課件教程案例

項(xiàng)目背 項(xiàng)目方 項(xiàng)目路 樣品要 實(shí)驗(yàn)流程 羥甲基化文庫構(gòu) 方 生物信息分 分析流程 數(shù)據(jù)質(zhì) 案 參考文 項(xiàng)目背羥甲基化5hmC是新發(fā)現(xiàn)的一種的修飾堿基，由1011易位（TET)的酶通過氧化5mC產(chǎn)生的。5hmC作為DNA去甲基化過程的中間產(chǎn)物不僅參與了調(diào)節(jié)DNA甲基化水平的作用，另外的研究發(fā)現(xiàn)5hm具有重要的調(diào)節(jié)功能。5hm能夠降低MeCP蛋白的甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)與甲基化DNA的親和性，具有潛在的參與表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。另外，hmC不僅參與了胚胎發(fā)育重編程過程，還與腫瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。晶能提供了兩種不同的研究在全組層面來來檢測5hm：hMeDIP-Seq和TA-q技術(shù)優(yōu)勢：hMeDIP-TAB-項(xiàng)目方項(xiàng)目路線樣品要求樣品濃度：最低濃度不低于50ng/μl樣品總量：每個樣品總量不少于3μg樣品：DNA低溫（-20℃）；且在過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污實(shí)驗(yàn)流程圖羥甲基化文庫構(gòu)建方平臺：Illumina原理：IlluminaHiSeq2500邊合成邊原對客戶提供的DNA樣品進(jìn)行檢測定量，檢測格后進(jìn)行文庫，利用llminaiSeq2500進(jìn)行上機(jī)。Hiq2500系統(tǒng)的基本反應(yīng)原理是通過橋式PCR來擴(kuò)增模板片段，在橋式PCR反應(yīng)中，正向引物和反向引物都被通過一個柔性接頭flexiblelinkr）固定在固相載體（olid ub-trt）上，經(jīng)過P反應(yīng)，所有的模板擴(kuò)增產(chǎn)物就都被固定到了上固定的位置。在每一輪循環(huán)中，標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的四種核苷酸以及DNA聚合酶同時加入流通池通道中，按照堿基互補(bǔ)配對的原則進(jìn)行DNA鏈的延伸，且單次反應(yīng)只能加入一個堿基，經(jīng)過掃描，該次反應(yīng)顏色后，該保護(hù)基團(tuán)被除去，下一個反應(yīng)可繼續(xù)進(jìn)行，如此反復(fù)，得出堿基的精確序列（如下圖）。3.1數(shù)據(jù)質(zhì)控3.3序列與參考組比對以及分布特hMeDIP-hMeDIP-seq數(shù)據(jù)全組序列匹配與組分布統(tǒng)計分Peak的與組定位注釋分析TAB-C堿基有效深度和覆蓋度分析差異羥甲基化區(qū)域分析差異羥甲基化區(qū)域相關(guān)的pathway分DNA羥甲基化與轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析案LianCG,XuY,CeolC,etal.Lossof5-hydroxymethylcytosineisanepigenetichallmarkofmelanoma[J].Cell,2012,150(6):1135-1146.背景目的分析結(jié)果:Melanoma中，5-mC沒有顯著改變，5-hmC對5-hmC水平減低的位點(diǎn)進(jìn)行注釋后進(jìn)行pathway分析，發(fā)現(xiàn)這群集主要與各種相參考文LianCG,XuY,CeolC,etal.Lossof5-hydroxymet