒一段時間(<0.5hr)。最終別遺忘關紫外燈。七．細胞保種要長期保存某一細胞系，維持其良好的性狀，在進展了15-20次傳代后應準時進展保種，將細胞凍存于液氮中。保種用液可以是完全培育基，也可以是全血清。目前本試驗室一般承受完全培育基保種，SF9用全血清保種較好。為避開冰晶形成損傷細胞，應參加占總體積10%的DMSO?！睤MSO有弱毒性，盡量不要接觸到皮膚〕(1)2-3天的細胞，察，細胞貼壁結實、均勻，折光度小，較透亮，細胞器不明顯，死細胞及其它雜質少。(2)消化：將用于保種的細胞取出CO2培育箱，在超凈工作臺內將舊培育基倒入廢液缸，先倒D-Hank`s液洗一下，再倒去D-Hank`s液，參加適量的Versen液，假設需用胰酶消化，則可再用槍參加200uL胰酶，輕輕混勻后，平置消化。最好記時，一般五分鐘左右即適宜。當細胞形態(tài)收縮趨圓，細胞間隙擴大，細胞相互分別時即可終止消化。將消化液留神〔2ml后，放置一邊。分裝：目前使用的細胞凍存管有1ml、2ml兩種規(guī)格，已經過輻照滅菌，密封包裝，存放于培育間內。用時將止血鉗過火滅菌，從外包裝袋中取出所需數量的凍存管，用手捏住凍存管的下部，以止血鉗翻開管蓋，蓋里朝上置于臺面上，并將凍存管直立于臺面上，酒精燈四周。將已經消化下的細胞再次吹吸混勻，吸滿一吹管后逐滴滴入敞口的凍存管內，同時記數。以一滴液體50μl記，1.5ml的凍存管內應滴入18滴細胞懸液，2ml凍存管內應滴入36滴細胞懸液。取200μl加樣器，吸取DMSO再次參加凍存管內，1.5ml的凍存管內應參加100μlDMSO，2ml凍存管內應參加200μlDMSO；也可用吹管吸取DMSO，逐滴滴入凍存管內，1.5ml的凍存管內滴入2滴DMSO，2ml4滴DMSO，使DMSO的終濃度到達10%。1~2次，使液體混〔〕凍存將處理好的凍存管置于-20存盒中置于液氮液相中長期凍存。存放液氮氣相時可以用紗布制作一小布袋，內放凍存管，袋口栓上細繩，垂放入液氮罐中，當袋底部接觸液氮液相時，會發(fā)出較大的液體飛濺的聲音，這時將布袋略提高一點就是適宜的存放位置。將凍存管轉移到凍存盒中的動作要快，以免操作中溫度上升。但翻開液氮罐取出裝有凍存盒的支架的動作要慢，支架向液氮罐內傾斜，使掛在支架上的液氮流回液氮罐，削減鋪張?？梢詢扇藚f(xié)作操作，先翻開凍存盒，再快速取出布袋內的凍存管放入盒內。記清所存放的細胞的準確位置，凍存后記錄清楚〔細胞種類、存放液體、凍存時間，保存人〕以備日后查尋。戴手套操作以防凍傷。八．哺乳動物細胞轉染細胞在培育基中生長至鋪滿70％細胞培育瓶底。D-Hanks洗一次，再用Versen5min。Versen3mL完全培育基終止反響，用吹管吹打細胞使之懸浮，吸15μl〔細胞數/mL原液＝計數板上4角大格細胞總數/4×10000×稀釋倍數〕依據細胞濃度吸取10－20萬細胞至六孔板〔φ＝35mm〕中，每孔加完全培育基補2mL。37℃，5％CO培育箱培育24hr。2混勻脂質體和待轉染的質粒〔每孔細胞按以下量加樣〕solutionA:吸取大提質粒2μg〔加TE補至總體積400μl40μl41000μl無水乙醇，混勻，液氮中放3min，12023rpm離心10min將上清傾干，沉淀在超凈工作臺內吹干，以100μl無血清培育基溶解。solutionB: lipofectAMINE2－25μl，加無血清培育基補至100μl。solutionA，B，在室溫下放置15－45min。吸去六孔板中的培育基，以2mL無血清培育基洗滌細胞一次。往solutionA，B混合液中參加800μl無血清培育基，混勻，加于六孔板的裸細胞上，37℃CO培育箱25hr。往各孔中參加含正常量2倍血清的培育基〔不加抗生素〕。在開頭轉染后18－24hr，吸去六孔板中的混合液，參加2mL完全培育基培育。轉染48小時后觀看并檢測培育上清。SF9轉染細胞在培育基中生長至鋪滿70％細胞培育瓶底。傾去舊培育基，參加約3mL完全培育基，用吹管吹打細胞使之懸浮，吸15μl至細〔細胞數/mL原液＝計數板上4/4×10000×稀釋倍數〕依據細胞濃度吸取10－20萬細胞至六孔板〔φ＝35mm〕中，每孔加完全培育基補2mL。27℃恒溫箱中培育2~6小時?；靹蛑|體和待轉染的質?！裁靠准毎匆韵铝考訕印硈olutionA: 吸取bacmid2μg加無血清培育基補充到100μl。solutionB: 吸取Cellfectine2－25μl，加無血清培育基補至100μl。solutionA，B，在室溫下放置15－45min〔一般選擇30min〕吸去六孔板中的培育基，以2mL無血清培育基洗滌細胞一次。往solutionA，B混合液中參加800μl無血清培育基，混勻，加于六孔板的裸細胞上，27℃恒溫箱中孵5小時。吸去六孔板中的混合液，參加2mL完全培育基培育。⑺轉染18小時后觀看并檢測培育上清?！?〕轉染72細胞碎片等雜質，可以2023轉離心2分鐘，無菌狀態(tài)下吸取上清，4℃避光保存。附1：Bacmid將轉移質粒轉化TSS致敏緩沖液制備的E.coliDH10Bac感受態(tài)細胞，該細胞含有穿梭質粒Bacmid和關心質粒，關心質?？梢詭椭D移質粒pFB載體上轉座子內側的外源基因轉移到Bacmid8μl質粒參加到100μl30min，再往轉化管中參加900μlLB〔留意不要做熱休克〕，37℃100rpm/min搖培4h后轉移質粒在Bacmid的LacZ編碼區(qū)，并使DH10Bac獲得慶大霉素抗性。將搖培后的菌液倍比稀釋〔1：10〕，各取200μl均勻涂布在含有X-galIPTG、慶大霉素、卡那霉素和四環(huán)素的LB平板上，37℃倒置培育24hr以上，觀看菌落的密度和白色菌落的數量，選擇一個平板上均勻長有200多個菌落的，以無菌牙簽挑取白色的單菌落，挑入含三種同樣抗性的液體LB培育基中，37℃震蕩培育過夜，堿法小量提取重組病毒DNA〔bacmid〕。收集3ml菌液中的菌體，按堿法小量提取質粒的步驟參加溶液一、二、三，但將用量分別提高到200μl、400μl和300μl。冰水浴5min后12023rpm離心10min，吸取上清，用等體積氯仿抽提二次，留意參加氯仿后不行用力震蕩，蓋緊管蓋后反復輕柔顛倒，直至水相和有機相〔有時還會消滅白色的蛋白抽提物eppendorf4℃放置10min，12023rpm離心10min，沉淀即bacmid。70%乙醇洗滌沉淀一次，用移液器盡量吸干管內附著的液體，放開eppendorf管，在超凈臺內吹干〔約需半小時〕，參加40μl無菌TE或水，65℃放置10min使之溶解完全，可用于轉染。留意，提取的bacmid4℃-20℃保存的bacmid在凍融后簡潔斷裂，影響轉染效率，因此不宜在-20℃保存。附2：DH10Bac選擇培育基抗生素含量50μg/ml kanamycin〔卡那霉素〕7μg/ml Gentamicin〔慶大霉素〕10μg/ml Tetracycline〔四環(huán)素〕100μg/mlX-gal&40μg/ml為了節(jié)約X-gal和IPTG的用量，在鋪固體培育基平板時不參加這兩種物質，而是在涂布平板前半小時，以200μlLB培育基稀釋40μlX-gal〔母液濃度100μg/ml〕和6.7μlIPTG〔母液濃度500μg/ml〕，37℃恒溫箱，待溶液被吸取后，再涂布轉化的菌液。細胞計數用血球計數板做細胞計數〔見圖〕。依據狀況用養(yǎng)分液稀釋與否均可，如先稀釋，計算時20μl細胞懸液，從計數板邊緣輕輕滴入，使懸液自由布滿蓋玻片下方間隙，勿留氣泡。蓋玻片與血球計數板之間大約可容納10μl的液體，多余的會自動流出蓋玻片外。稍候片刻，顯微鏡下觀看并計算出四角大格內的細胞數〔圖中藍色的局部〕；壓線者只計上線和右線的細胞，然后按下式計算出細胞濃度：〔四大格中細胞總數/4〕×10000×稀釋倍數=細胞數/毫升原液留意：1〕細胞懸浮后應用吹管輕輕反復吹打片刻，以使細胞充分散開，如計算時仍見有團塊，應按單個細胞計算,如細胞團數占10%以上，說明消化不充分，或細胞數少于200個/10平方毫米或多于500個/10平方毫米時，均說明稀釋不當，需重制備細胞懸液，再重計數；2〕取樣前仍需用吹管稍吹打，以防細胞沉降，另外向計數板滴入懸液量不能過多，致使蓋玻片漂移；或過少易有氣泡?！?.0mm|←1.0mm→←1.0mm→||←1.0mm→|1.0mm→←1.0mm|→深0.1mm |血球計數板十．軟瓊脂試驗〔soft-agarcolony〕細胞和惡性細胞卻無大影響。瓊脂的這種選擇性作用，一是很多細胞難以貼附，二是其中含有抑制的多聚陰離子，不利正常的細胞生長。瓊脂經降低毒性處理，特別是削減多聚陰離子后的產物即為瓊脂糖〔Agarose〕。瓊脂糖可用作克隆不能在瓊脂中生長〔因毒性〕的貼附依靠性細胞。試驗證明，惡變細胞或惡性轉化細胞在軟瓊脂〔1.2%〕中的生長與在裸鼠體上的致瘤性有很大的全都性。因此測試細胞能否在軟瓊脂中生長，已成為測試轉化細胞惡性性的重要指標，用以測定轉化后的克隆形成率。具體做法如下：試劑及材料的預備：5×培育基：取一包培育基干粉〔1000ml用量〕以200ml雙蒸水溶解，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃儲存?zhèn)溆?。瓊脂糖溶液：在兩個100ml鹽水瓶中以雙蒸水分別配置兩種濃度的瓊脂糖溶液，鋁鉑封口，再分別放入兩個盛有一半水的大燒杯中，報紙封口，扎緊后高壓滅菌，隨后馬上放入45℃水浴中，保持其液體狀態(tài)。a.0.72%agar0.25gagar+34.5mlddH2Ob.0.5%agar0.15gagar+29.5mlddH2O5mleppendorf管，1ml、200μl槍頭。操作步驟：在5mleppondorf管中混勻1ml 5×培育基〔37℃預熱〕500μl 血清3.5ml0.72%agar〔45℃預熱〕50μl 100×抗生素馬上參加35mm平皿中，每皿1ml，凝固后成為下層基質。在5mleppondorf管中混勻1ml 5×培育基〔37℃預熱〕500μl 血清3ml0.5% agar〔45℃預熱〕臨時置于37℃。將待檢測的細胞消化下來，計數，調整濃度到略大于100萬個/毫升，取500μl與B液混勻，以每皿1ml的量參加到已鋪有A瓊脂層的平皿中，室溫下待其凝固。平皿放置于二氧化碳培育箱內培育2Gimsa染色，拍照。大于10個細胞的集落算做一個克隆，依據克隆的數量確定細胞惡性轉化的效率。十一．細胞單克隆的分別哺乳動物細胞單克隆株分別：72hrVerson50mL玻璃培育瓶中培育，待細胞生長至根本貼壁時再參加含作用濃度為400ug/mLG4182～3G4182～3將已形成細胞克隆的培育瓶置于顯微鏡下，觀看克隆的位置，并用記號筆將其標出。(3)Verson5～20s后取出在加有完全培育基(600uL/孔)的24孔板中刷洗數次，將附著上的細胞洗下。245%CO37℃進展培育。22480ELISA測。將經檢測可表達目的基因的細胞克隆轉入50mL螺口培育瓶中連續(xù)培育，并在適當的時候進展傳代換液，擴增細胞，進展進一步的鑒定。淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術一、細胞融合前預備(一)免疫方案選擇適宜的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb前兩個月左右確立免疫方案開頭初次免疫，免疫方案應依據抗原的特性不同而定。顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:初次免疫 1×10７／0.5mlip(腹腔內注射)↓2～3其次次免疫 1×10７／0.5mlip↓3加強免疫(融合前三天)1×10７／0.5mlip或iv(↓取脾融合可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上集中呈小滴狀說明已到達油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。初次免疫 Ag1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射│ 0.8～1ml0.2ml／點)↓3其次次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip│ (ip0.5ml)↓3第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ip│(5～7↓2～3加強免疫，劑量50～500μg，ip或iv取脾融合目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖黾恿丝乖拿庖咴?，另一方面可降低抗原的使用量。②轉變抗原注入的途徑，根底免疫可直接承受脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，促進免疫細胞對抗原反響性。(二)飼養(yǎng)細胞在制備單克隆抗體過程中，很多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培育過程中，參加飼養(yǎng)細胞是格外必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，小鼠腹腔巨噬細胞的制備小鼠承受與免疫小鼠一樣的品系，常用BaLb／c14-16↓拉頸處死浸泡于753～5↓用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜↓用無菌注射器注入6～8ml↓反復沖洗，吸出沖洗液↓10ml，12005～6↓20％小牛血清(NCS)(FCS)1×10５／ml↓96，100μl／孔↓37℃CO2

孵箱培育一般飼養(yǎng)細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細胞.(三)骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞系應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內產生大量 McAb。SP20、NS1X63Ag8.653等。骨髓瘤細胞的培育適合于一般的培育液，如DMEM培育基。小牛血清的濃度一般在10～20％，細胞的最大密度不得超10６／ml1∶103～5倍增時間為16～20小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或稍微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。一般在預備融合前的兩周就應開頭復蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT性，每3～6月應用8～AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細胞的突變。保證骨髓瘤細胞處于對數生長期，良好的形態(tài)，活細胞計數高于95％，也是打算細胞融合的關鍵。(四)免疫脾細胞免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培育液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細胞數為２×10８左右。(一)細胞融合流程取對數生長的骨髓瘤細胞SP20，1000rpm5細胞后計數，取所需的細胞數，用不完全培育液洗滌2同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培育液洗滌2將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶101∶550ml1，1200rpm,8分鐘。棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。在室溫下融合:①301ml45％PEG(SIGMA,1500),90120PEG1ml2ml3ml4ml，5ml10ml離心，800rpm，66ml20DMEM在一起的細胞散開。9610ml96將融合后細胞懸液參加含有飼養(yǎng)細胞的96100μl／孔，37℃、5％CO孵箱培育。2961×107脾細胞。(二)HAT24HAT選擇培育液。HT和HAT50×貯存，用時1ml50ml20200μl／孔。所以在加選擇培育液時應加3倍量的HAT2／350×HATH:5×10-3MA:2×10-5MT:8×10-4MHATHT液。篩選雜交瘤細胞通過選擇性培育而獲得雜交細胞系中，僅少數能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1／10瘤細胞系。檢測抗體的方法應依據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有:ELISAMcAbRIAMcAbFACS(McAbIFAMcAb牢靠的篩選方法必需在融合前建立，避開由于方法不當貽誤整個篩選時機?？寺』话闶侵笇⒖贵w陽性孔進展克隆化。犚rHAT個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進展克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，由于抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞喪失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體喪失，從而喪失產生抗體的力量。(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。有限稀釋法的程序①制備飼養(yǎng)細胞懸液(同融合前預備)②陽性孔細胞的計數，并調細胞數在1～5×10３／ml③取1306.5ml20ml，100μl／孔加AB、C22.9ml2.9ml含飼養(yǎng)細胞的完全培育液,細胞數為10個／ml，100μl／孔加D、E、F12.2ml2.2ml細胞的完全培育液，細胞數5／ml，100μl／孔，加G、H0.54～5200μl／孔。8～9注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培育液中加HT。軟瓊脂法①軟瓊脂的配制20％FCS(2DMEM1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。0.5111202DMEM42℃保溫。②用上述0.5)15ml9cm后作為基底層備用。100／ml，500／ml5000／ml④1ml0.5(42℃1ml⑤混勻后馬上傾注于瓊脂基底層上，在室溫中1037℃，5％CO2孵箱中。⑥4～57～1024培育。⑦檢測抗體，擴大培育，必要時再克隆化。(二)雜交瘤細胞的凍存準時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是格外重要的。由于在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培育過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體力量的喪失等等。假設沒有原始細胞的凍存，則由于上述的意外而全功盡棄。雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以24一孔就可以凍一支安瓿。細胞凍存液:50％小