細胞復(fù)蘇與計數(shù)

細胞復(fù)蘇從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37～40℃水浴中，快速搖晃直至完全融化（最好在1min內(nèi)完成，融化時水不要浸過凍存管的蓋子）將凍存管直接離心，1500rpm，5min；棄上清液，加入含10%血清的培養(yǎng)液1ml重懸細胞，將細胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶，加入3ml新鮮的培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。注意事項將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷；凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。細胞計數(shù)細胞計數(shù)法是用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞數(shù)目，以調(diào)整植入的細胞血細胞計數(shù)板是一塊長方形的硬質(zhì)厚玻璃板，板上有兩個刻度平臺，每個平臺劃分為9個大方格，每個大方格的面積為1平方毫米，加特制蓋片（厚度0.7毫米）后的深度為0.1毫米。中心為一個大方格以雙線等分為25個中方格，每個中方格又分為16個小方格。中心大方格供紅細胞計數(shù)和血小板計數(shù)用，四角的四個大方格供白細胞計數(shù)用。取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上.將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液(10ul)沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。將血球計數(shù)板置于顯微鏡的低倍鏡下觀察，數(shù)出四角的四個大格（每個大格含有16個中格）中的細胞數(shù)目。按照下面公式計算細胞密度：（細胞懸液的細胞數(shù)）/ml＝四個大格子細胞數(shù)/4*104*稀釋倍數(shù)說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。

公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3＝1*10-4

ml

25格*16格的血球計數(shù)板RBC計算公式RBC數(shù)/ml=80小格RBC數(shù)/80*400*104*稀釋倍數(shù)細胞計數(shù)要點1.進行細胞計數(shù)時，要求懸液中細胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。

2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。

3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準確。

4.數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。

5.操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。

Zseries細胞計數(shù)儀：美國BECKMANCOULTER20ml緩沖液+200ul樣品（101倍）操作步驟A549細胞一瓶，將培養(yǎng)液去掉，加入D-Hanks3ml使液體覆蓋在細胞生長面，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，去液體。加入消化液500ul，使消化液覆蓋于細胞面上。(一般消化時間為1到5分鐘，以鏡下觀察為準:細胞質(zhì)回縮，胞體變圓可終止消化)加入3mlD-Hanks液，輕輕吹打細胞生長面，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔不要用力過猛。將細胞瓶中的細胞懸液移至15ml離心管中，用D-HANKS將液體總量加至5ml,混勻，吸取200ul細胞懸液置于1.5ml的EP管中用于計數(shù)。剩下的細胞懸液以1500rpm離心5min。去上清，根據(jù)計數(shù)的結(jié)果用新鮮培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液濃度為1*105細胞數(shù)/ml。接種孔板以1*103、2*103、4*103、8*103、1.6*104接種于96孔板中，每個濃度接種3個復(fù)孔，最后加3個空白對照孔（共18孔），然后每孔加入培養(yǎng)液200ul。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及