染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)

《染色體工程》主講：宋濤生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室什么是染色體工程？染色體工程（chromosomeengineering）是人們按照一定的設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地消減、添加或代換同種或異種染色體，從而達(dá)到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術(shù)。廣義上講它還應(yīng)包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)，因此也稱為染色體操作。染色體工程包括植物染色體工程、動(dòng)物染色體工程、人工染色體。從兩個(gè)層面展開:1、從細(xì)胞水平誘發(fā)染色體數(shù)目的改變

2、從染色體水平針對染色體本身操作目前對染色體操作的主要方法有：有性雜交、染色體交換、易位、添加、染色體顯微切割和微克隆、PCR擴(kuò)增等。染色體工程的發(fā)展經(jīng)歷天然染色體片段（如染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移）天然染色質(zhì)片段（如染色質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移）DNA重組技術(shù)產(chǎn)物-人工染色體酵母人工染色體（YAC）

細(xì)菌人工染色體（BAC）哺乳類人工染色體（MAC）人工染色體染色體是基因的天然載體。這個(gè)載體上，目的基因與他兩側(cè)的基因或序列是天然的遺傳連鎖，這種天然的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后，可以長時(shí)間存在，對目的基因有強(qiáng)大的保護(hù)作用。提高染色體工程的關(guān)鍵技術(shù)是把著絲點(diǎn)分離與克隆、然后與目的基因重組，并與組蛋白合成一個(gè)染色體片段。

天然染色體片段一、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移McBride和Ozer第一次令人信服地證明純化的染色體片段是對真核細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的理想的和天然的載體。受體細(xì)胞通常缺乏某一基因的正常功能供體細(xì)胞的同源染色體則具有該基因的正常功能已使用的基因有：HPRT、嘧啶激酶基因、乳糖激酶基因、抗甲氨蝶呤（MTX）基因、抗鵝膏覃堿基因染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(CMGT)可把一些緊密連鎖的基因從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞。當(dāng)把分離到的中期染色體同完整細(xì)胞混合時(shí)，供體染色體的一部分可被某些細(xì)胞攝取并加以表達(dá)。如果受體細(xì)胞缺乏該染色體所攜帶的功能性基因，而后者又是該細(xì)胞在選擇性條件下生存所必需的，轉(zhuǎn)移就可得到證實(shí)。因此，在選擇性條件下生存的基因轉(zhuǎn)移克隆，其核內(nèi)一定有必需的供體基因參入，而且必須能表達(dá)其基因產(chǎn)物。被轉(zhuǎn)移的染色體物質(zhì)稱為轉(zhuǎn)移基因組（transgenome），而表達(dá)這些基因的細(xì)胞則稱之為轉(zhuǎn)化株（transformant）。

1、染色體的分離技術(shù)

染色體分離技術(shù)是指通過流式分揀儀分離染色體或者在顯微鏡下對特定染色體或染色體的特定區(qū)段進(jìn)行分離，隨后進(jìn)行DNA體外直接酶切后克隆或者擴(kuò)增（PCR）后克隆，以構(gòu)建特定染色體或染色體特定區(qū)段的DNA文庫的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)結(jié)合的橋梁技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是能夠根據(jù)研究者的需要分離任意一條染色體或染色體的特定片段，快速高效地建立相應(yīng)的DNA文庫。該技術(shù)于1981年首次在果蠅中應(yīng)用獲得成功。

1、染色體的分離技術(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)秋水仙堿處理細(xì)胞使其處于分裂中期低滲處理，加皂苷，破裂細(xì)胞TMS液處理，離心，收集染色體染色體儲存于含20％甘油的TM液中TMS緩沖液：含0.05MTris，3MMgCl2，0.2M蔗糖，pH：7.4秋水仙素可與微管蛋白二聚體結(jié)合，阻止微管蛋白轉(zhuǎn)換，抑制有絲分裂，能破壞紡錘體，使細(xì)胞停止于有絲分裂中期，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。皂苷有使紅細(xì)胞破裂的作用，稱溶血性。微細(xì)胞介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)(MMCT)是一項(xiàng)利用微細(xì)胞將外源染色體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的技術(shù)。該技術(shù)是在細(xì)胞融合的基礎(chǔ)之上發(fā)展起來的，是細(xì)胞融合技術(shù)的進(jìn)一步細(xì)化，在當(dāng)代生物的若干領(lǐng)域里得到廣泛的應(yīng)用。一些腫瘤抑制基因、端粒酶抑制基因、誘導(dǎo)衰老基因以及DNA修復(fù)基因都是通過MMCT技術(shù)取得細(xì)胞內(nèi)識別和定位，由此促進(jìn)了針對這些基因的功能研究，并為相關(guān)疾病的治療提供了依據(jù)。同時(shí)，MMCT技術(shù)也為其他領(lǐng)域如表觀遺傳學(xué)、基因組印跡、哺乳動(dòng)物人工染色體等方面的進(jìn)一步研究提供了有力的手段。2、染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)2、染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)染色體懸液與受體細(xì)胞混合生長于非選擇培養(yǎng)基中持續(xù)3代，加多聚L鳥氨酸可提高染色體進(jìn)入受體細(xì)胞的幾率約3天后移入選擇培養(yǎng)基篩選與鑒定*多聚L鳥氨酸可以改變本來都帶負(fù)電荷的原生質(zhì)體或外源DNA表面電性,使其中之一帶正電荷,從而達(dá)到原生質(zhì)體和外源DNA正負(fù)相吸,并且促進(jìn)外源DNA進(jìn)入到原生質(zhì)體中。非選擇性分離培養(yǎng)基（non-selectiveisolationmedium）：對微生物沒有選擇性抑制的分離培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分齊全，無抑制成分（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）。選擇培養(yǎng)基：是指通過培養(yǎng)混合的微生物，僅得到或篩選出所需要的微生物，其他不需要的種類在這種培養(yǎng)基上是不能生存的。鑒別培養(yǎng)基：是通過化學(xué)試劑顯示出培養(yǎng)基上混合生長的微生物中有某種微生物。3、被轉(zhuǎn)移染色體片段的大小大約15％的染色體受體細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下可見到各種大小的染色體片段。光學(xué)顯微鏡下見到的最小染色體片段是雙微體（1000kb）。*雙微體（doubleminutechromosomes，DMs）是基因擴(kuò)增的主要細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志，是染色體外遺傳單位的一種主要存在形式。大量研究表明，雙微體與基因組不穩(wěn)定、惡性腫瘤、細(xì)胞耐藥及衰老密切相關(guān)。染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的主要作用一是用于染色體內(nèi)的基因作圖二是用于分離或克隆一些特殊的基因雖然DNA序列分析技術(shù)和基因克隆技術(shù)高度發(fā)展的后基因組時(shí)代以上用途顯得無用，但染色體片段作為真核細(xì)胞基因的天然載體，仍是誘人的課題。二、染色質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移染色質(zhì)作為轉(zhuǎn)基因載體的提出染色體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移由于不能控制所轉(zhuǎn)基因的染色體或染色體片段的種類、數(shù)目和大小，故不能有選擇的轉(zhuǎn)移目的基因。1986年李振剛等提出了以染色質(zhì)為介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的工作。用活性模板染色質(zhì)來轉(zhuǎn)移預(yù)期基因（基因群），從而彌補(bǔ)了基因工程的不足。與DNA相比，染色質(zhì)是一種更為天然和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因載體，便于整合，是基因打靶的理想載體?；钚阅０迦旧|(zhì)—在生命活動(dòng)的一定時(shí)空，只有一定數(shù)量的基因表達(dá)，這些正在表達(dá)的基因在染色質(zhì)中的區(qū)域活性基因—這些正在表達(dá)的基因如果從一定組織提取活性染色質(zhì)，就會(huì)得到該組織的全部基因，包括細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄極少次數(shù)的基因。所以，對于真核生物來說，與DNA相比染色質(zhì)片段是一種更為天然和更為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因載體?；钚匀旧|(zhì)作為基因載體的特點(diǎn)

染色質(zhì)工程能選擇性的轉(zhuǎn)移基因，并可在不知道目的基因序列或其探針的情況下進(jìn)行。且可獲得一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)的全部活性基因，可對所有活性基因進(jìn)行克?。ㄈ鏨AC克隆，λ克隆等）?；钚匀旧|(zhì)作為基因載體的鑒定基因的鑒定：用已知基因的染色質(zhì)片段進(jìn)行共制備用所得的活性染色質(zhì)DNA與家蠶染色質(zhì)進(jìn)行染色體原位雜交三、人工染色體染色體作為基因轉(zhuǎn)移的天然載體，可轉(zhuǎn)移連鎖的基因群，故在此基礎(chǔ)上發(fā)展了人工染色體。人工染色體（artificialchromosome）指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。人工染色體為基因組圖譜制作、基因分離以及基因組序列分析提供了有用的工具。

現(xiàn)正在研究的人工染色體有：

*酵母人工染色體（YAC，1000kb）

*細(xì)菌人工染色體（BAC，300kb）

*哺乳類人工染色體（MAC）

P1派生人工染色體（PAC）人類游離人工染色體（HAEC）。三、人工染色體天然染色體基本功能單位包括：

復(fù)制起始點(diǎn)，保證了染色體復(fù)制；

著絲粒保證了染色體分離；

端粒封閉了染色體末端，防止粘附到其他斷裂端，保證了染色體的穩(wěn)定存在。人們?yōu)榱丝寺〈笃蜠NA，利用DNA體外重組技術(shù)分離了天然染色體的基本功能元件并將它們連接起來，從而構(gòu)成了人工染色體。相比于其他復(fù)制子而言，染色體要大得多。原理酵母人工染色體（YAC）是人工染色體中能克隆最大DNA片段的載體，可以插入100-2000kb的外源DNA片段。

YAC是有酵母的自主復(fù)制序列、著絲點(diǎn)、四膜蟲的端粒以及酵母選擇性標(biāo)記組成的酵母線性克隆載體。左臂含有端粒、酵母篩選標(biāo)記Trp1、自主復(fù)制序列ARS和著絲粒，右臂含有酵母篩選標(biāo)記Ura3和端粒，然后在兩臂之間插入大片段DNA構(gòu)成的。

YAC載體基本序列元件：

酵母染色體DNA自主復(fù)制順序（ARS）：

負(fù)責(zé)DNA復(fù)制酵母染色體的著絲粒順序（CEN）：

保證酵母細(xì)胞分裂時(shí)染色體的分配酵母染色體的端粒順序（TEL）：

維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（兩端各一個(gè)）

選擇標(biāo)記：用于重組克隆的篩選

pYAC4是一個(gè)大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，含有Amp大腸桿菌篩選標(biāo)記ARS：autonomouslyreplicatingsequenceYAC克隆系統(tǒng)的特點(diǎn):

YAC作為可提供大片段DNA的方法，簡化了構(gòu)建染色體延伸區(qū)域圖譜和分離完整基因的過程（200～500kb，甚至1000kb）用酵母為宿主重新構(gòu)建大的人類基因區(qū)段，可將小的重疊的YAC變成一個(gè)大的YAC。

酵母作為一種真核生物，為其它真核的DNA提供了更合適的環(huán)境。YAC構(gòu)建示意圖完整的染色體DNA的提取基因組DNA酶切大片段的獲取YAC載體臂的制備YAC臂與目的DNA大片段的連接YAC基因庫的保存YAC基因庫的鑒定目的基因YAC克隆的篩選目的基因YAC克隆的鑒定YAC克隆技術(shù)簡介

YAC的主要用途是：(1)YAC克隆重疊群是物理圖譜的主要框架。它不僅可容納大片段的外源DNA，而且在構(gòu)建基因組文庫時(shí)需要較少的克隆。

YAC的主要用途是：(2)用YAC克隆構(gòu)建的物理圖譜在復(fù)雜的生物基因組分析和DNA測序中發(fā)揮著重要作用。目前，用YAC提供大片段DNA構(gòu)建染色體圖譜的技術(shù)已在人類、植物、昆蟲、鳥類、兩棲類等動(dòng)物中得到廣泛應(yīng)用，相比于早期的DNA片段載體，YAC是容納大片段外源DNA的首選載體。YAC的主要用途是：(3)在基因功能研究中，基因嵌入及轉(zhuǎn)基因技術(shù)都采用了YAC克隆系統(tǒng)。通過YAC嵌入的基因不僅片段長，而且嵌入的基因更適于體內(nèi)表達(dá)，并有利于基因保持其固有的空間構(gòu)象和功能的發(fā)揮。YAC的缺點(diǎn)：1.插入片段大，穩(wěn)定性較差，不易操作2.插入的大片段常發(fā)生缺失，使文庫不完整3.YAC與酵母天然染色體分子結(jié)構(gòu)相似分離時(shí)難與天然染色體分開4.文庫中的嵌合現(xiàn)象嚴(yán)重5.因插入片段大。往往發(fā)生序列重排，造成序列錯(cuò)亂。四、細(xì)菌人工染色體（BAC）1992年Shizuya利用F因子的復(fù)制點(diǎn)和氯霉素抗性標(biāo)記基因，在F質(zhì)粒（pMBO131）基礎(chǔ)上構(gòu)建了第一代BAC人工染色體。BAC是以大腸桿菌的F因子的重要位點(diǎn)及基因?yàn)橹黧w的高容量的人工載體。（可克隆350kb，在重組缺陷型（REC—）宿主菌只有1個(gè)拷貝）F因子又稱致育因子，是一個(gè)100kb的質(zhì)粒，能整合到宿主染色體中，并能高頻率的轉(zhuǎn)移遺傳標(biāo)記。因低拷貝特性使其重排和嵌合程度低。且F因子呈閉環(huán)結(jié)構(gòu)，可以用常規(guī)技術(shù)從大腸桿菌中分離。1、BAC載體的結(jié)構(gòu)

新一代BAC載體為7.4kb的還狀質(zhì)粒，主要結(jié)構(gòu)有：F因子的parA，parB，parC基因保證低拷貝的BAC質(zhì)粒在大腸桿菌分裂時(shí)均勻分配到子代細(xì)胞。起始o(jì)riS基因，嚴(yán)密控制，決定低拷貝和起始解旋酶基因－repC，易于DNA復(fù)制和決定復(fù)制方向選擇標(biāo)志基因Cmr

氯霉素抗性基因lacZ基因

顏色鑒別重組子，外源基因插入其中l(wèi)oxP和cosN位點(diǎn)

易于克隆DNA回收和造作2、BAC基因