基因功能研究

基因功能研究1DNA水平RNA水平蛋白質(zhì)水平DNA測(cè)序基因芯片實(shí)時(shí)定量PCR原位雜交Southernblotting基因敲除和轉(zhuǎn)基因RNA測(cè)序RNA芯片定性、定量PCR原位雜交Northernblotting基因沉默蛋白質(zhì)測(cè)序蛋白質(zhì)芯片免疫組化、免疫熒光、免疫印跡酶活性免疫共沉淀蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)免疫共沉淀EMSASuper-EMSAPromoter分析2基因表達(dá)(geneexpression)--基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過(guò)程。rRNA、tRNA的合成屬于基因表達(dá)中心法則：3核酸分子雜交技術(shù)4概念分子雜交（hybridization）：有一定同源性的兩條核酸單鏈，在適宜的溫度和離子濃度等條件下，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過(guò)程。印跡（blotting）：將DNA、RNA或蛋白質(zhì)固定到固體支持物上的過(guò)程。探針（probe）：核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或者RNA片段5種類固相雜交（solid-phasehybridization）是將變性的DNA固定在固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱為膜上印跡雜交液相雜交（solutionhybridization）指使變性的待測(cè)核酸單鏈與已知的核酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物DNA與DNA雜交RNA與RNA雜交DNA與RNA雜交6幾種常見(jiàn)的雜交分子雜交是通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。根據(jù)被檢測(cè)的對(duì)象，分子雜交可以分為：Southern雜交：檢測(cè)DNA，探針為DNA或者RNANorthern雜交：檢測(cè)RNA，探針為DNA或者RNA73.分類（常用分子雜交技術(shù)）1969，Insituhybridization（ISH）1975，Southern，Southernblotting:DNA印記1977，Alwine，Northernblotting：RNA印記1979，Towbin，Westernblotting：蛋白質(zhì)印記基因芯片8復(fù)性RNADNA9影響Southern雜交能否檢出雜交信號(hào)的因素1、目的DNA在總DNA中所占的比例2、探針的大小和比活性3、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA的量4、探針與目的DNA的配對(duì)情況10111213（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA酶切硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段放射自顯影或成像電泳印記轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)膜）Southern實(shí)驗(yàn)步驟示意圖1415Southern的應(yīng)用

檢測(cè)樣品中的DNA插入的拷貝數(shù)，了解基因的狀態(tài),如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

16Sourthern雜交分析轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)17Northernblotting1發(fā)展

J.C.Alwine等人發(fā)展而來(lái)，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與Sourthern雜交技術(shù)十分類似，所以叫做Northernblotting。

18Northern的應(yīng)用檢測(cè)樣品中是否有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及其含量。19SBEIIIWTSBEIIIOXWTSBEIIIOX3檢測(cè)基因的表達(dá)水平---Northern的應(yīng)用實(shí)例20三種分子雜交技術(shù)的比較SouthernNorthernWestern21原位雜交(insituhybridization)將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)22核酸原位雜交的基本步驟A.細(xì)胞或組織的原位雜交檢測(cè)特異mRNA是否存在。步驟：細(xì)胞或組織的固定后置于載玻片上組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)探針的選擇和標(biāo)記雜交雜交結(jié)果檢測(cè)2324菌落原位雜交對(duì)分散在若干個(gè)瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進(jìn)行克隆篩選時(shí)采用。25B.菌落或噬菌斑的原位雜交：構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)，菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到NC膜上進(jìn)行雜交26斑點(diǎn)雜交將DNA或RNA樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，然后與核酸探針?lè)肿与s交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。27生物芯片281概念采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過(guò)特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。29芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray30芯片種類

按固定分子：基因芯片(GeneChip)

蛋白質(zhì)芯片(ProteinChip)

細(xì)胞（組織）芯片（Cell/tissueChip）

31根據(jù)用途信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。32芯片特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：①微型化：平方厘米大小，實(shí)驗(yàn)所需試劑用量少②高通量：一次檢測(cè)數(shù)萬(wàn)個(gè)分子③自動(dòng)化④標(biāo)準(zhǔn)化：傳統(tǒng)方法檢測(cè)眾多基因要經(jīng)歷多次實(shí)驗(yàn)，因而每次實(shí)驗(yàn)之間是存在系統(tǒng)誤差的。缺點(diǎn)：在同一溫度下雜交，不同探針雜交效率不同。33生物芯片的應(yīng)用基因表達(dá)水平的檢測(cè)基因診斷藥物篩選個(gè)體化醫(yī)療測(cè)序生物信息學(xué)研究34芯片制備樣品制備分子雜交檢測(cè)分析（二）芯片分析基本流程351生物芯片的制作36玻璃片（最常用的材料）聚丙烯酰胺板金屬片硅片1.1載體的材料371.2芯片的制作方法基因芯片的制作方式原位合成直接點(diǎn)樣38提取DNA或RNA，PCR或RT-PCR擴(kuò)增，摻入熒光染料標(biāo)記。與Northern和Southern雜交的區(qū)別：樣品標(biāo)記而不是探針標(biāo)記2樣品的制備39樣品與DNA芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時(shí)間短，30分鐘內(nèi)完成可同時(shí)平行檢測(cè)許多基因序列影響雜交反應(yīng)的因素：鹽濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)3雜交過(guò)程類似于一般的雜交法。401)hybridizeApplysample2)rinse414檢測(cè)分析激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點(diǎn)的信號(hào)軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理424檢測(cè)分析Laser1Laser2Detector1Detector2Scanner芯片的掃描435.圖像處理Detector1Detector2False-colordifferentialimage44圖像分析45基因芯片應(yīng)用

基因表達(dá)譜（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation紅色上調(diào)黃色不變綠色下調(diào)46生物芯片（biochip）的概念指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中的靶分子雜交，通過(guò)特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。47DNAChipTechnologySolidsupport(glass,plastic,metal,silicon)MiniaturizedarrayofDNA(geneticmaterial)WorkonthebiochemicalprincipleofDNA/DNAhybridizationHybridizedprobes(DNAmolecules)arefluorescentlylabeled484950生物芯片的主要特點(diǎn)：高通量、微型化和自動(dòng)化生物芯片的分類：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室51521.基因芯片（Genechip）又稱DNA芯片,是根據(jù)核酸雜交的原理，將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷希缓笈c標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析。532.蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)利用抗體與抗原特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)的原理，將蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體）結(jié)合到固相支持物上，形成蛋白質(zhì)微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。54

3.芯片實(shí)驗(yàn)室(labs-on-chip)高度集成化的集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測(cè)為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)生化分析全過(guò)程集成在一片芯片上完成，從而使生物分析過(guò)程自動(dòng)化、連續(xù)化和微縮化芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)5556DNA芯片技術(shù)包括四個(gè)主要步驟芯片的設(shè)計(jì)與制備樣品制備雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè)結(jié)果分析57基因芯片流程樣品制備芯片制備雜交雜交信號(hào)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析58596061基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用基因表達(dá)分析基因型、基因突變和多態(tài)性分析疾病診斷：遺傳性、感染性、腫瘤藥物篩選指導(dǎo)醫(yī)院及治療方案預(yù)防醫(yī)學(xué)62蛋白質(zhì)芯片（proteinchip）又稱蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)或多肽作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記熒光的蛋白質(zhì)或其它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來(lái)分析蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其它分子之間的相互作用關(guān)系。

63根據(jù)制作方法和應(yīng)用的不同，蛋白質(zhì)芯片分為兩種:蛋白質(zhì)功能芯片細(xì)胞中的每一種蛋白質(zhì)占據(jù)芯片上一個(gè)確定的點(diǎn)，主要是高度平行地檢測(cè)天然蛋白質(zhì)活性。蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片將能夠識(shí)別復(fù)雜生物溶液（如細(xì)胞提取液）中靶多肽的高度特異性配體進(jìn)行點(diǎn)陣，這種芯片能夠高度并行的檢測(cè)生物樣品中的蛋白質(zhì)。6465

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1.特異性抗原抗體的檢測(cè)2.生化反應(yīng)的檢測(cè)3.疾病診斷4.疾病分子機(jī)制的研究5.藥物篩選及新藥的研制開(kāi)發(fā)

66基因表達(dá)譜（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation紅色上調(diào)黃色不變綠色下調(diào)67基因芯片的應(yīng)用1基因表達(dá)分析：分析基因表達(dá)時(shí)空特征檢測(cè)基因差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)新基因大規(guī)模測(cè)序2基因型、基因突變和多態(tài)性分析分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系

683疾病的診斷與治療遺傳病相關(guān)基因的定位:產(chǎn)前篩查與診斷腫瘤診斷感染性疾病的診斷

4藥物研究中的應(yīng)用

新藥開(kāi)發(fā)發(fā)現(xiàn)藥物的新功能

調(diào)查藥物處理細(xì)胞后基因的表達(dá)情況對(duì)藥物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)

695基因芯片在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用藥物篩選中醫(yī)“證”本質(zhì)的研究

針灸原理研究

6

其它應(yīng)用

環(huán)境化學(xué)毒物的篩選體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究

707172737475767778798081828384858687888990919293基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)94PPARRXRPPARbindingsiteSOD3promotorsequenceCo-activators9596基因檢測(cè)1、常規(guī)PCR（定性或者半定量）2、定量PCR：Real-timePCR1）反應(yīng)體系中含有SYBRGreenI熒光染料2）標(biāo)記特異的探針：TaqMan探針97常規(guī)PCR與定量PCR的比較98

——外標(biāo)準(zhǔn)方法

在擴(kuò)增檢測(cè)待測(cè)樣本的同時(shí)，擴(kuò)增一系列稀釋的已知標(biāo)準(zhǔn)（通常為質(zhì)粒DNA）如果在該標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列范圍內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物/模板成線性相關(guān)，則可推導(dǎo)出同時(shí)擴(kuò)增的待測(cè)樣本中PCR模板的相對(duì)量99

——外標(biāo)準(zhǔn)方法100定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便，容易建立使用雙孔重復(fù)測(cè)定可得到非常準(zhǔn)確的結(jié)果甚至可排除管間的差異不能排除樣本間的差異101定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法缺點(diǎn)PCR反應(yīng)體系的微小區(qū)別也會(huì)對(duì)測(cè)定造成較大的影響在擴(kuò)增效率上的差異，會(huì)使定量測(cè)定精密度和重復(fù)性不佳操作麻煩102熒光檢測(cè)法原理熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)103104根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為T(mén)aqMan探針和SYBRGreenI熒光染料兩種方法。熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)便。在選擇實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?duì)數(shù)據(jù)精度的要求來(lái)決定

105熒光染料法：SYBRGreenI是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

106107SYBRGreen熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是：（1）開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)SYBRGreen染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。（2）DNA變性時(shí)，SYBRGreen染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。（3）在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。（4）聚合完成后，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。

108實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)定量PCR

真正的定量PCR00.20.40.60.811.21.41.61.822.2010203040cyclenumberRnnotemplate2000010000500020001000500100109原理：當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物時(shí)，該探針可與模板的特異序列結(jié)合當(dāng)Taq酶靠近探針時(shí)，激活了Taq酶的外切酶活性，將探針5’的R切下，R基團(tuán)發(fā)出熒光根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算初始模板的數(shù)量熒光探針?lè)ǎ海?）TaqMan熒光探針：110PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。111特異性熒光雙標(biāo)記探針Taq酶5’→3’外切酶活性112基因敲除、轉(zhuǎn)基因、基因沉默113基因表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)缺失特殊基因表達(dá)：比如熒光蛋白基因高表達(dá)常規(guī)敲除條件敲除無(wú)組織特異基因敲除組織特異質(zhì)粒和病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)常規(guī)敲入條件敲入無(wú)組織特異基因敲入組織特異基因沉默114熒光蛋白表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染重組腺病毒腺相關(guān)病毒慢病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒熒光蛋白的應(yīng)用組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)