核酸分子雜交-(1) - 副本

1分子生物學

MolecularBiology核酸的分子雜交NucleicAcidHybridizationDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology2ContentofTable一、核酸的檢測二、核酸分子雜交技術的原理三、核酸探針的制備四、核酸探針的標記五、核酸分子雜交技術3一、核酸的檢測包括DNA的質量、大小、純度檢測4

凝膠電泳技術樣品的物理性質分子大小、電荷、空間構型支持物介質瓊脂糖，100-60000bp,

聚丙烯酰胺，1-500bp電場強度，5V/cm緩沖液離子強度

TAE,TBE,TPE5操作過程6DNA分子大小的檢測NEB，1KbDNALadder：3kb=62.5ng，1kb=21.0ngPCR產物3Kb1Kb7一、核酸分子雜交技術的原理

有互補特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時，其相應同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結構。如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合適的標記物（如放射性同位素、生物素等）予以標記，當作探針（probe),

與變性后的單鏈基因組DNA或RNA等進行雜交。用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學等技術）把標記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列的拷貝數及表達豐度等。

8910DNA變性是指核酸雙螺旋堿基對的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，從而使核酸的天然構象和性質發(fā)生改變。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性。11溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結構，變性后代之以柔軟而松散的無規(guī)則單股線性結構，DNA粘度因此而明顯下降。溶液旋光性發(fā)生改變。變性后整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。增色效應。指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應。在DNA雙螺旋結構中堿基藏入內側，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產生增色效應。12復性指變性DNA在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象,它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻后即可復性,此過程稱之為"退火"(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成。DNA的復性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。13

應用：1）檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關系；2）用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數及表達豐度。14二、核酸探針的制備探針（Probe):

一段帶有檢測標記的與目的基因或目的DNA特異互補的已知核苷酸序列。15理想的探針1.要加以標記、帶有示蹤物，便于雜交后檢測和鑒定雜交分子。2.應是單鏈，若為雙鏈用前需要先行變性為單鏈。3.具有高度特異性，只與靶核酸序列雜交，不與樣本中存在的其它核酸雜交。4.探針長度一般是十幾個堿基不等，小片段探針較大片段探針雜交速率快。5.作為探針的核苷酸序列要選取基因編碼序列，避免用內含子及其它非編碼序列。6.標記的探針應具有高靈敏度、穩(wěn)定，標記方法簡便、安全。16(一）探針的分類據制備方法及核酸性質不同，可分為：

基因組DNA探針（genomicprobe）

cDNA探針（cDNAprobe）

RNA探針（RNAprobe）寡核苷酸探針（oligonucleotideprobe)據探針標記物的類型不同：同位素標記的探針非同位素標記的探針17

cDNA（complementaryDNA）是指互補于mRNA的DNA分子。這種DNA探針不含有內含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。2、cDNAprobe18

采用基因克隆或體外轉錄的方法獲得。有些病毒的基因組是RNA，分離后經適當標記可制成RNA探針。3、RNAprobe19三、核酸探針的標記

為確定探針是否與相應基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結合部位獲得可識別的信號。2021核酸分子雜交信號的檢測放射性同位素標記探針：

放射自顯影。

非放射性同位素標記探針：

偶聯反應+顯色反應。22四、核酸分子雜交技術

核酸分子雜交

固相雜交液相雜交印跡雜交原位雜交固相雜交：結合于某種固相支持物上的待測樣品與溶解于雜交液中的探針進行的雜交。包括膜上印跡雜交、原位雜交。液相雜交：待測樣品和探針均溶于液體中進行雜交反應。23

此技術由Southern1975年首先設計。被檢測對象為DNA。

（一）Southern印跡雜交2425帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術流程2627Northernblot28

5、Southern雜交

⑴、預雜交：封閉膜上能與DNA結合的位點預雜交液為不含DNA探針的雜交液。

⑵、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA

雜交，雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交。

⑶、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結合的DNA。31.（20分）圖1是一個常染色體遺傳病的家系系譜。致病基因（a）是由正常基因（A）序列中一個堿基對的替換而形成的。圖2顯示的是A和a基因區(qū)域中某限制酶的酶切位點。、分別提取家系中Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1的DNA，經過酶切、電泳等步驟，再用特異性探針做分子雜交，結果見圖3。

（1）Ⅱ2的基因型是_______________。（2）一個處于平衡狀態(tài)的群體中a基因的頻率為q。如果Ⅱ2與一個正常男性隨機婚配，他們第一個孩子患病的概率為_________。如果第一個孩子是患者，他們第二個孩子正常的概率為_____________。（3）研究表明，世界不同地區(qū)的群體之間，雜合子（Aa）的頻率存在著明顯的差異。請簡要解釋這種現象。①_____________；②____________。（4）B和b是一對等位基因。為了研究A、a與B、b的位置關系，遺傳學家對若干基因型為AaBb和AABB個體婚配的眾多后代的基因型進行了分析。結果發(fā)現這些后代的基因型只有AaBB和AABb兩種。據此，可以判斷這兩對基因位于_________染色體上，理由是_______。（5）基因工程中限制酶的作用是識別雙鏈DNA分子的_________，并切割DNA雙鏈。（6）根據圖2和圖3，可以判斷分子雜交所用探針與A基因結合的位置位于_______。【答案】（1）AA或Aa（2）

（3）不同地區(qū)基因突變頻率因環(huán)境的差異而不同不同的環(huán)境條件下，選擇作用會有所不同（4）同源基因AaBb個體只產生Ab、aB兩種類型配子，不符合自由組合定律（5）特定核苷酸序列（6）酶切位點①與②之間32（四）斑點印跡雜交和狹線印跡雜交Dotblottingandslotblotting原理：是將被檢標本的RNA或DNA變性后直接點樣吸附于硝酸纖維膜上，然后用標記探針與之雜交。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。

優(yōu)點：用于基因組中特定基因及其表達的定性及定量分析，方法簡便、快速、靈敏、樣品用量少。缺點：不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。3334HPVFISH35菌落原位雜交

菌落原位雜交是將細菌從培養(yǎng)平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。3637菌落原位雜交下圖為通過DNA分子雜交鑒定含有某特定DNA的細菌克隆示意圖。下列敘述正確的是A根據培養(yǎng)皿中菌落數可以準確計算樣品中含有的活菌實際數目B外源DNA必須位于重組質粒的啟動子和終止子之間才能進行復制C重組質粒與探針能進行分子雜交是因為DNA分子脫氧核糖和磷酸交替連接D放射自顯影結果可以顯示原培養(yǎng)皿中含有特定DNA的細菌菌落位置【答案】D【解析