一DNA的生物合成

第一節(jié)DNA生物合成的基本規(guī)律第二節(jié)DNA的生物合成第三節(jié)DNA的損傷與修復(fù)第四節(jié)DNA重組本章重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：DNA復(fù)制的基本過程。難點(diǎn)：DNA的半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制。DNA的核苷酸順序信息編碼著細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過酶影響所有細(xì)胞成分的合成，決定各種生物的大小、形狀和功能。DNA在生物大分子中占有中心的位置大腸桿菌遺傳圖第一節(jié)DNA復(fù)制的一般原理復(fù)制的方式—半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)

需要引物(primer)一、DNA復(fù)制是半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)概念：DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基互補(bǔ)配對原則（A:T,G:C），由DNA聚合酶催化合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈來自親代，另一股單鏈則是新合成的。兩個(gè)子代DNA和親代DNA堿基序列完全一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。

DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson

和F.Stahl所完成的用同位素示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)實(shí)驗(yàn)所證明。DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性，是生物保持遺傳穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。半保留復(fù)制的意義原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從原點(diǎn)

(復(fù)制的起始點(diǎn)，origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉(replicationforks)，稱為雙向復(fù)制。

二.DNA復(fù)制是固定起點(diǎn)的雙向復(fù)制DNA復(fù)制的方式大腸桿菌環(huán)狀

DNA復(fù)制時(shí)所形成的θ結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)oriC復(fù)制叉的推進(jìn)復(fù)制叉起始點(diǎn)，原點(diǎn)(O)，富含AT,產(chǎn)生瞬時(shí)單鏈起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’復(fù)制子真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰復(fù)制原點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是能夠獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。真核生物是多復(fù)制子的復(fù)制。三.DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)先導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而隨后鏈不連續(xù)復(fù)制，稱為半不連續(xù)復(fù)制或復(fù)制的半不連續(xù)性。四.需要引物DNA聚合酶不能從頭合成一段新鏈，參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’-端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。

第二節(jié)DNA的生物合成一、合成的反應(yīng)通式及反應(yīng)方向目錄DNA聚合酶反應(yīng)通式：

(dNMP)n

+

dNTP→(dNMP)n+1

+

PPi

反應(yīng)方向：5’3’參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DDDP或DNA-pol模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質(zhì)因子二、原核生物參與DNA聚合反應(yīng)的酶類及蛋白質(zhì)（DNA復(fù)制酶系統(tǒng)）一）DNA聚合酶二）拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)三）DNA解鏈酶(DNAhelicase)四）引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)五）DNA連接酶（DNAligase）六）單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)一）DNA聚合酶全稱：DNA依賴的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol功能：DNA聚合酶活性，合成DNA鏈。

DNA外切酶活性，DNA錯(cuò)配后的修復(fù)，或切去RNA引物。5′CGCTTCAGGATA3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

35外切酶活性

53外切酶活性?能切除突變的DNA片段和RNA引物。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對，并將其水解。核酸外切酶活性目錄原核生物的DNA聚合酶大腸桿菌中相繼發(fā)現(xiàn)了三種主要的DNA聚合酶：DNA-polⅠ：5’-3’聚合酶活性，DNA合成。3’-5’外切酶活性，錯(cuò)配修復(fù)。5’-3’外切酶活性，在細(xì)胞DNA復(fù)制、重組和修復(fù)中起到修繕工的作用。DNA-polⅡ：表現(xiàn)出高度專一于DNA損傷修復(fù)功能。DNA-polⅢ：是大腸桿菌DNA復(fù)制中主要的酶。編輯校對DNA的主要復(fù)制酶參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補(bǔ)空隙功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞≥10≥4個(gè)1亞基數(shù)--+5外切酶活性+++5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶多聚化速度（核苷酸/秒）16-20反應(yīng)速度慢持續(xù)性低40250-1000DNA-polⅢ：由十種亞基22個(gè)組分構(gòu)成，其中α、ε、θ3個(gè)亞基組成核心酶，α亞基具有5‘→3’聚合DNA的酶活性；而ε亞基具有3‘→5’外切酶的活性，與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)，θ亞基可能與核心酶的組裝有關(guān)。每個(gè)亞基至少有一個(gè)拷貝。2個(gè)β亞基構(gòu)成滑動(dòng)鉗蛋白，幫助核心酶與模板結(jié)合。其它多個(gè)亞基組成滑動(dòng)鉗裝載復(fù)合物。DNA聚合酶Ⅲ全酶二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

又稱DNA松弛酶（DNA-relaxingenzyme)，簡稱Top，是一類催化同一DNA分子中不同超螺旋狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變的酶。10

8局部解鏈后作用特點(diǎn)：既能水解、又能連接磷酸二酯鍵分類：拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ:切斷DNA中的一條鏈，使DNA旋轉(zhuǎn),減少負(fù)超螺旋，再將切斷的單鏈連接起來。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ:可以切斷DNA的兩條鏈,引入負(fù)超螺旋。需消耗ATP.三）解鏈酶（unwindingenzyme），又稱解螺旋酶。用于解開DNA雙鏈，使埋藏在DNA雙螺旋分子中的堿基對暴露出來作為模板以合成新鏈。每解開一對堿基間的氫鍵，需消耗兩分子ATP。大多數(shù)解螺旋酶與隨后鏈模板DNA結(jié)合后沿5‘-3’運(yùn)動(dòng)。四）引發(fā)酶(primase)又稱引物合成酶：催化前導(dǎo)鏈和隨后鏈岡崎片段引物的合成。引發(fā)酶本質(zhì)上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3‘-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。與另外的6種蛋白質(zhì)組成引發(fā)體（primosome）才起作用。五）DNA連接酶催化一個(gè)DNA鏈的3-OH末端和相鄰DNA鏈的5-磷酸末端之間的連接，形成共價(jià)磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整鏈的酶。DNA連接酶連接堿基互補(bǔ)雙鏈中的單鏈缺口，不能催化兩條游離DNA鏈相連；只能催化兩條多核苷酸鏈連接，不能催化單核苷酸的延長。在復(fù)制、修復(fù)、重組及剪接中起最后缺口縫合的作用。DNA連接酶催化的條件是：①未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；②需一段DNA片段具有3’-OH，而另一段DNA片段具有5’-Pi基；③

需要消耗能量。六）單鏈結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。作用：①

穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；②

保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

一）復(fù)制的起始1.復(fù)制起始于原點(diǎn)oriC：E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC結(jié)構(gòu)由245個(gè)高度保守的堿基對組成，由3個(gè)13bp的重復(fù)順序和4個(gè)9bp的重復(fù)順序組成的保守序列，富含A、T。三、原核生物的DNA生物合成

三個(gè)階段：起始、延伸和終止。GATCTNTTNTTT成串排列的三個(gè)13bp序列共有序列/交感順序共有序列/交感順序TTATCCACA

DnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)9bp序列2.DNA復(fù)制的起始過程預(yù)引發(fā)：參與打開原點(diǎn)的預(yù)引發(fā)復(fù)合物（起始復(fù)合物）由至少9個(gè)不同的蛋白質(zhì)和酶組成。DnaA：大約20個(gè)，結(jié)合于原點(diǎn)的9bp重復(fù)序列，識(shí)別并變性原點(diǎn)13bp重復(fù)序列。DnaB(解螺旋酶):在DnaC參與下與局部解鏈的單鏈結(jié)合，沿解鏈方向繼續(xù)移動(dòng)，解開足夠用于復(fù)制的長度，并逐步置換出DnaA

，形成兩條單鏈DNA，創(chuàng)造兩個(gè)潛在的復(fù)制叉。DnaADnaB(解螺旋酶)SSB單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。拓?fù)洚悩?gòu)酶使DNA的超螺旋解開。引發(fā)：引物酶和解鏈模板上的DnaB

、DnaC蛋白，DNA復(fù)制起始區(qū)域結(jié)合成復(fù)合物引發(fā)體，在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子

引物3'HO5'引發(fā)酶二）復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。延長是指前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。

1.聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以親代DNA鏈為模板，從5’→3’方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長隨從鏈)和δ（延長領(lǐng)頭鏈）。順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為先導(dǎo)鏈或領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)。隨從鏈的合成另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨后鏈或隨從鏈(laggingstrand)。復(fù)制中的不連續(xù)片段（約1000個(gè)核苷酸）稱為岡崎片段(okazakifragments，1968)。

岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。2.鏈的延長：DNA聚合酶Ⅲ加入到引發(fā)體上，形成復(fù)制體，同時(shí)進(jìn)行先導(dǎo)鏈和隨后鏈的合成。隨后鏈的合成不斷需要引物，引物酶合成引物，DNA聚合酶Ⅲ合成新的岡崎片段。3.前導(dǎo)鏈和隨后鏈協(xié)同合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引發(fā)體引發(fā)體解旋酶解旋酶4.去除引物，填補(bǔ)缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ來水解去除RNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。5.連接岡崎片段：在DNA連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。

3‘5‘3‘5‘OHP原核生物基因是環(huán)狀DNA，大腸桿菌雙向復(fù)制的片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriter

E.coli

ori

terSV40三）復(fù)制的終止

在ter區(qū)內(nèi)存在７個(gè)ter序列（terA到terE），富含ＧＴ。其中terA、terＤ、terE位于復(fù)制叉匯合點(diǎn)的一側(cè)，terＣ、terＢ、terＦ、terＧ位于復(fù)制叉匯合點(diǎn)的另一側(cè)，它們分別是兩個(gè)復(fù)制叉終止的特異位點(diǎn)。每個(gè)復(fù)制叉必須越過另一個(gè)復(fù)制叉的終止位點(diǎn)才能到達(dá)自己的終止位點(diǎn)。Tus蛋白是解鏈酶的抑制劑，與ter位點(diǎn)結(jié)合終止復(fù)制。

DNA復(fù)制終止于ter區(qū)陷井區(qū)是終點(diǎn)利用物質(zhì)（Tus）的結(jié)合部位。Tus可以和每一個(gè)ter結(jié)合。一旦形成Tus-ter復(fù)合物，就可以通過阻止解旋酶解旋DNA來封閉復(fù)制叉的通路。Tus-ter復(fù)合物只捕獲來自一個(gè)方向（順時(shí)針或反時(shí)針）的復(fù)制叉。DNA分配和細(xì)胞分裂期DNA合成期G1G2SM四、真核生物的DNA生物合成

?細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。

合成機(jī)制與原核生物基本一致。間期間期復(fù)制所需蛋白質(zhì)的合成?多起點(diǎn)的雙向復(fù)制：真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。果蠅最大的染色體至少有３０００個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。?催化ＤＮＡ合成的DNA-pol不同。1、真核生物復(fù)制特點(diǎn)２．真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

具有引物酶活性和聚合酶活性，起始引發(fā)合成RNA引物及隨后鏈的復(fù)制。DNA-pol

ＤＮＡ修復(fù)作用。DNA-pol

線粒體DNA聚合酶。DNA-pol

具有聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。前導(dǎo)鏈和隨后鏈的復(fù)制。DNA-polε聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶至少有５種：第四節(jié)DNA損傷與修復(fù)DNADamageandRepair由于一些物理、化學(xué)或生物學(xué)因素的作用，或者由于生物體DNA復(fù)制過程出現(xiàn)異常均可引起DNA分子的損傷或改變。DNA核苷酸順序的永久性改變稱為突變。一、突變的意義1、突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)2、突變導(dǎo)致基因型改變3、突變導(dǎo)致死亡4、突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)生物進(jìn)化中突變是與遺傳相對立統(tǒng)一而普遍存在的現(xiàn)象。二、DNA損傷導(dǎo)致突變的幾種形式點(diǎn)突變：一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基的改變。插入突變：增加一個(gè)堿基對或多個(gè)堿基對的突變。缺失突變：缺失一個(gè)堿基對或多個(gè)堿基對的突變。倒位或轉(zhuǎn)位：DNA鏈重組使其中一段序列方向倒置、或從一處遷移到另一處。雙鏈斷裂:會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。沉默突變：即同義突變，突變雖然替換了堿基，但氨基酸順序未變，保持野生型的功能。

回復(fù)突變：突變能克服第一次突變造成的影響。如點(diǎn)突變和插入突變往往是可逆的。鐮刀形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

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·

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·

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·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

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C肽鏈CTCGAG基因谷酪蛋絲5’……GCA

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GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變?nèi)?、引發(fā)突變的因素物理因素（紫外線(ultraviolet,UV)、電離輻射）和化學(xué)因素（化學(xué)誘變劑）等都能引起生物突變和致死。UV化學(xué)因素四、DNA損傷的修復(fù)修復(fù)(repairing)：是對已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使DNA恢復(fù)為正常的結(jié)構(gòu)和功能。一個(gè)普通哺乳動(dòng)物基因組在24小時(shí)之內(nèi)可以積累成千上萬個(gè)DNA損傷，DNA修復(fù)系統(tǒng)的存在，避免了這種損傷對生命可能造成的巨大威脅。DNA修復(fù)系統(tǒng)具有多樣性，修復(fù)之所以成為可能，是因?yàn)镈NA由兩條互補(bǔ)的雙鏈組成，當(dāng)一條鏈損傷時(shí)，可以以另一條鏈做模板。一）在E.coli中存在6種基本的修復(fù)系統(tǒng)1.光修復(fù)2.切除修復(fù)3.錯(cuò)配修復(fù)4.重組修復(fù)5.差錯(cuò)傾向修復(fù)（SOS修復(fù)）1、光修復(fù)：紫外線可使DNA分子同一條鏈相鄰的胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體，從而影響復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。DNA光復(fù)活酶能特異性識(shí)別嘧啶二聚體并與之結(jié)合，經(jīng)可見光照射后（波長約400nm）被激活，切除嘧啶二聚體間的c-c鍵，將二聚體分解為正常單體，酶從鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。光復(fù)活酶(photolyase)

UV2.切除修復(fù)

堿基切除修復(fù)：

DNA糖基化酶是一個(gè)能識(shí)別DNA中由胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤分別脫氨形成的損傷，并除去受損傷的堿基。這樣變型的堿基可以通過DNA糖基化酶切斷N-C糖苷鍵除去，在DNA中制造了脫嘌呤或脫嘧啶的部位，通常將這樣的部位稱之AP位點(diǎn)。每種DNA糖基化酶通常對一種類型的堿基損傷特異。例如尿嘧啶糖基化酶就可以除去由于胞嘧啶脫氨形成的尿嘧啶，形成一個(gè)AP位點(diǎn)。然后一個(gè)稱為AP內(nèi)切核酸酶切去含有AP位點(diǎn)的脫氧核糖-5-磷酸，出現(xiàn)一個(gè)核苷酸空隙。然后在DNA聚合酶作用下重新放置一個(gè)正確的核苷酸，最后通過DNA連接酶將切口封閉。尿嘧啶糖基化酶系統(tǒng)的修復(fù)過程

核苷酸切除修復(fù)：

用以修復(fù)引起DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變形的大的DNA損傷。修復(fù)酶是由基因uvrA、uvrB和uvrC分別編碼的三個(gè)亞基組成的，該酶又稱為ABC核酸酶。首先ABC切除核酸酶從損傷部位的兩側(cè)切去含有損傷的DNA鏈，結(jié)果都出現(xiàn)一個(gè)單鏈缺口。然后在DNA聚合酶催化下按照互補(bǔ)鏈填充缺口，切口最后通過DNA連接酶連接。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHPDNA連接酶ATP甲基指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)3.錯(cuò)配修復(fù)修復(fù)系統(tǒng)必須有一種區(qū)分模板鏈和新合成鏈的機(jī)制。細(xì)胞使用模板鏈的甲基化作用作為標(biāo)簽，使它們和新合成鏈區(qū)分。Dam甲基化酶甲基化所有含有GATC順序中腺嘌呤N6的位置?？拷麲ATC順序附近的錯(cuò)配可以根據(jù)已甲基化的模板鏈加以修復(fù)。切除的鏈可以長達(dá)離半甲基化的GATC順序遠(yuǎn)至1000bp的錯(cuò)配堿基。錯(cuò)配可以通過E.coli中的3個(gè)蛋白質(zhì)（MutS、MutH和MutL）校正。錯(cuò)配修復(fù)

4.重組修復(fù)

切除修復(fù)發(fā)生在DNA復(fù)制之前，而當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)尚未修復(fù)的損傷部位，可以先復(fù)制，再重組修復(fù)。在重組修復(fù)過程中，DNA鏈的損傷并未除去。重組修復(fù)至少需要4種酶組分。重組基因recA編碼一種分