第2章細胞培養(yǎng)技術(shù)與應用-2

六、水產(chǎn)經(jīng)濟動物的細胞培養(yǎng)進展脊椎動物無脊椎動物魚類多孔動物門棘皮動物門腔腸動物門節(jié)肢動物門軟體動物門1、魚類魚類細胞原代培養(yǎng)所取材的組織器官來源很多，包括性腺、腎臟、肝臟、脾臟、心臟、鰭條、鰾、鰓上皮、皮膚、吻端、內(nèi)分泌組織、血液、肌肉組織以及骨骼細胞。魚類胚胎和幼魚的各種組織，分化程度低，分裂潛能大，病毒攜帶少，適合作為原代培養(yǎng)的材料。魚類細胞平均傳代100代仍可以繼續(xù)分裂,比起哺乳類,分裂極限要大得多,并且每一代細胞的存活期均較長;人和哺乳動物離體培養(yǎng)的正常二倍體細胞株壽命一般不超過50代。至2010年,建立的魚類細胞系約有275類，其中大多數(shù)來自淡水魚或溯河產(chǎn)卵的海洋魚類，約175株，分別來源于71個科的89種魚類的不同組織；而海水魚類及咸水魚類的細胞系約100株，分別來源于23個科的35種海水魚類的不同組織。1981年我國建立了最早的魚類細胞系——草魚吻端組織細胞系，至今已經(jīng)建立了70余種細胞株（系），來自40多種魚類。來源的組織有吻端、腎臟、卵巢、尾鰭、膘、性腺、肝臟、胚胎、囊胚、原腸胚、鰭條等。以淡水魚細胞培養(yǎng)為主。海水魚細胞的培養(yǎng)也越來越受到重視，如牙鲆鰓細胞系、鱸魚脾和心細胞系、真鯛鰭細胞系、花鱸胚胎干細胞系、漠斑牙鲆胚胎干細胞系、大菱鲆鰭細胞系、點帶石斑魚脾臟細胞系等。1976年建立了世界上第一個魚類細胞系，虹鱒魚生殖腺細胞系：RTG-2。魚類細胞系的應用越來越廣泛,已由單純的病毒培養(yǎng)分離、免疫學、毒理學、致癌作用、遺傳學研究逐步向近些年研究很集中的基因組學、DNA的復制與修飾、表觀遺傳學、基因敲除、RNAi以及最新的iPS等各個方面發(fā)展。2、節(jié)肢動物已經(jīng)對龍蝦、中國對蝦、日本對蝦、草蝦、斑節(jié)對蝦、羅氏沼蝦等多種蝦類進行了細胞培養(yǎng)研究。但由于其生理、生化特點以及生活環(huán)境均與陸生動物有很大差異，加之其細胞的營養(yǎng)需要和代謝機理研究滯后，因而，節(jié)肢動物細胞系的建立問題至今仍是全世界所面臨的挑戰(zhàn)性課題。斑節(jié)對蝦淋巴器官的細胞在L-15培養(yǎng)基中傳了90代，第90代后細胞不能繼續(xù)傳代生長，只建立了有限細胞系。心臟、卵巢、鰓、胸腺、內(nèi)臟、肌肉、淋巴、肝胰臟等組織以及胚胎都被嘗試培養(yǎng)過。最易培養(yǎng)的組織依次是心臟、淋巴、卵巢、腦神經(jīng)節(jié)、眼球。待培養(yǎng)組織的消毒滅菌非常困難。節(jié)肢動物的組織器官大多暴露于外界,帶有較多的微生物和寄生蟲,即使是健康個體體內(nèi)也存在一些微生物,使得培養(yǎng)易受污染而失敗。雖然蝦的胚胎和幼體應是最易培養(yǎng)的材料,但是其胚胎和幼體是體外發(fā)育,受微生物污染嚴重,目前還沒有理想的消毒方法。鱟的鰓組織暴露在海水中，附有一層粘液，沖洗液很難除菌，鱟的血液中生活有許多的原生動物，在培養(yǎng)鱟血細胞時，經(jīng)常出現(xiàn)原生動物污染的現(xiàn)象。蝦類細胞培養(yǎng)的應用——病毒研究：桿狀病毒(MBV)、黃頭病毒(YHV）、白斑綜合癥病毒(WSSV)、皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV）、蝦彈狀病毒奇怪的現(xiàn)象：蝦蟹類在春季、秋季細胞培養(yǎng)較難，冬季幾乎不能成功。這可能與其體內(nèi)的激素分泌和細胞的基因調(diào)控有關。軟體動物的數(shù)量僅次于節(jié)肢動物,為動物界中第二大類群,包括各種螺類、雙殼類、烏賊和章魚等。軟體動物是細胞培養(yǎng)研究開展得最多的一類海洋無脊椎動物。3、軟體動物門軟體動物細胞培養(yǎng)的對象主要是一些養(yǎng)殖的雙殼類和腹足類,包括貽貝、珍珠貝、牡蠣、蛤蜊、螺和鮑等。所培養(yǎng)的組織細胞主要來源于胚胎、鰓、外套膜、神經(jīng)細胞、血細胞、消化腺和心肌等。19世紀70年代,軟體動物細胞培養(yǎng)就已取得了一些進展。在珍珠牡蠣外套膜組織培養(yǎng)中,成功觀察到了體外培養(yǎng)的外套膜細胞能夠分泌有機物和進行有絲分裂的現(xiàn)象。但隨后的珍珠牡蠣的外套膜組織培養(yǎng)卻一直沒有很大的進展。1976年,建立起了第一個也是迄今為止唯一一個軟體動物細胞系:淡水蝸牛擔輪幼蟲胚胎細胞系BGE。至今沒有解決海洋軟體動物細胞的體外長期存活和成功傳代建系的問題,即使是培養(yǎng)貝類的腫瘤組織也不例外。近年來,海洋軟體動物原代細胞培養(yǎng)物的應用研究開始增多。利用巨牡蠣的血細胞凝集實驗來檢測外源污染物的毒性效應。貝類細胞培養(yǎng)Ⅱ：無脊椎動物缺少獲得性免疫系統(tǒng)，血液是重要的免疫器官。細胞培養(yǎng)作為良好的體外實驗模型非常適用于血細胞對外毒物的反應的研究Ⅰ：外套膜細胞培養(yǎng)。主要有：馬氏珠母貝、櫛孔扇貝、鮑、文蛤、大珠母貝Ⅲ：鰓細胞的培養(yǎng)。①利用原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝血細胞探究了血細胞在細菌脂多糖的刺激下免疫相關基因CfToll-1表達量的變化情況；研究苯并芘對櫛孔扇貝血細胞的影響。②利用多種病原相關分子模式刺激培養(yǎng)的長牡蠣原代血細胞來研究相關基因表達隨時間的變化情況。③利用僧帽牡蠣的鰓組織進行了培養(yǎng)，并在此基礎上研究了毒性較大的氯化三丁基錫對牡蠣鰓組織細胞的細胞形態(tài)以及存活率的影響。貝類細胞培養(yǎng)面臨的主要困難（2）在添加促生長因子方面，一直沒能尋得一種或是幾種混合的生長因子來促進貝類細胞的生長繁殖。不能單純的套用哺乳動物細胞培養(yǎng)模式，必須要充分的認識海洋貝類動物的不同，深入研究貝類細胞的營養(yǎng)代謝以及細胞生理等，以便研發(fā)海洋貝類細胞培養(yǎng)所適用的培養(yǎng)基；（3）貝類開放的生活環(huán)境，器官組織攜帶大量病菌。（1）在體外使貝類細胞無限增殖仍然是全世界所面臨的難題。目前對于海洋無脊椎動物特別是貝類細胞增殖和調(diào)控的知識知之甚少；由于海綿特殊的細胞結(jié)構(gòu)和生理特點,使得海綿細胞培養(yǎng)面臨很大困難,進展緩慢,仍停留在原代培養(yǎng)水平。主要有以下兩個原因:(1)海綿動物多為合胞體，即整個生物體是由一個巨大的內(nèi)有橫隔片的多核細胞構(gòu)成，通過胞內(nèi)隔片上的孔道來進行細胞內(nèi)的物質(zhì)交換。分散培養(yǎng)的細胞在體外培養(yǎng)中很難存活和分裂。體外培養(yǎng)的海綿細胞相互接觸后,會彼此融合,形成一個大的多核體,結(jié)構(gòu)與體內(nèi)有著很大的不同；2)海綿動物體內(nèi)存在著多種內(nèi)共生的微生物,難以實現(xiàn)海綿細胞的無菌培養(yǎng)。如果不使用抗生素的話,培養(yǎng)又只能維持1~3天。4、多孔動物（海綿動物）細胞分散技術(shù)對存活細胞的數(shù)量、組織培養(yǎng)的好壞和培養(yǎng)時間的長短都有很大影響。體外培養(yǎng)腔腸動物細胞的存活、貼壁和遷移對培養(yǎng)基質(zhì)有著很嚴格的要求。在培養(yǎng)時,多數(shù)腔腸動物細胞都只有與細胞外基質(zhì)相接觸時才能存活,而且它們只有附著于由中膠層殘片構(gòu)成的基質(zhì)上,才能很好地貼壁、鋪展和遷移。腔腸動物門包括珊瑚、海葵等,是二胚層多細胞后生動物,有了組織的分化,但結(jié)構(gòu)簡單,體壁僅由內(nèi)、外胚層兩層細胞以及中間無細胞結(jié)構(gòu)的中膠層構(gòu)成,細胞類型少。5、腔腸動物細胞分散技術(shù)對存活細胞的數(shù)量、組織培養(yǎng)的好壞和培養(yǎng)時間的長短都有很大影響。體外培養(yǎng)腔腸動物細胞的存活、貼壁和遷移對培養(yǎng)基質(zhì)有著很嚴格的要求。在培養(yǎng)時,多數(shù)腔腸動物細胞都只有與細胞外基質(zhì)相接觸時才能存活,而且它們只有附著于由中膠層殘片構(gòu)成的基質(zhì)上,才能很好地貼壁、鋪展和遷移。腔腸動物門包括珊瑚、海葵等,是二胚層多細胞后生動物,有了組織的分化,但結(jié)構(gòu)簡單,體壁僅由內(nèi)、外胚層兩層細胞以及中間無細胞結(jié)構(gòu)的中膠層構(gòu)成,細胞類型少。5、腔腸動物水螅剖面圖棘皮動物的細胞培養(yǎng)研究開展得很少,雖然棘皮動物具有無與倫比的再生能力,如海星臂的再生和海參的吐臟再生等。但是其細胞培養(yǎng)還是難獲成功,目前仍然停留在原代培養(yǎng)的水平上。6、棘皮動物海參吐臟最早在1993年開始了對海參再生組織的細胞培養(yǎng),至40天時,觀察到再生腸組織來源的細胞團發(fā)生旋轉(zhuǎn)和再生呼吸樹來源的細胞團出現(xiàn)搏動現(xiàn)象。最近,對海參吐臟后不同再生階段的腸組織進行了原代培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)只有吐臟后第14～16天的再生腸組織的原代培養(yǎng)物中,能觀察到活躍的細胞增殖,細胞的數(shù)量于培養(yǎng)后第20天加倍,而在其他再生階段的腸組織原代培養(yǎng)物中均未觀察到細胞分裂現(xiàn)象。第五節(jié)

細胞培養(yǎng)技術(shù)的應用應用1用細胞生產(chǎn)珍珠珍珠的價值中國海水珍珠年產(chǎn)量20余噸；淡水珠產(chǎn)量1500余噸,占世界的95％以上,但能作為高檔工藝珠的不足1%。與生產(chǎn)工藝有關年需求量約1000噸，出口量達400噸

觀賞收藏藥用保健藥用珍珠珍珠粉為類白色的極細粉，氣微，味淡。4%4%91%0.4%?；撬峋S生素藥用、化妝品、中成藥的主要原料（六神丸、安宮牛黃丸等），安神、平肝息風。天然海水珍珠淡水養(yǎng)珠蚌科

三角帆蚌

（珠質(zhì)細膩、光滑、色澤鮮艷、較圓，質(zhì)量最佳，但成珠慢）

褶紋冠蚌

（珍珠長圓形，白色或粉紅色；成珠快，產(chǎn)量高）

珍珠的主要來源珍珠貝科

馬氏珍珠貝，又稱南珠，粒大、圓潤、光彩迷人,為國之瑰寶）馬氏珍珠貝又稱合浦珠母貝。貝殼斜四方形，背緣略平直，腹緣弧形，前、后緣弓狀。前耳突出，近三角形；后耳較粗短。中國分布在廣西、廣東和臺灣海峽南部沿海一帶。國際上公認中國出產(chǎn)的南海珍珠的質(zhì)量在世界上首屈一指。珍珠的形成機理軟體動物和腕足動物殼內(nèi)的體壁褶。珍珠的形成機理珍珠的形成機理外套膜海水珍珠養(yǎng)殖場傳統(tǒng)的珍珠生產(chǎn)超大型淡水珍珠養(yǎng)殖吊養(yǎng)場采收珍珠視頻資料利用細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)珍珠目的：培養(yǎng)直徑8mm以上、光澤度好的正圓珍珠實驗材料：（1）選取體質(zhì)健康、大小均一的1齡三角帆蚌用作細胞培養(yǎng)，3齡的三角帆蚌為插核之用。（2）細胞培養(yǎng)材料：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25％胰酶、10000IU雙抗(青、鏈霉素)、牛磺酸、抗壞血酸、水解乳蛋白、制霉菌素、多聚賴氨酸（1）外套膜上皮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)實現(xiàn)的過程（2）細胞活性與貼壁效果的檢測（3）珠核的預處理臺盼藍染色法顯微鏡觀察法1齡小蚌，切斷前后閉殼肌，撕膜法分離出外套膜外表皮，剪碎，胰酶消化洗滌、高壓滅菌處理（5）內(nèi)臟團插核手術(shù)（為什么選擇？）（6）垂直吊養(yǎng)（4）共培養(yǎng)嚴格消毒后，用通道針在內(nèi)臟團與斧足交界處開口，并制造通道，深度為2cm，口徑為1cm，將處理后的珠核移植到育珠蚌體內(nèi)，吸取0.5mL外套膜細胞懸液，注射到珠核周圍。用浸泡在雙抗中的一次性棉棒擦拭傷口，按壓以促進傷口消炎愈合。珠核放入培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞懸液中，完全淹沒珠核。吊養(yǎng)位置為水面下25cm處，進行常規(guī)育珠養(yǎng)殖。由于外套膜比較薄，容易插破，不適宜插大核來培育大顆粒的珍珠。相比之下內(nèi)臟團分布空間很大，且具有珍珠生物礦化所需的生化條件。應用2魚類病毒學

用細胞分離、檢測鑒別病毒什么是病毒？視頻資料病毒對水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害迄今已發(fā)現(xiàn)的近60種魚類病毒。其中有9種病毒對漁業(yè)生產(chǎn)有嚴重的影響,它們是:①雙RNA病毒科的傳染性胰壞死病毒②虹彩病毒科的虹彩病毒③棒狀病毒科的雙鏈DNA棒狀病毒④呼腸病毒科的草魚呼腸病毒⑤野田病毒科的野田病毒⑥彈狀病毒科的鯉魚春季病毒血癥病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒和白斑狗魚幼魚彈狀病毒。傳染性胰壞死病毒：10～12℃死亡率可高達80～100%。胰腺壞死，胰腺泡、胰島及所有的細胞幾乎都發(fā)生異常，多數(shù)細胞壞死，核固縮、核碎裂十分顯著。病魚游動失調(diào)，常作垂直回轉(zhuǎn)游動，不久便沉入水底，伺歇片刻后又重復以上游動，直至死亡。虹彩病毒：死亡率從30%(成魚階段)到100%(幼苗階段)不等。感染的硬骨魚類包括鱸形目、鰈形目、鱈形目和鲀形目等4目近百種海水、淡水魚類。出血性敗血癥病毒：許多鮭鱒魚對其敏感。傳染性強，死亡率可達80%。有急性型(體黑、眼突出，肌肉、脂肪組織、口腔和鰾出血，死亡率高，常見初期)、慢性型(動作遲緩，貧血，低死亡率，常見中期)和神經(jīng)型(運動失調(diào)，螺旋狀旋轉(zhuǎn)游動，緩慢死亡，流行末期)3種類型目前無有效治療方法。病毒感染環(huán)境因素免疫系統(tǒng)蝦類病毒：桿狀病毒(MBV)、黃頭病毒(YHV）、白斑綜合癥病毒(WSSV)、皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV）、蝦彈狀病毒。在體外原代培養(yǎng)的斑節(jié)對蝦類淋巴細胞中進行了斑節(jié)對蝦桿狀病毒(MBV)、白斑綜合癥病毒(WSSV)和黃頭病毒的增殖,獲得成功。用凡納濱對蝦類淋巴原代細胞接種黃頭病毒(YHV),出現(xiàn)了CPE。致細胞病變效應（cytopathiceffect，CPE）：指病毒在宿主細胞內(nèi)大量增殖，導致細胞病變甚至死亡的現(xiàn)象。具體而言，體外組織細胞培養(yǎng)時，溶細胞病毒在易感細胞內(nèi)大量復制增殖導致細胞死亡或細胞出現(xiàn)變圓、脫落、聚集等現(xiàn)象，稱為致細胞病變效應。致細胞病變效應細胞培養(yǎng)分離病毒斜帶石斑魚的腦組織細胞系GBC1和GBC4并用于病毒敏感性實驗,發(fā)現(xiàn)前者對于神經(jīng)壞死病毒(GNNV)高度敏感,但對于花鱸虹彩病毒(GSIV)不敏感而后者的結(jié)果正好相反。玳瑁石斑魚腦、鰓、心臟3個細胞系,進行了病毒及細胞毒素敏感性的實驗,發(fā)現(xiàn)3種細胞系對于不同病毒和毒素的敏感性存在明顯的差異。病毒對細胞具有選擇性病毒的培養(yǎng)分離實例-----魚源彈狀病毒的分離魚類彈狀病毒是一類能使多種魚出現(xiàn)高致死率的病毒病原體，其感染宿主譜廣、普遍存在、嚴重危害各種淡水和海水魚。迄今報道感染魚類的彈狀病毒已有20多種，包括導致鯉科魚類大規(guī)模爆發(fā)鯉春病毒血癥的鯉春病毒血癥病毒、引起虹鱒、鮭等患出血性疾病的病毒性出血性敗血癥病毒、引起鱒魚和太平洋大馬哈魚為主的急性、全身性的嚴重傳染病的傳染性造血器官壞死病毒、以及牙鲆彈狀病毒、烏鱧彈狀病毒、鱖魚彈狀病毒、胭脂魚彈狀病毒、石鰈魚彈狀病毒等。草魚腎細胞系(CIK)肥頭鯉細胞系(FHM)鯉上皮細胞系(EPC)草魚腦細胞(CIB)草魚鰾細胞(GSB)錦鯉吻端細胞系(KPC)劍尾魚胚胎細胞系(SFC)鱖腦細胞系(SCC)所用細胞系及代號無菌采取病魚的鰾、肝、腎、脾，加入含雙抗的滅菌的PBS中制成1∶1的勻漿液，在－20℃凍融3次后，組織勻漿液依次經(jīng)2000、5000和10000r/min，每次離心10min，去沉淀，上清液經(jīng)濾膜孔徑為0.22μm的微孔濾器過濾除菌分別接種密度為80%~90%的單層FHM、EPC、CIK、GIB、GSB、KPC、SFC和SCC細胞，室溫下吸附1h，吸棄病毒液，加入與培養(yǎng)液等量的維持液(含3%FBS的M199)，28℃恒溫培養(yǎng)，每日觀察細胞形態(tài)。病毒傳代時，將病毒細胞培養(yǎng)物反復凍融2～3次。如何檢測鑒別病毒？直接檢測免疫檢測分子生物學檢測1、電子顯微鏡；2、病毒包涵體檢查1、酶免疫技術(shù)；2、熒光免疫技術(shù)3、單克隆抗體技術(shù)1、核酸雜交；2、PCR、RT-PCR技術(shù)；一、電子顯微鏡檢測技術(shù)研究病毒形態(tài)、鑒定診斷病毒病

檢測不能在體外培養(yǎng)的病毒，如輪狀病毒、星狀病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用電鏡最先發(fā)現(xiàn)的——能進一步發(fā)現(xiàn)新的病毒和病毒病。彈狀病毒的電子顯微鏡觀察標本的制備濃縮標本方法：①超速離心離心的時間和速度取決于病毒顆粒的大小和離心機轉(zhuǎn)頭的半徑，一般是30min到3h．沉淀的樣本用滅菌蒸餾水洗后再放到銅網(wǎng)上；②超過濾法用于分子篩的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為10000；③接種細胞接種細胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；④免疫凝集如有特異抗血清，且病毒已知，也可用該法濃縮病毒1、正染法（超薄切片法、病組織）將細胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀察病毒顆粒，通常1~2d完成。操作復雜、費時，但樣品可長期保存，可觀察病毒粒子形態(tài)與發(fā)生過程。2、負染法直接將病毒懸液(也可用細胞)滴在銅網(wǎng)上，用重金屬(通常用磷鎢酸)進行染色，觀察病毒顆粒，10-20min可出結(jié)果。原理：負性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，由于負性染料含重金屬使電子束不能穿透，病毒顆粒具有亮度，在周圍暗背景上顯示亮區(qū)——較正染法顯示的圖像清晰，可顯示病毒的結(jié)構(gòu)。缺點：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒難于鑒別。3、投影技術(shù)采用幾種電鏡技術(shù)觀察病毒粒子的形態(tài)Orfvirus：口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎)Ebolavirus埃博拉病毒（正染技術(shù)）Vacciniavirus痘苗病毒（投影技術(shù)）負染技術(shù)彩色電子顯微照片。它顯示出H5N1型禽流感病毒（金黃色）在MDCK細胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動狀態(tài)二、病毒的免疫檢測1、熒光免疫法(IF)2、酶免疫法（ELISA）3、單克隆抗體技術(shù)1、免疫熒光法(IF)熒光（fluorescence）熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當其回復至基態(tài)時，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。

熒光壽命定義:熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時所用的時間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。

熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標記FAT、流式細胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍色）雙標記或多標記FATEu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定熒光物質(zhì)：一類能吸收激發(fā)光的光能而發(fā)射熒光的物質(zhì)。

電子的躍遷熒光抗體技術(shù)的基本原理

熒光素標記抗體與切片中組織細胞抗原反應，洗滌分離后熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復合物及其部位，對組織細胞抗原進行定性和定位檢測，或?qū)ψ陨砜贵w進行定性和滴度測定。抗體要求

高特異性高親和力經(jīng)純化提取IgG

熒光抗體的制備有能與蛋白質(zhì)形成共價健的化學基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。結(jié)合后，仍保持較高的熒光效率。熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。標記方法簡單、安全無毒。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。熒光素要求抗體的熒光素標記標記原理:利用抗體蛋白的自由氨基與FITC的異硫氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITC結(jié)合成熒光抗體。標記方法:

攪拌法：適于標記體積較大、蛋白含量較高的抗體。標記時間短，熒光素用量少，但有非特異性染色。

透析法：適于標記樣品量少，蛋白含量低的抗體。標記比較勻，非特異染色較低。去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過濾去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子交換層析法去除交叉反應或非期望抗體：動物肝粉吸收或固相抗原吸收熒光抗體的純化直接法直接熒光抗體染色法示意圖熒光素標記的特異性抗體直接與相應抗原反應。熒光抗體染色間接法特異性抗體與相應抗原反應，熒光素標記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

間接熒光抗體染色法示意圖熒光顯微鏡利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。

主要試劑:

酶標記的抗體或抗原酶標物特點：

免疫學活性酶對底物的催化活性抗原抗體反應的特異性+酶促催化反應的高敏感性2、酶免疫法（ELISA）特點：靈敏度高、特異性強、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。原理：酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應酶對底物的顯色反應對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析

酶免疫技術(shù)的核心部分

酶結(jié)合物（conjugate）酶標記物通過化學反應或免疫學反應，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相異相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片中的抗原抗體反應

液體標本中抗原或抗體的定性和定量(ELISA)三個部分：免疫反應酶與底物反應檢測方法的建立ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）高純度的抗原、高親和力的抗體高活性、高純度的標記用酶有效的交聯(lián)方法制備高質(zhì)量的酶標記物選用適宜的酶/底物系統(tǒng)底物顯色定性或定量的分析原理包被反應加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復合物與未結(jié)合的分離1234固相的抗原或抗體

酶標記物

酶反應的底物

雙抗體夾心法（doubleantibodysandwich-ELISA）方法：用已知抗體包被，加入待檢血清病毒樣品，再加酶標抗體，加底物顯色應用：二價或二價以上的較大分子抗原測定(乙型肝炎表面抗原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的測定。ELISA檢測抗原的方法1、已知抗體包3、加酶標抗體4、加酶作用的底物2、加待檢物4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包2、加待檢物無抗3、加酶標抗體+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY陰性對照洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色（一）固相載體聚苯乙烯特點：吸附蛋白能力強，保留其免疫活性形狀：小試管、小珠、微量ELISA板

（二）抗原和抗體高純度的抗原高效價的抗體固相酶免疫測定的技術(shù)要點

（三）酶和底物的選擇標記酶的要求：

活性高性質(zhì)穩(wěn)定專一性強酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量方法敏感，重復性好，簡單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉辣根過氧化物酶(HRP)糖蛋白HRP的常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTSOPD反應后顯橙黃色，加酸終止反應后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應后顯藍色，加酸終止反應后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應用最廣泛的底物。堿性磷酸酶（ALP）菌源性ALP腸粘膜ALPβ-半乳糖苷酶（β-Gal）其他的酶大腸埃希氏菌

ALP的底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)ALP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

β-Gal的底物

4-甲基傘酮基β-D-半乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高強度熒光物，用熒光計測量?？乖蠹兌雀?，抗原性完整抗體需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。

酶標抗體制備方法要求制備方法過碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標記抗體或抗原

戊二醛交聯(lián)法酶標記物質(zhì)量較均一純化標記完成后應除去反應液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度

抗體是從何來的？傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)方法及缺陷是什么？

抗體是機體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。3、單克隆抗體技術(shù)

（１）B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。（２）動物體內(nèi)的B淋巴細胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。（３）每一個淋巴細胞只能產(chǎn)生一種抗體。B淋巴細胞有什么特點？單克隆抗體的特點？

由單個B淋巴細胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產(chǎn)生的化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。

特異性強、靈敏度高

單克隆抗體制備過程？1、單克隆抗體：2、特點：單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體單克隆抗體的應用1、診斷試劑（病原微生物、腫瘤抗原檢測）2、蛋白質(zhì)提純3、腫瘤導向治療技術(shù)（生物導彈）動物細胞融合技術(shù)

細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合

受精作用誘導細胞融合的方法用

誘導動物細胞融合過程細胞核病毒顆粒滅活的病毒細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接雜種細胞融合細胞的篩選方法常用的克隆化培養(yǎng)方法1、半固體平板培養(yǎng)法2、有限稀釋法3、顯微鏡操作法4、蓋片分離法有限稀釋法樣品處理富集獲得病毒的核酸序列是描述病毒特征的關鍵。檢測分子生物學方法三、病毒的分子生物學檢測1、核酸雜交技術(shù)2、PCR和RT-PCR技術(shù)同源性：從分子水平講則是指兩個核酸分子的核苷酸序列間的相似程度。1、核酸雜交技術(shù)DNA的變性與復性DNA變性：DNA雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級鍵，能量較低，易受破壞，在某些理化因素作用下，DNA分子互補堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即為DNA變性。DNA復性：變性DNA在適當條件下，兩條互補鏈可重新恢復天然的雙螺旋構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱為復性。核酸雜交：DNA單鏈之間、RNA單鏈之間、一條DNA和一條RNA鏈之間只要存在序列互補配對區(qū)域，不管是整條鏈互補，還是部分序列互補，即可重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，即為核酸分子雜交。瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點為pH=2-2.5，在常規(guī)的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，具有電荷效應和分子篩效應，但主要為分子篩效應。瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：（1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。（2）DNA分子的構(gòu)象。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動得最快，而開環(huán)狀DNA移動最慢。（3）電壓。在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。（4）離子強度影響。電泳緩沖液的組成及離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水），電導率最小，DNA幾乎不移動；在高離子強度，則電導率很高并明顯產(chǎn)熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。溴化乙錠(Ethidiumbromide,EB)能插入DNA分子中形成復合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發(fā)射熒光，而且熒光的強度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標準樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。Southern印跡雜交

使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由英國人EdwinMellorSouthern于1975年首先設計出來的，故又叫Southernblot。Southern雜交的主要步驟（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片待測DNA樣品的制備、酶切待測DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備Southern雜交雜交結(jié)果的檢測SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片利用非放射性探針檢測核苷酸Northern雜交*1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。也稱為Northern印跡（NorthernBlot），用以檢測某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表達量。*因這種方法與Southernblot雜交技術(shù)十分類似，與DNA的雜交（Southern雜交）相對應，被趣稱為Northern雜交。Northern印跡雜交1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑(甲醛、尿素、甲酰胺等)保持RNA處于變性狀態(tài)。避免單鏈RNA自身形成高級結(jié)構(gòu)和自身降解

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理。原位雜交*細胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交。特點能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究不需從組織或細胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)原位雜交過程：（1）組織或細胞的固定（2）組織細胞雜交前的預處理（3）探針的選擇與標記探針的長度一般為50~300bp

（4）雜交雜交溫度約為50℃（5）雜交結(jié)果檢測病毒性神經(jīng)壞死病毒病(viralnervousnecrosis,VNN)是石斑魚育苗過程的重大病害之一,該病原體為二十面體,無囊膜,直徑25~30nm的RNA病毒,屬于諾達病毒科。發(fā)病癥狀為魚不正常游動,魚鰾脹氣腫大,體色變深,厭食,可導致魚苗的大量死亡。致病性很強,對石斑魚的養(yǎng)殖影響嚴重,一旦爆發(fā),難以控制。人工感染組織切片核酸探針的制備染色和原位雜交檢測用標記有地高辛的426bp的病毒核酸片段與組織切片上病毒RNA進行雜交。雜交陽性物質(zhì)為紫褐色顆粒。BCIP/NBT紫藍色沉淀Dig（地高辛）抗Dig抗體堿性磷酸酶核酸分子雜交原理示意圖常用探針類型

①人工合成寡核苷酸探針②基因組DNA探針③cDNA探針④RNA探針探針標記物①放射性標記物

32P高放射性半衰期14.3d

35S放射性較弱半衰期87.1d

3H放射性弱半衰期12.35a②非放射性標記物

半抗原：生物素、地高率配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學發(fā)光探針：標記物與某種底物反應發(fā)光，如生物素酰化的堿性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光

理想探針標記物應具備的特性

高度靈敏性不影響堿基配對的特異性不影響探針分子的主要理化性質(zhì)對酶促反應活性無影響或影響不大檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性2、PCR技術(shù)聚合酶鏈式反應（PCR）是目前比較快速、敏感、特異的檢測手段，已被廣泛應用在病毒核酸檢測方面。

DNA的復制方向

PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán)。通過多次循環(huán)反應，使目的DNA序列得以迅速擴增。PCR的原理PCR步驟：將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93～94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補結(jié)合；耐熱的DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’→3’方向延伸，合成DNA的新互補鏈。如此循環(huán)進行，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴增，經(jīng)過25～30個循環(huán)后，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106～107倍。PCR的結(jié)果---電泳圖反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應RT-PCR

RT-PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，它是以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA。這一過程與一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶?；具^程是以dNTP為底物，以RNA為模板，按5’→3’方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA(cDNA)，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導的DNA合成，然后將DNA進行PCR擴增。應用3疫苗的制備免疫系統(tǒng)與免疫應答（一）抗原凡能刺激機體免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生抗體或致敏免疫活性細胞（淋巴細胞），并能與之發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)統(tǒng)稱“抗原”。具有上述2種特性的物質(zhì)稱為完全抗原。（二）抗體抗體是由抗原刺激機體免疫系統(tǒng)后產(chǎn)生，并能與相應抗原發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。T淋巴細胞T淋巴細胞是胸腺依賴性淋巴細胞的簡稱。由骨髓中多功能干細胞發(fā)育分化，并成熟于胸腺。它是一個復雜的群體，分為不同亞群。各亞群在形態(tài)學上并無明顯標記，但不同亞群淋巴細胞分泌不同細胞因子。B淋巴細胞B淋巴細胞在骨髓中分化成熟，故又稱為骨髓衍生細胞。B淋巴細胞在接受到APC傳遞的抗原信息后，在Th和巨噬細胞分泌的細胞因子作用下，使B淋巴細胞活化，分化為成熟的漿細胞產(chǎn)生抗體，1個漿細胞每秒鐘能夠分泌超過2000個抗體分子。抗原免疫應答什么是疫苗？疫苗是將病原微生物如細菌、病毒等及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或轉(zhuǎn)基因等方法制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑。疫苗刺激機體免疫系統(tǒng)對某種病原微生物處于高度戒備狀態(tài)疫苗的發(fā)展歷史

①古典疫苗時期：牛痘苗、狂犬病疫苗

②培養(yǎng)疫苗時期：脊髓灰質(zhì)炎疫苗、卡介苗

③基因工程疫苗時期：乙型肝炎基因工程疫苗疫苗的種類滅活疫苗弱毒疫苗基因工程疫苗重組亞單位疫苗DNA疫苗基因缺失疫苗基因突變疫苗活載體疫苗傳統(tǒng)疫苗成本低、無致病性、適用廣

滅活疫苗（inactivatedvaccine）：又稱死疫苗，是用化學或物理的方法，將具有感染性的完整的病原微生物殺死，使其失去傳染性而保留抗原性而成。

一、滅活疫苗百日咳、乙型腦炎、流行性腦脊髓膜炎、狂犬病、傷寒、鉤體病、甲型肝炎、鼠疫、流感、脊髓灰質(zhì)炎等疫苗。二、減毒活疫苗（弱毒疫苗）減毒活疫苗（live-attenuatedvaccine）：用人工誘變或從自然界篩選出的毒力高度降低或無毒的活的病原微生物制成的疫苗。可模擬自然發(fā)生隱性感染，誘發(fā)理想的免疫應答而又不產(chǎn)生臨床癥狀。

脊髓灰質(zhì)炎、結(jié)核病、麻疹、風疹疫苗、腮腺炎等疫苗。

●優(yōu)點：能誘發(fā)全面、穩(wěn)定、持久的體液、細胞和粘膜免疫應答；一般只須接種一次；可采用口服、噴鼻或氣霧途徑免疫。

●缺點：有效期短和熱穩(wěn)定性差，運輸、保存條件要求較高；回復突變危險；使用范圍相對窄。

減毒活疫苗優(yōu)缺點1、基因缺失活疫苗（genedeletedlivevaccine）：采用分子生物學技術(shù)，去除與毒力或毒力相關基因片段，使病原微生物毒力減低或喪失。用缺失突變毒株制成的疫苗。與自然突變株（多為點突變毒株）相比，基因缺失活疫苗具有突變性狀明確、穩(wěn)定、不易發(fā)生毒力返祖的優(yōu)點。

三、基因工程疫苗對于某些抗原性弱、易發(fā)生免疫逃避的病原體，常規(guī)疫苗往往難以獲得有效的免疫應答及保護性。2、亞單位疫苗對于一些免疫保護機制不清、可能誘導免疫病理反應、有潛在致腫瘤作用的病毒，以及不易培養(yǎng)的病原體，則難以用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)疫苗。

亞單位疫苗：亞單位疫苗是應用某些化學試劑裂解細菌或病毒,驅(qū)除病原微生物中有害成分和無用的成分,保留其中一種或幾種主要抗原成分的一類疫苗。不含病原體核酸，選用能誘發(fā)宿主產(chǎn)生中和抗體的微生物蛋白或表面抗原而制成。

●白喉類毒素、破傷風類毒素

●流感嗜血桿菌莢膜多糖、腦膜炎球菌莢膜多糖

●流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶

●人乳頭瘤病毒

優(yōu)點：除去了病原體中與誘發(fā)保護性免疫無關或有害成分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明顯增強而穩(wěn)定，可靠性提高，對機體引起的不良反應小。

缺點：需要選用佐劑；不能誘發(fā)細胞免疫和黏膜免疫。

將病原體中能誘導保護性免疫應答的目的抗原編碼基因克隆后，插入適當?shù)脑嘶蛘婧吮磉_載體質(zhì)粒；

再將重組質(zhì)粒導入細菌、酵母菌或哺乳動物細胞中高效表達目的基因；

分離、提取、純化目的蛋白而制成。

基因重組亞單位疫苗

(geneticengineeringsubunit

vaccine)活載體疫苗：又稱重組載體疫苗，是將有效的目的抗原的編碼基因?qū)牖钶d體（無或弱毒的細菌或病毒株）中，構(gòu)建重組菌株；目的基因可隨重組菌株在宿主體內(nèi)的增殖而大量表達，從而誘發(fā)相應的免疫保護作用。

3、活載體疫苗載體：腺病毒、牛痘病毒、金絲雀痘病毒、傷寒沙門菌減毒株、卡介苗、乳桿菌、枯草芽孢桿菌芽孢等。

病原體：乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾桿菌等?；钶d體疫苗：又稱重組載體疫苗，是將有效的目的抗原的編碼基因?qū)牖钶d體（無或弱毒的細菌或病毒株）中，構(gòu)建重組菌株；目的基因可隨重組菌株在宿主體內(nèi)的增殖而大量表達，從而誘發(fā)相應的免疫保護作用。

3、活載體疫苗載體：腺病毒、牛痘病毒、金絲雀痘病毒、傷寒沙門菌減毒株、卡介苗、乳桿菌、枯草芽孢桿菌等。

病原體：乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾桿菌等。將白斑綜合征病毒Vp26基因與枯草芽孢桿菌的衣殼蛋白CotC基因融合，從而將Vp6蛋白展示在芽孢表面制成口服疫苗。該疫苗包被飼料免疫南美對蝦后能夠起到100％的免疫保護作用。1990年，Wolf等首次發(fā)現(xiàn)，給小鼠肌肉注射裸露質(zhì)粒DNA后，質(zhì)粒攜帶的基因可被肌細胞攝取并在其中表達，還可誘生特異性免疫應答。

4、核酸疫苗核酸疫苗具有構(gòu)建容易、生產(chǎn)方便、表達穩(wěn)定及可誘發(fā)全面的免疫應答等特點，在抗感染、抗腫瘤免疫及疾病的預防等方面具有廣闊的應用前景，被譽為疫苗的“第三次革命”。

核酸疫苗：又稱DNA疫苗（基因疫苗），是將一種或多種目的抗原的編碼基因克隆到真核質(zhì)粒表達載體上；再將重組質(zhì)粒直接注入到體內(nèi)，在宿主細胞內(nèi)表達目的蛋白，誘發(fā)特異性免疫應答。

目前進入臨床試驗的有HIVDNA疫苗和瘧疾DNA疫苗和流感DNA疫苗。

免疫機制：局部注射的核酸（重組質(zhì)粒DNA）被周圍的細胞（如黏膜上皮細胞、抗原提呈細胞）攝取后，進入核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄，并在胞質(zhì)中翻譯成目的蛋白。

目的蛋白被蛋白酶復合體降解成含有表位的抗原肽，可作為：

●“內(nèi)源性抗原”：與MHCⅠ類分子結(jié)合，誘發(fā)CTL介導的細胞免疫應答。

●“外源性抗原”：與MHCⅡ類分子結(jié)合，誘發(fā)偏向Th1型免疫應答。目的蛋白亦可通過細胞分泌或細胞破裂的方式進入組織間，以天然折疊形式激活B淋巴細胞而產(chǎn)生抗體。DNA疫苗接種后，體內(nèi)僅表達pg～ng水平的外源蛋白，但能誘發(fā)強而持久的細胞免疫和體液免疫應答。核酸疫苗的構(gòu)建與免疫

①目的基因的選擇：側(cè)重于免疫原性，即所表達的目的蛋白刺激機體免疫應答的能力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T細胞抗原表位，是保證核酸免疫有效的先決條件。

核酸疫苗所選擇的目的基因應盡量避免有害基因成分，特別是病毒或腫瘤的核酸免疫。

②載體的選擇：構(gòu)建DNA疫苗的質(zhì)粒通常是非復制型的真核表達質(zhì)粒，能高水平地表達目的基因。

重組質(zhì)?？煞譃閮蓚€部分：

●

轉(zhuǎn)錄部分：由啟動子、插入的目的抗原cDNA和polyA終止子組成，指導目的蛋白在體內(nèi)表達，誘發(fā)特異性免疫應答。

●

佐劑部分：CpG基序。③啟動子的選擇：質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)表達外源性蛋白的水平與調(diào)控DNA表達的啟動子關系密切。表達水平的不同又直接影響免疫應答的強度和持續(xù)性。

核酸疫苗與傳統(tǒng)疫苗的比較傳統(tǒng)免疫所使用的抗原一般是滅活病原體、減毒的活病原體或病原體的亞單位蛋白。

核酸疫苗僅僅是病原體某種抗原的基因片段，