優(yōu)秀研究生答辯幻燈片 ppt

歡迎各位專家蒞臨指導(dǎo)單肺通氣誘發(fā)肺損傷時(shí)兔肺組織線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達(dá)的變化及烏司他丁的干預(yù)效應(yīng)研究生：XXXXXX導(dǎo)師：教授二級學(xué)院：XXXX人民醫(yī)院

材料與方法研究目的結(jié)論討論結(jié)果研究背景目錄Contents我將從以下幾個(gè)方面向大家介紹我的研究論文。首先是研究背景單擊研究背景ResearchBackground單肺通氣(one-lungventilation，OLV)的應(yīng)用已有50多年的歷史，是指患者經(jīng)支氣管導(dǎo)管僅利用單側(cè)肺(非術(shù)側(cè)肺)進(jìn)行通氣的方法。主要目的是提供良好的手術(shù)視野，避免患側(cè)肺對健側(cè)肺的污染，減少呼吸運(yùn)動對手術(shù)操作的干擾，隨著外科技術(shù)的發(fā)展，OLV已廣泛應(yīng)用于心胸外科及脊柱手術(shù)的麻醉。GothardJ.Lunginjuryafterthoracicsurgeryandone-lungventilation.CurrOpinAnaesthesioli,2006,19(1):5-1050

6070

80

90

100開胸手術(shù)中1h2h3h長時(shí)間單肺通氣萎陷側(cè)肺快速復(fù)張吸入高濃度氧急性肺損傷FiO2：

%

手術(shù)操作研究背景ResearchBackground細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多可介導(dǎo)IL-1、TNF-α等前炎性因子增多，使中性粒細(xì)胞募集誘發(fā)炎癥反應(yīng)。中性粒細(xì)胞可釋放髓過氧化物酶（MPO），MPO主要功能是利用過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽（HOCl），并形成具有氧化能力的自由基單肺通氣誘發(fā)肺損傷的機(jī)制研究背景ResearchBackground線粒體是參與細(xì)胞能量代謝的重要細(xì)胞器，線粒體功能障礙可導(dǎo)致組織缺氧。細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多，首先攻擊線粒體基因。線粒體基因（mtDNA）氧自由基RuchkoM,GorodnyaO,LeDouxSP,etal.MitochondrialDNAdamagetriggersmitochondrialdysfunctionandapoptosisinoxidant-challengedlungendothelialcells.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol,2005,288(3):L530-535線粒體是參與細(xì)胞能量代謝的重要細(xì)胞器，線粒體功能障礙可導(dǎo)致組織缺氧。細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，主要損傷線粒體基因。線粒體研究背景ResearchBackground線粒體呼吸鏈功能蛋白線粒體轉(zhuǎn)錄因子A

線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mtTFA）是mtDNA轉(zhuǎn)錄翻譯線粒體結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白的重要啟動子。其高表達(dá)可使mtDNA數(shù)量增加，對維持mtDNA穩(wěn)定具有重要意義。mtDNA是轉(zhuǎn)錄翻譯線粒體呼吸鏈功能蛋白的細(xì)胞核外重要遺傳物質(zhì)翻譯線粒體基因（mtDNA）FukuohA,KangD.MethodsforassessingbindingofmitochondrialtranscriptionfactorA(TFAM)toDNA.MethodsMolBiol,2009,1760(2):87-101線粒體DNA是轉(zhuǎn)錄翻譯線粒體呼吸鏈功能蛋白的細(xì)胞核外重要遺傳物質(zhì)，單擊線粒體轉(zhuǎn)錄因子A是這一復(fù)雜過程的重要啟動子之一，其高表達(dá)可使mtDNA數(shù)量增加，對維持線粒體DNA穩(wěn)定有重要意義研究背景ResearchBackground細(xì)胞核線粒體烏司他丁含有143個(gè)氨基酸的糖蛋白，主要通過腎臟代謝,給藥后12h可通過尿和糞便排泄。烏司他丁是分離純化成年男性尿液得到的蛋白水解酶抑制劑。減輕內(nèi)毒素引起肺損傷InoueK,TakanoH,YanagisawaR,etal.Antioxidativeroleofurinarytrypsininhibitorinacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide.IntJMolMed,2005,16(6):1029-1033減輕油酸引起肺損傷JinLY,XuJM,HeZB,etal.[Effectofulinastainontheexpressionofhemeoxygenase-1inoleicacid-inducedacutelunginjuryinrats].ZhongNanDaXueXueBaoYiXueBan,2007,32(4):675-678減輕手術(shù)操作引起肺損傷JinLY,XuJM,HeZB,etal.[Effectofulinastainontheexpressionofhemeoxygenase-1inoleicacid-inducedacutelunginjuryinrats].ZhongNanDaXueXueBaoYiXueBan,2007,32(4):675-678減輕機(jī)械通氣引起肺損傷DzierzbickiP,Kaniak-GolikA,MalcE,etal.Thegenerationofoxidativestress-inducedrearrangementsinSaccharomycescerevisiaemtDNAisdependentontheNuc1(EndoG/ExoG)nucleaseandisenhancedbyinactivationoftheMRXcomplex.MutatRes,2012,740(1-2):21-33烏司他丁UlinastainInoueK,TakanoH,YanagisawaR,etal.Antioxidativeroleofurinarytrypsininhibitorinacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide.IntJMolMed,2005,16(6):1029-1033烏司他丁是臨床上常用的蛋白水解酶抑制劑，對其結(jié)構(gòu)功能研究較為深入，臨床研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁具有減輕內(nèi)毒素、油酸、手術(shù)操作、機(jī)械通氣等引起的肺損傷。研究背景ResearchBackground單肺通氣誘發(fā)急性肺損傷時(shí)肺組織產(chǎn)生

炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體基因受損線粒體功能障礙

是否與mtTFA有關(guān)尚不清楚烏司他丁具有減輕肺損傷清除氧自由基和減輕炎癥反應(yīng)抑制水解酶活性保護(hù)線粒體其機(jī)制是否與mtTFA有關(guān)尚不清楚？？研究背景ResearchBackground材料與方法研究目的結(jié)論討論結(jié)果研究背景研究目的ResearchObjective

本研究通過建立兔單肺通氣致肺損傷模型，擬探討單肺通氣誘發(fā)肺損傷時(shí)肺組織線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達(dá)的變化及烏司他丁的干預(yù)效應(yīng)，為臨床防治單肺通氣誘發(fā)急性肺損傷提供理論依據(jù)。材料與方法研究目的結(jié)論討論結(jié)果研究背景雙肺通氣組Twolungsvenlilation單肺通氣組Onelungsvenlilation烏

司

他

丁

干

預(yù)

組UlinastaininterventionU組O組D組動物選擇及分組根據(jù)文獻(xiàn)，單肺通氣模型動物種類：材料與方法Materialsandmethods實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)選用國內(nèi)外研究單肺通氣最常用的動物：新西蘭大白兔根據(jù)文獻(xiàn)，單肺通氣動物模型有以下幾種，本實(shí)驗(yàn)選用國內(nèi)外研究單肺通氣最常用的動物：新西蘭大白兔。單擊選擇健康雄性大白兔24只，單擊采用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為3組：雙肺通氣組、單肺通氣組、烏司他丁干預(yù)組。單擊健康雄性大白兔24只，體重2.0～2.5kg，常規(guī)分籠喂養(yǎng)。由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供D組雙肺通氣3h，O組和U組左肺通氣2h后再雙肺通氣1h。通氣參數(shù)雙肺通氣時(shí)VT為24ml、單肺通氣VT為12ml、FiO2100%，通氣頻率40次/min，I:E為1:2。通氣結(jié)束后開胸，取雙側(cè)肺尖部組織。模型建立與標(biāo)本采集D組及O組在通氣即刻靜脈注射等量生理鹽水。U組通氣即刻靜脈注射烏司他丁50kU/kg單肺通氣組Onelungsvenlilation烏

司

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丁

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預(yù)

組Ulinastainintervention雙肺通氣組Doublelungsvenlilation這是我們按照文獻(xiàn)方法自制的雙槍氣管插管單擊D組、O組通氣即刻靜注生理鹽水，U組靜注烏司他丁50KU/kg單擊D組雙肺通·氣3h，O組和U組左肺通氣2h后再雙肺通氣1h。通氣參數(shù)設(shè)為雙肺通氣時(shí)潮氣量為24ml、單肺通氣為12ml、吸入氧濃度100%，通氣頻率40次每分，吸呼比為1:2單擊材料與方法Materialsandmethods自制雙腔氣管插管參照文獻(xiàn)：游志堅(jiān),姚尚龍,李進(jìn).三種兔單肺通氣模型的比較.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào),2007,15(4):245-248液氮檢測方法取肺尖部組織裝入凍存管，液氮凍存24h后轉(zhuǎn)?80℃冰箱保存于通氣開始即刻（T0）、通氣1h（T1）、通氣2h（T2）、通氣結(jié)束即刻（T3）采集動脈血取肺尖部組織置入4℃

4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片這是我們的觀察指標(biāo)及檢測方法。多聚甲醛多聚甲醛化學(xué)比色法檢測肺組織SOD活性和MDA含量Westernblot法檢測兔肺組織mtTFA表達(dá)免疫組化法檢測兔肺組織mtTFA表達(dá)血?dú)夥治鰟用}血氧分壓，計(jì)算氧合指數(shù)HE染色觀察肺組織病理學(xué)損傷評分觀察指標(biāo)及材料與方法Materialsandmethods材料與方法研究目的結(jié)論討論結(jié)果研究背景結(jié)果Result各組兔肺組織病理學(xué)改變以及肺損傷評分各組兔一般情況比較各時(shí)間點(diǎn)氧合指數(shù)比較

各組兔肺組織超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量各組兔肺組織中mtTFA的含量結(jié)果分五部分，首先是各組兔一般情況比較單擊各組兔一般情況比較D組、O組及U組兔體重分別為（2.2±0.6）kg、（2.4±0.8）kg及（2.4±0.5）kg，各組兔體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

D組、O組及U組兔通氣過程心率為（211±10）次/min、（209±8）次/min及（208±8）次/min，平均動脈壓為（44±4）mmHg、（40±6）mmHg及（39±4）mmHg，各組兔心率、平均動脈壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組兔體重及通氣過程心率平均動脈壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果ResultComparewithD各時(shí)間點(diǎn)氧合指數(shù)比較ComparewithT0ComparewithT0結(jié)果Result各組兔肺組織SOD活性和MDA含量的比較結(jié)果ResultComparewithDComparewithDComparewithleftlungComparewithleftlungComparewithOComparewithOO組右側(cè)U組右側(cè)各組肺組織病理學(xué)結(jié)果D組右側(cè)O組左側(cè)D組左側(cè)U組左側(cè)400350300250200150100500D組O組U組右肺左肺D組雙側(cè)肺組織肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出、出血、間質(zhì)增厚、炎性細(xì)胞浸潤；O組左側(cè)肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)少量滲出物，少量出血，間質(zhì)輕度增厚，炎性細(xì)胞浸潤較少。O組右側(cè)肺組織大部分肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔內(nèi)有滲出較多，出血多，間質(zhì)明顯增厚，炎性細(xì)胞較多；U組左右側(cè)肺組織比O組左右側(cè)肺組織損傷程度輕。將上述圖片進(jìn)行根據(jù)病理損傷評分，得出數(shù)據(jù)顯示：長時(shí)間單肺通氣肺組織mtTFA表達(dá)下調(diào)。2、烏司他丁具有減輕單肺通氣損傷，與上調(diào)肺組織mtTFA表達(dá)有關(guān)1、長時(shí)間單肺通氣肺組織病理學(xué)損傷評分升高。2、與單肺通氣組比較，烏司他丁組肺組織病理學(xué)損傷評分下降。結(jié)果Resultcomparewithlunginjuryscoresingroups結(jié)果表明：與D組相比，O組肺組織mtTFA表達(dá)降低；

與O組肺組織相比較，U組肺組織mtTFA表達(dá)升高O組右側(cè)U組右側(cè)D組右側(cè)O組左側(cè)D組左側(cè)U組左側(cè)400350300250200150100500D組O組U組左肺右肺免疫組化法測定各組肺組織mtTFA表達(dá)結(jié)果ResultWesternblot結(jié)果以密度掃描分析：采用美國Bandscan5.0軟件對Westernblot結(jié)果進(jìn)行定量分析，灰度值以累積光密度值（IOD）表示，結(jié)果通過以下公式計(jì)算：mtTFA蛋白累積光密度值GAPDH的累積光密度值

mtTFA蛋白半定量=DLDROLORULURWesternblot法檢測各組肺組織mtTFA表達(dá)mtTFA表達(dá)GAPDH

結(jié)果表明：與D組相比，O組肺組織mtTFA表達(dá)降低；

與O組左側(cè)肺組織相比，O組右側(cè)肺組織mtTFA表達(dá)降低；

與O組肺組織相比較，U組肺組織mtTFA表達(dá)升高。

與免疫組化法測定mtTFA結(jié)果一致。D組O組U組結(jié)果Result左肺右肺

TheexpressionleveloflungtissuemtTFAwasmeasuredbywesternblotindifferentgroups.材料與方法研究目的結(jié)論討論結(jié)果研究背景研究表明，氧合指數(shù)<300mmHg(1mmHg=0.133kPa)時(shí)即可認(rèn)為發(fā)生肺損傷。O組、U組通氣結(jié)束時(shí)氧合指數(shù)<300mmHg，提示氧飽和下降，出現(xiàn)輕微的低氧血癥。光鏡下單肺通氣后肺組織大部分肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔內(nèi)有滲出，出血多，間質(zhì)增厚，炎性細(xì)胞大量聚集。綜合肺組織病理學(xué)結(jié)果及血?dú)夥治鼋Y(jié)果，O組、U組通氣結(jié)束時(shí)氧合指數(shù)<300mmHg，氧飽和下降，出現(xiàn)輕微的低氧血癥，提示兔單肺通氣誘發(fā)肺損傷模型制備成功。烏司他丁減輕肺損傷機(jī)制

肺損傷時(shí)肺組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及與mtTFA關(guān)系單肺通氣致肺損傷的機(jī)制單肺通氣誘發(fā)肺損傷模型的制備討論

Discussion動脈血氧合指數(shù)比較：O組、U組通氣結(jié)束時(shí)氧合指數(shù)<300mmHg，提示氧飽和下降，出現(xiàn)輕微的低氧血癥。肺組織病理學(xué)損傷評分：光鏡下單肺通氣后肺組織大部分肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔內(nèi)滲出，出血多，間質(zhì)增厚明顯，炎性細(xì)胞聚集。研究表明，氧合指數(shù)<300mmHg(1mmHg=0.133kPa)時(shí)即可認(rèn)為發(fā)生肺損傷。

本研究結(jié)果表明：O組、U組通氣結(jié)束時(shí)氧合指數(shù)<300mmHg，提示通氣結(jié)束時(shí)氧飽和下降，出現(xiàn)輕微的低氧血癥。根據(jù)文獻(xiàn)，對肺泡結(jié)構(gòu)、肺間質(zhì)水腫增厚、肺泡內(nèi)滲出、出血、炎性細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行評分，>3分為重度損傷本研究結(jié)果表明，光鏡下單肺通氣后肺組織大部分肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔內(nèi)滲出，出血多，間質(zhì)增厚明顯，炎性細(xì)胞聚集。單肺通氣誘發(fā)肺損傷模型的建立討論

Discussion研究表明，氧合指數(shù)<300mmHg(1mmHg=0.133kPa)時(shí)即可認(rèn)為發(fā)生肺損傷。本研究結(jié)果表明，O組、U組通氣結(jié)束時(shí)氧合指數(shù)<300mmHg，提示氧飽和下降，出現(xiàn)輕微的低氧血癥。

根據(jù)文獻(xiàn)，對肺泡結(jié)構(gòu)、肺間質(zhì)水腫增厚、肺泡內(nèi)滲出、出血、炎性細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行評分，>3分為重度損傷光鏡下單肺通氣后肺組織大部分肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔內(nèi)有滲出，出血多，間質(zhì)增厚，炎性細(xì)胞大量聚集。綜合肺組織病理學(xué)結(jié)果及血?dú)夥治鼋Y(jié)果，O組、U組通氣結(jié)束時(shí)氧合指數(shù)<300mmHg，氧飽和下降，出現(xiàn)輕微的低氧血癥，提示兔單肺通氣誘發(fā)肺損傷模型制備成功。單肺通氣誘發(fā)肺損傷模型制備成功單肺通氣誘發(fā)肺損傷機(jī)制

單肺通氣誘發(fā)非通氣側(cè)肺損傷比通氣側(cè)嚴(yán)重本研究結(jié)果表明，與O組左側(cè)比較，O組右側(cè)肺組織肺損傷評分升高、SOD活性降低、MDA含量升高、mtTFA表達(dá)下調(diào)。提示非通氣側(cè)肺組織損傷嚴(yán)重，其機(jī)制可能為非通氣側(cè)肺組織長時(shí)間萎陷，肺泡Ⅱ型細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶活性較肺通氣側(cè)明顯下降，阻礙肺泡間質(zhì)內(nèi)的肺水重吸收，因此肺泡內(nèi)滲出液增多。單肺通氣轉(zhuǎn)為雙肺通氣時(shí)，產(chǎn)生的界面切力和肺水滯留，是引起非通氣側(cè)肺組織受到牽張而損傷嚴(yán)重的重要原因。肺快速復(fù)張時(shí)，可造成膨脹和不張肺組織的交界處產(chǎn)生:界面切力肺水滯留討論

Discussion單肺通氣誘發(fā)肺損傷機(jī)制本研究結(jié)果表明，與D組比較，O組肺組織SOD活性下降，MDA含量增加，提示單肺通氣致肺損傷時(shí)兔肺組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。其機(jī)制可能為：炎性起始的中性粒細(xì)胞募集，釋放MPOMPO介導(dǎo)釋放TNF-αIL-1中性粒細(xì)胞募集髓過氧化物酶討論

DiscussionMPOMPOMPOMPOMPOMPO細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)模擬示意圖線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mtTFA）線粒體環(huán)狀DNA（mtDNA）O2-線粒體超微結(jié)構(gòu)模擬示意圖細(xì)胞核內(nèi)DNA組蛋白減輕炎癥反應(yīng)清除氧自由基防止細(xì)胞鈣超載抑制水解酶的活性研究表明烏司他丁烏司他丁是分離純化成年男性尿液得到的蛋白水解酶抑制劑。烏司他丁覃建明.烏司他丁的藥理作用及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,(11):19-20譚朝華,徐軍美,楊昭云,楊東林,呂志平.烏司他丁對急性肺損傷兔炎性細(xì)胞因子及氧自由基的影響.中國醫(yī)師雜志,2004,(10):1360-1362.討論

Discussion烏司他丁calciumoverload防止鈣超載Inflammatoryreaction減輕炎癥反應(yīng)hydrolaseactivi