第九章蛋白質(zhì)相互作用與定量蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)相互作用與定量

蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第九章蛋白質(zhì)相互作用主要研究技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)展TAP（TandemAffinityPurification)技術(shù)進(jìn)展自動(dòng)化、高通量酵母雙雜交技術(shù)和TAP技術(shù)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)主要內(nèi)容：一、蛋白質(zhì)相互作用Protein-ProteinInteractions蛋白質(zhì)相互作用控制著生命過程的各個(gè)方面YeastTwoHybridMassSpectrometry二、酵母雙雜交技術(shù)及進(jìn)展

YeastTwo-Hybrid，Y2H.

FieldsS.andSongO.:

Nature,1989,340:245-246研究蛋白質(zhì)相互作用的方法,利用轉(zhuǎn)錄因子組件式（modular）結(jié)構(gòu)的性質(zhì)。Y2H就是將需要研究的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成“誘餌”，以釣出能與誘餌蛋白發(fā)生物理相互作用的蛋白質(zhì)（被捕食蛋白質(zhì)）。一個(gè)單轉(zhuǎn)錄因子有：

DBD:DNAbindingdomainDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

AD:Activationdomain,轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域：能激活RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄。

誘餌蛋白B+DBD:不能起始轉(zhuǎn)錄被捕食蛋白的ORF+AD:不能起始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)誘餌蛋白和被捕食蛋白在同一細(xì)胞中表達(dá)，如發(fā)生相互作用，RNA聚合酶將啟動(dòng)報(bào)告基因His3轉(zhuǎn)錄，合成組氨酸，如His3不表達(dá)，細(xì)胞不能生長。FieldsS.andSongO.

Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340:245-246

優(yōu)點(diǎn)：酵母細(xì)胞幾乎能表達(dá)所有生物基因。缺點(diǎn)：

并非所有蛋白質(zhì)能在酵母核內(nèi)正常行使功能，不正確的蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)：假陽性假陰性Y2H開始以轉(zhuǎn)錄因子Gal4為基礎(chǔ)，依靠招募RNA聚合酶II激活轉(zhuǎn)錄。1997：Marsoliter等建立以RNA聚合酶III為基礎(chǔ)的Y2H，假陽性率更低。反向雙雜交系統(tǒng)：reversetwo-hybridsystem.

構(gòu)建反向篩選的報(bào)告基因（URA3，U合成所必需），蛋白質(zhì)互作激活報(bào)告基因表達(dá)，使細(xì)胞不能成活。分離雜交系統(tǒng)，split-hybridsystem

利用2個(gè)相互整合的報(bào)告基因。細(xì)胞質(zhì)中的雙雜交系統(tǒng)：

SOS招募系統(tǒng)：SOSrecruitmentsystem利用Ras信號傳導(dǎo)途徑的基本性質(zhì)：兩種蛋白相互作用，就會(huì)將hSos(人的鳥苷酸交換因子)招募到膜上，激活Ras,使酵母細(xì)胞在限制溫度下成活和增殖。其他新的雙雜交系統(tǒng)：

分離的泛素系統(tǒng)split-ubiquitinsyatem.(PNAS,1996,91:10340-10344)利用泛素的功能特點(diǎn)。當(dāng)分別與泛素N端和C端部分融合的兩個(gè)蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，使分離的泛素的兩部分靠近，泛素專一性的蛋白酶就會(huì)識別泛素，導(dǎo)致報(bào)道蛋白的解離釋放。單雜交系統(tǒng)，onehybridsystemDNA和蛋白質(zhì)間相互作用。鑒定與特定DNA序列直接作用的蛋白質(zhì)。三雜交系統(tǒng)，threehybridsystem

RNA或小分子配體和蛋白質(zhì)的相互作用三者共同作用，才能激活轉(zhuǎn)錄。三、酵母雙雜交技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用Interactome互作組：全面詳盡的蛋白質(zhì)相互作用圖譜。病毒、細(xì)菌、酵母、線蟲等。T7噬菌體：首先用于大規(guī)模Y2H分析：

55個(gè)有25個(gè)相互作用。丙型肝炎病毒HCV：編碼10個(gè)成熟蛋白，有5個(gè)相互作用。

釀酒酵母：6000多個(gè)ORF,1996完成基因組計(jì)劃，陣列篩選法得到281個(gè)相互作用；文庫篩選法得到692個(gè)相互作用：Uetz,P.etal.,Nature,2000,403:623-627.線蟲：148個(gè)相互作用：

WalhoutA.J.etal.:

Science,2000,287:116-122.四、噬菌體展示技術(shù)

（Phagedisplay）

噬菌體展示技術(shù)是利用噬菌體的外殼蛋白與目的蛋白或多肽融合表達(dá)，將目的蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的外部，在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行“Biopanning”體外篩選，十分適用于酶與其配體或抑制劑、抗原決定簇、細(xì)胞表面受體的篩選等等。這個(gè)篩選的過程很簡單，將目標(biāo)肽或蛋白質(zhì)固定于平板上，鋪上噬菌體，噬菌體外殼融合蛋白與目標(biāo)肽結(jié)合，不能結(jié)合的噬菌體顆粒將被洗掉，再將結(jié)合的噬菌體洗下，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，再進(jìn)行一到兩次的輪回，就能夠分離到特定的噬菌體顆粒。

噬菌體展示技術(shù)（Phagedisplay）·

Ph.D.-7PhageDisplayPeptideLibraryKit·

Ph.D.-12PhageDisplayPeptideLibraryKit·

Ph.D.-C7CPhageDisplayPeptideLibraryKit·Ph.D.PeptideDisplayCloningSystem五、表面等離子體共振技術(shù)SPR

SurfacePlasmonResonance

研究蛋白質(zhì)相互作用的新方法。如瑞典BIACORE的單元蛋白質(zhì)芯片。將誘餌蛋白作為配基，固化在幾十納迷厚的金屬膜表面，加入含獵物蛋白的溶液，如有相互作用會(huì)特異性結(jié)合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，使金屬膜與溶液界面的折射率上升，導(dǎo)致共振角度改變。特點(diǎn)：快速、安全，不需標(biāo)記物和染料，還可檢測蛋白-核酸及其它分子間的相互作用。

SPRDNA生物傳感器可用于基因突變的檢測、PCR產(chǎn)物測定、病毒檢測等。六、蛋白質(zhì)間連鎖圖的建立已建立釀酒酵母1548個(gè)蛋白質(zhì)間2358個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò):Fields,S.Lab:

Nat.Biotechnology2000,18:1257-1261.七、酵母雙雜交技術(shù)方法首先是選擇適當(dāng)?shù)妮d體系統(tǒng)：

BD,AD載體：Gal4,LexA系統(tǒng)，多已商業(yè)化。然后將待鑒定的蛋白分別構(gòu)建到載體上。

篩選文庫的雙雜交實(shí)驗(yàn)流程。陣列篩選法：用不同結(jié)合型（a,α）的表達(dá)“獵物”和“誘餌”蛋白的酵母菌株一一結(jié)合，可推測已知的蛋白質(zhì)間的相互作用。文庫篩選法：用表達(dá)一種“誘餌”蛋白的酵母細(xì)胞和一個(gè)表達(dá)復(fù)雜的文庫“獵物”蛋白的酵母細(xì)胞直接結(jié)合。可發(fā)現(xiàn)未知蛋白。八、雙雜交系統(tǒng)及其應(yīng)用主要商業(yè)公司：APPLIEDBIOSYSTEMSBIOSIGNALPACKARDINC.CLONTECHINVITROGENORIGENETECHNOLOGIESINC.PROMEGACORPQBIOGENESTRATAGENEClontech公司的酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌基因的擴(kuò)增和表達(dá)載體的構(gòu)建誘餌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到酵母中,驗(yàn)證對酵母的毒性和自激活實(shí)驗(yàn)獵物文庫的選擇(預(yù)轉(zhuǎn)化的文庫和預(yù)制的文庫),文庫擴(kuò)增,質(zhì)粒提取誘餌和獵物用共轉(zhuǎn)化或交配(Mating)的方法轉(zhuǎn)化到同一酵母中涂布到約50個(gè)篩選平板上菌落長出后，挑取陽性菌落作beta-gal報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)菌落PCR擴(kuò)增獵物基因，測序Blast分析得到獵物基因序列陽性相互作用的重新驗(yàn)證(Co-IP,pull-down,共定位等功能實(shí)驗(yàn)）從事大規(guī)模酵母雙雜交的研究機(jī)構(gòu)AllianceforCellSignalingMyriadGeneticsInc.HybrigenicsCuragenProteinComplexBacteriaRainJ.C.,etal.Theprotein-proteininteractionmapofHelicobacterpylori.Nature409,211-215(2001)幽門螺旋菌（導(dǎo)致胃?。㎡rganismTechnologyNumberofassays(bait×prey)DetectedinteractionsAlreadyknownS.cerevisiae(~6000ORFs)ProteinarraysPoolsofprey192×proteomeproteome×proteome281692109S.cerevisiae(~6000ORFs)Poolsofbaitsandprey430assaysofpools96×9617512S.cerevisiae(~6000ORFs)Poolsofbaitsandprey3844assaysofpools96×96841105S.cerevisiae(~6000ORFs)Libraryscreening15×proteome1703S.cerevisiae(~6000ORFs)Libraryscreening11×proteome11334S.cerevisiae(~6000ORFs)Libraryscreening68×proteome191128YeastViralgenomeOrganismTechnologyNumberofassays(bait×prey)DetectedinteractionsAlreadyknownVacciniavrius(~266ORFs)Proteinarrayproteome×proteome379HCV(10ORFs)ProteinarrayLibraryscreening10×proteome22fragments×proteome0522T7LibraryscreeningRandom×Random254McCraithS.,etal.Genome-wideanalysisofvacciniavirusprotein-proteininteractions.Proc.Natl.Acad.Sci.97,4879-4884(2000)FlajoletM.,etal.AgenomicapproachofthehepatitisCvirusgeneratesaproteininteractionmap.Gene242,369-379(2000)BartelP.,etal.AproteinlinkagemapofEscherichiacolibacteriophageT7.NatureGenetics12,72-77(1996)Caenorhabditiselegans線蟲OrganismTechnologyNumberofassays(bait×prey)DetectedinteractionsAlreadyknownC.elegans(~20000ORFs)ProteinarrayLibraryscreeing29×2927×proteome812463WalhoutA.J.M.,etal.ProteininteractionmappinginC.elegansusingproteinsinvolvedinvulvaldevelopment.

Science287,116-122(2000).九、TAP（TandemAffinityPurification)技術(shù)進(jìn)展NATUREBIOTECHNOLOGYVOL17OCTOBER1999特點(diǎn)：高純度一次實(shí)驗(yàn)可以鑒定多個(gè)組分體內(nèi)純化復(fù)合體材料需要量少花費(fèi)低、時(shí)間少靶蛋白可能含有TEV蛋白酶切位點(diǎn)EGTA可能影響復(fù)合體的穩(wěn)定Nature,415:141-147,January,2002十、自動(dòng)化、高通量酵母雙雜交技術(shù)和TAP技術(shù)HyNet?:YeastTwo-HybridStrategyHySpec?:ProteinScienceandMassSpectrometryBioinformaticsAnalysisMyriadGeneticsInc.Myriad,Hitachi,Oracle&FriedliJoinForcesToMapTheEntireHumanProteome

$185MillionCollaborationtoDetermineAllHumanProteinInteractionsAndDecipherBiochemicalPathwaysAutomatedPlatingandColonyPickingLiquidmatingandplating

PickingToolRetrievingaColony

InoculatingaPlateofLiquidCulture

AutomatedPCRsetupandSequenceAnalysis

HighThroughputPCRofORFsGateway?CloningandCloneArchiveHumancelllysatepreparationGenedeliveryBacterialExpressionProteinPurificationProteinPulldownsMultidimensionalchromatographyseparationCombinedESI-MSandMALDI-MS在藥物開發(fā)中的應(yīng)用AwardedUSPatentonp10TumorSuppressorGeneCholesterolDisordersRepresentNovelDrugTargetsDiscoversNovelHepatitis'C'TargetDiscoversHighCholesterolGeneNovelDrugTargetforColorectalCancerNovelDrugTargetforHepatitisBNovelProstate（前列腺）CancerGeneMajorCauseofHereditaryObesityMajorDepression（抑郁）Gene

Automatedyeasttwohybrid

screening100,000clonesperdayArrayformatFulldatatrackingMegaMate－Genetix十一、定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

QuantitativeproteomicsMannM.:Nat.biotechnol.,1999,17:954-955.

把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定的一門科學(xué)。（TrendsBiotechnol.,1999,17:121-127）

蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度：定量要求：染色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量成正比；通用性好（不同蛋白質(zhì)具有相同染色能力）高靈敏度染色不影響后續(xù)鑒定（如不影響MS

中蛋白質(zhì)分子的離子化過程）定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法：多維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)蛋白質(zhì)熒光染色技術(shù)同位素標(biāo)記技術(shù)同位素親和標(biāo)簽技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)1、熒光染色定量技術(shù)有兩種染料：

共價(jià)結(jié)合：花青染料

多位點(diǎn)結(jié)合，蛋白質(zhì)溶解度降低，用量少，靈敏度低。

非共價(jià)結(jié)合：（1）與蛋白質(zhì)沒有特定的親和力，在疏水性環(huán)境中才產(chǎn)生熒光：如苯乙烯基染料：

SyproOrange,SyproRed,SyproRuby…

尼羅河紅：NileRed.

（2）與蛋白質(zhì)有特定的親和力

RuBPS：一種釕螯合劑。Amersham:

2-DDIGE:FluorescenceTwo-dimensionalDifferentialGelElectrophoresis熒光雙向差示凝膠電泳技術(shù)。利用與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的染料。

Proteomics,2001,1:377-396.2、采用同位素編碼親和標(biāo)簽技術(shù)

IsotopeCodedAffinityTags,ICAT:

Gygietal:

Nat.Biotechnol.,1999,17:994-999.關(guān)鍵：ICTA試劑:三部分組成?？啥糠治觯旱鞍踪|(zhì)標(biāo)記酶切親和色譜分離MS信號強(qiáng)度定量測序。3、穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記技術(shù)

Odaetal.,PNAS,1999,96:6591-6596.方法：兩組酵母細(xì)胞：14N99.6%+15N0.4%

15N>96%(Mr大).2-D、染色找出差異蛋白，酶解后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析：精確定量。缺點(diǎn)（1）只適合于微生物（2）同位素影響微生物生長與蛋白合成（3）同位素標(biāo)記Mr增加，加大數(shù)據(jù)檢索難度。4、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)將蛋白質(zhì)組的部分或全部蛋白質(zhì)種類制作成蛋白質(zhì)芯片（誘餌蛋白，如抗體）,這樣的芯片可以用于篩選特定分子的相互作用分子。實(shí)質(zhì)上是大規(guī)模的ELISA技術(shù)。技術(shù)關(guān)鍵：（1）空間上固定能辨別單一蛋白成分的分子。（2）檢測混合物中單個(gè)蛋白與它們相應(yīng)的識別分子間的相互作用。類型：玻璃板芯片

3D膠芯片（3Dgelpadchip）微孔芯片（micro-wellchip）Ciphergen公司：

ProtenChip?

蛋白質(zhì)芯片Clontech?抗體芯片AbMicroarray380AbMicroarray芯片上的抗體包含針對信號傳導(dǎo)、癌癥、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等廣泛的生物功能的相關(guān)蛋白，跨度大、適用范圍廣,在毒性實(shí)驗(yàn)、疾病研究和藥物開發(fā)上有廣泛的應(yīng)用前景。液體蛋白芯片系統(tǒng)：傳統(tǒng)芯片技術(shù)分子間固相-液相相互作用LIQUIDCHIP分子間在液相中相互作用(分子間相互作用的最有效方式)

LiquichipSystem是在xMAP技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的蛋白質(zhì)分析平臺。反應(yīng)在懸浮于液體中的球形基質(zhì)上進(jìn)行，提供了在一次樣品分析中同時(shí)進(jìn)行多達(dá)100種不同的分析的可能性。使用LiquichipSystem可以完成蛋白組學(xué)研究和藥物研發(fā)中的許多種蛋白質(zhì)分析。整個(gè)系統(tǒng)包括儀器，軟件，球形反應(yīng)基質(zhì)和檢測試劑。TheLiquichipTMProtein

SuspensionArraySystem液體蛋白芯片系統(tǒng)LiquichipSystem的應(yīng)用免疫分析(e.g.,ELISA)酶分析受體-配基分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-核酸十二、免役共沉淀技術(shù)

檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間物理作用的方法。使用抗體時(shí)即為免役共沉淀。

基本方法：利用蛋白質(zhì)間特異親和的原理。細(xì)胞裂解在非變形條件下制備總蛋白，以一種蛋白的抗體特異地免疫沉淀這種蛋白，然后用第二種蛋白或更多種蛋白的抗體做免疫印跡，檢測它們是否被第一種蛋白共沉淀，以對照檢測相互作用的特異性。1、檢測蛋白質(zhì)的存在

Westernblot檢測參與免役共沉淀的蛋白質(zhì)的表達(dá)或存在。2、制備總蛋白提取物3、相互作用特異性對照實(shí)驗(yàn)4、免役共沉淀技術(shù)的其他分析靈敏度高、能反映體內(nèi)的相互作用情況，可與Y2H結(jié)合使用。

兩個(gè)方向分別共沉淀：以蛋白A的抗體免役共沉淀，以蛋白B的抗體免疫檢測；同時(shí)以蛋白B的抗體免役共沉淀，以蛋白A的抗體免疫檢測。十三、細(xì)胞共定位技術(shù)

1、熒光蛋白融合技術(shù)

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