第3章 滅菌技術(shù)問題

第三章

滅菌技術(shù)問題本章主要內(nèi)容滅菌原理與技術(shù)簡介培養(yǎng)基制備與滅菌空氣滅菌流程與設(shè)備反應(yīng)器相關(guān)滅菌技術(shù)生化反應(yīng)過程多為純培養(yǎng)過程，必需對生產(chǎn)的過程進行滅菌處理，其實質(zhì)是對有害微生物的控制和消除。第一節(jié)滅菌原理與技術(shù)簡介第一節(jié)滅菌原理與技術(shù)簡介消毒(disinfection)：殺死或消除物體上的病原微生物的方法滅菌（sterilition）：殺死物體上全部微生物的方法防腐(antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生長的方法幾個基本概念化療(chemotherapy)：利用對病源菌具有高度毒力而對宿主基本無毒的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病源微生物的生長繁殖控制微生物的物理因素高溫滅菌輻射作用高滲作用干燥超聲波控制微生物的化學(xué)因素表面消毒劑化學(xué)治療劑高溫滅菌多數(shù)細菌，酵母菌和霉菌的營養(yǎng)細胞和病毒在50-65oＣ10min可以致死。一般噬菌體65－80oＣ致死；放線菌、霉菌的孢子比營養(yǎng)細胞抗熱性強，76－80oＣ10min可以殺死；細菌芽孢，在100oＣ下５－20min才能致死；同種微生物老齡菌比幼菌耐熱。滅菌方法：

濕熱滅菌（mosistheatsterilization）

干熱滅菌（dryheatsterilization）該法比干熱滅菌效果好，因為蛋白質(zhì)在有水的情況下容易凝固，如含水50％，蛋白質(zhì)凝固溫度為56oＣ；含水６％蛋白質(zhì)凝固溫度為160-170oＣ濕熱滅菌(mosistheatsterilization)煮沸滅菌法（煮沸消毒法）高壓蒸汽滅菌法巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）高壓蒸汽滅菌是濕熱滅中最好方法，通常在1.05kg/cm2,的壓力下面（此時溫度121oＣ）處理15－30min。實驗室中是培養(yǎng)基滅菌的最常用方法。工業(yè)中利用飽和蒸汽進行培養(yǎng)基和設(shè)備、管道等的滅菌。就是直接用高溫蒸汽滅菌。蒸汽在冷凝時釋放出大量潛能，蒸汽具有強大穿透力，蒸汽的濕熱破壞菌體蛋白質(zhì)和核酸的化學(xué)鍵，使酶失活，微生物因代謝障而死亡。低溫維持法高溫瞬時滅菌巴氏消毒法(pasteurization)是食品（牛奶）釀造（啤酒）工業(yè)中常用的方法。具體做法是61.7－62.8oＣ處理30min或71.6oＣ度處理15min，這樣即可殺死病原微生物。又不致?lián)p壞營養(yǎng)，可保留食品飲料原有用味。根據(jù)結(jié)核桿菌在62oＣ下15min被致死。紫外線殺菌機制：誘導(dǎo)核酸形成胸腺嘧啶二聚體，從而干擾了核酸的復(fù)制

常用于實驗室環(huán)境的滅菌，以物品表面的滅菌各種微生物對紫外線抗性不同干細胞強于濕細胞；芽孢，孢子強于營養(yǎng)細胞；多倍體＞二倍體＞單倍體有機化合物甲醛：純甲醛為氣體，37－40％水液為福爾馬林。醇是脫水劑蛋白質(zhì)變性劑,70％乙醇殺菌效果最好。酚：3－5％的石碳酸溶液幾分鐘即可致死細菌甲酚殺菌力最強，煤酚皂液（來蘇爾）為甲酚和肥皂的混合液。K2MnO4使菌體蛋白質(zhì)氧化，使酶失活。0·1－3％濃度可用于皮膚，果品、餐具、消毒。H2O2清洗傷口。第二節(jié)培養(yǎng)基的制備與滅菌培養(yǎng)基的配置培養(yǎng)基的滅菌（一）培養(yǎng)基的配置

一、碳源1、作用提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分。提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分2、來源糖類、油脂、有機酸、正烷烴二、氮源氮源主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。1、無機氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如：(NH4)2SO4→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。所以選擇合適的無機氮源有兩層意義：

滿足菌體生長穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH2、有機氮源來源：工業(yè)上常用有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、酒糟等。成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等氮源使用的一些相關(guān)問題：有機氮源和無機氮源應(yīng)當(dāng)混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無機氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì)

有些產(chǎn)物會受氮源的誘導(dǎo)和阻遏例：蛋白酶的生產(chǎn)有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興趣的課題三、無機鹽的微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補充3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實驗決定例：鐵離子青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml發(fā)酵罐必須進行表面處理B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)α-淀粉酶，PH對酶活的影響pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘使用注意點A.對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮四、生長因子、前體和產(chǎn)物促進劑從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。1、生長因子如以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子,生長因子對發(fā)酵的調(diào)控起到重要的作用。有機氮源是這些生長因子的重要來源，多數(shù)有機氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長不可缺少的生長因子前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。2、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136用法：前體使用時普遍采用流加的方法前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，流加也有利于提高前提的轉(zhuǎn)化率3、產(chǎn)物促進劑

所謂產(chǎn)物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。促進劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的。有些促進劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)，也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。五、水對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻對于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。第二節(jié)培養(yǎng)基的滅菌主要采用高溫濕熱滅菌的方法。如何確定滅菌條件？它的理論基礎(chǔ)是什么？1.微生物的受熱死亡動力學(xué)(對數(shù)殘存律）培養(yǎng)基滅菌的依據(jù)：殺死細菌的芽孢。微生物的死亡速率遵循一級衰減率，可用下式描述：式中：N－是活菌體濃度，個數(shù)/ml或g/ml;k－比死亡速率常數(shù)，min-1;t－時間，min。上式積分得到：k值越小，表面微生物越不易熱死，反之越易熱死。溫度對死亡速率的影響死亡速率常數(shù)k與溫度的關(guān)系，可用阿累尼烏斯公式表達：式中：A－常數(shù)，min－1l;

△E－死亡活化能，J/mol;R－氣體常數(shù)，8.314J/molK;T－絕對溫度，K。上式微分可得：在同樣的溫度變化下，死亡活化能越大的物質(zhì)，它的死亡速率變化也越大。（對溫度變化敏感）微生物受熱死亡的活化能，一般要比營養(yǎng)成分熱分解的活化能大得多。所以，當(dāng)溫度升高時，微生物死亡速率的增加，要比營養(yǎng)成分破壞速率的增加大得多。在較高溫度下可以通過縮短滅菌時間而減少營養(yǎng)成分的損失，這是高溫瞬時滅菌法的理論基礎(chǔ)。間歇滅菌2.培養(yǎng)基間歇滅菌又稱分批滅菌，是將配制好的培養(yǎng)基和所有設(shè)備一起進行滅菌的操作，也稱實罐滅菌。特點是不需其他的附屬設(shè)備，操作簡便，國內(nèi)外常用。缺點是加熱和冷卻時間較長，營養(yǎng)成分有損失，罐利用低。為中小型生產(chǎn)企業(yè)采用。

分批滅菌過程

升溫、保溫和降溫，滅菌主要是在保溫過程中實現(xiàn)的，在升溫的后期和冷卻的初期，培養(yǎng)基的溫度很高，因而對滅菌也有一定貢獻。T滅菌溫度tot1t2t3timeN1

N2

N升溫保溫降溫N0

Ln(N0/N1)Ln(N2/

N)Ln(N1/

N2)要求絕對的無菌在工業(yè)上很難做到，因為由對數(shù)殘存律可知：N=0，t=∞。因此，絕對的無菌很難做到。設(shè)計中常采用N＝0.001（1000次滅菌中有一次失?。╅g歇滅菌的升溫階段和降溫階段對滅菌的貢獻相對較小，而對培養(yǎng)基中維生素類物質(zhì)的破壞作用則可能很嚴重。應(yīng)盡量縮短提溫和降溫階段。生產(chǎn)中一般采取121℃維持30min的方法。3.培養(yǎng)基連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌時，培養(yǎng)基能在短時間內(nèi)加熱到保溫溫度并能很快被冷卻，因此，與分批滅菌相比，可在更高的溫度下滅菌，而保溫時間則很短，有利于減少營養(yǎng)物質(zhì)的破壞。其它常用的除菌方法膜過濾除菌是通過機械作用濾去液體或氣體中細菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。微孔濾膜過濾器是由上下二個分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口處可連接針筒，使用時將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實驗室中小量溶液的過濾除菌。

第三節(jié)空氣的滅菌需氧微生物在發(fā)酵過程中需要耗用氧氣，氧氣通常由空氣提供。因此，在純培養(yǎng)過程中，空氣的除菌是需氧發(fā)酵的重要環(huán)節(jié)。1.空氣除菌的方法熱殺菌法理論上講，空氣滅菌可以采用加熱的方法。但空氣用量很大，且空氣的傳熱效果較差。所以，用蒸汽加熱滅菌是不合理的。過濾除菌法是讓含菌空氣通過過濾介質(zhì)，以阻截所含的微生物，而獲得無菌空氣。該方法是工業(yè)中常用的方法。過濾除菌可分為絕對過濾和深層過濾。其它方法輻射法、化學(xué)法、靜電除菌法。一般只限于實驗室使用。2.空氣過濾除菌的原理深層過濾所用的介質(zhì)間歇一般大于固體顆粒。那么，空氣中的菌體如何被除去呢？是依靠氣流通過濾層時，基于濾層纖維網(wǎng)格的層層阻礙，迫使氣流不斷改變氣速大小和方向，使菌體與濾層纖維間發(fā)生慣性撞擊、攔截滯留、布朗擴散、重力沉降和靜電吸附等作用，來達到過濾除菌的目的。3.空氣過濾的對數(shù)穿透定律空氣過濾時，微粒在濾層內(nèi)的減少速率，正比于微粒的濃度，即：式中：dN/dl－通過單位濾層厚度時，菌體數(shù)的減少；k－阻塞因數(shù)（1/cm或1/m）。積分上式得：4.常用的過濾介質(zhì)棉花

玻璃纖維

活性碳超細玻璃纖維紙燒結(jié)材料過濾介質(zhì)新型過濾介質(zhì)

如超濾膜5.空氣過濾流程a.高空采風(fēng)、兩次冷卻、兩次分油水、適當(dāng)加熱流程特點：兩次冷卻、兩次分油水、適當(dāng)加熱?？諝獾谝淮卫鋮s到30～35℃，第二級冷卻至20～25℃，經(jīng)分水后加熱到30～35℃，因為溫度升高，相對濕度下降。b.冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程特點：省去一級冷卻和分離設(shè)備及空氣再加熱設(shè)備，簡化了流程，使冷卻水用量也降低了。壓縮空氣從貯罐出來分兩路，一部分進冷卻器，經(jīng)分離器分離水、油霧后與另一部分未處理過的高溫壓縮空氣混合，使混合后的空氣溫度為30～35℃，相對濕度為50～60%。第四節(jié)工業(yè)相關(guān)滅菌技術(shù)反應(yīng)器的滅菌操作是生化反應(yīng)過程重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。滅菌不徹底會造成染菌，給生產(chǎn)帶來嚴重危害，防止雜菌污染是任何發(fā)酵工廠的一項重要工作內(nèi)容。尤其是無菌程度要求高的液體深層發(fā)酵，污染防止工作的重要性更為突出。所謂“雜菌”，是指在發(fā)酵培養(yǎng)中侵入了有礙生產(chǎn)的其他微生物。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)，都有可能遭受雜菌的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)。發(fā)酵反應(yīng)器的滅菌染菌的防治染菌原因百分率，%外界帶入雜菌（取樣、補料帶入）8.20設(shè)備穿孔7.60空氣系統(tǒng)帶菌26.00停電罐壓跌零1.60接種11.00蒸汽壓力不夠或蒸汽量不足0.60管理問題7.09操作違反規(guī)程1.60種子帶菌0.60原因不明35.001.染菌的原因從染菌的規(guī)模來分析染菌原因

大批發(fā)酵罐染菌：空氣系統(tǒng)部分發(fā)酵罐(或罐組)染菌：前期可能是種子帶雜菌，或滅菌不徹底，中后期則可能是中間補料系統(tǒng)或油管路系統(tǒng)發(fā)生問題所造成的個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備問題(如閥門的滲漏或罐體腐蝕磨損)，設(shè)備的腐蝕磨損所引起的染菌會出現(xiàn)每批發(fā)酵的染菌時間向前推移的現(xiàn)象個別發(fā)酵罐偶然染菌：原因比較復(fù)雜，因為各種染菌途徑都可能引起。從染菌的時間來分析發(fā)酵早期染菌：種子帶菌、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底、設(shè)備或管道有死角中、后期染菌：中間補料、設(shè)備滲漏、操作不合理從染菌的類型來分析耐熱性芽抱桿菌：死角或滅菌不徹底球菌、酵母：可能是從蒸汽的冷凝水或空氣中帶來的淺綠色菌落(革蘭氏陰性桿菌)：發(fā)酵罐的冷卻管或夾套滲漏霉菌：滅菌不徹底或無菌操作不嚴格2.染菌的防治種子帶菌的防止

a.種子帶雜菌是發(fā)酵前期染菌的原因之一。在每次接種后應(yīng)留取少量的種子懸浮液進行平板、肉湯培養(yǎng)