研究生開題報告

學術論文開題報告

基質金屬蛋白酶與癲癇發(fā)病的關系專業(yè)名稱：神經病學研究方向：癲癇協作單位：青大醫(yī)學院日期：2004年12月28日一、選題的目的和意義（主要說明：進行研究的必要性、預期達到的目的、實際應用價值和學術意義）本研究是為了明確基質金屬蛋白酶及其組織相容性抑制因子（MMPs/TIMPs）是否參與了癲癇的發(fā)病，可能是以怎樣的機制參與。通過該試驗，應可證實：MMPs/TIMPs，主要是MMP-9/TIMP-1參與了癲癇的發(fā)病，可能是通過增加了血腦屏障的通透性，加強了腦內的免疫反應，損害了神經元與神經膠質細胞，影響突出重建，從而影響癲癇放電環(huán)路的形成。同時該試驗可指導臨床上選擇特異性MMPs抑制因子，抑制該病理過程，從而緩解癲癇的發(fā)作。這將為癲癇的免疫學機制提供有意義的線索。二、國內外研究動態(tài)引文癲癇的發(fā)病機制非常復雜，目前關于癲癇的免疫學發(fā)病機制的研究，主要集中在腦組織抗原和抗腦抗體的尋找。星形膠質細胞相關抗原在發(fā)生免疫反應和損傷的腦屏障部位，與外周循環(huán)免疫系統發(fā)生接觸，并且其相應特異性抗體以遵循同一途徑進入腦組織內，造成該膠質細胞的免疫損傷，破壞了腦神經沖動傳導的反饋抑制環(huán)路的平衡而導致興奮性神經元過度放電和傳播。當這種過度放電達到一定強度和范圍時，即會發(fā)生癇性抽搐。MMPs/TIMPs是中樞神經系統與外周神經系統免疫反應發(fā)生聯系的物質，它與癲癇的關系越來與引起人們的關注。MMPs是一組結構中含有Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶家族，是催化細胞外基質降解的主要酶類之一，幾乎能降解細胞外基質的所有成分，如膠原蛋白、蛋白多糖、纖維結合蛋白等。在中樞神經系統中[1]主要來源于血管內皮細胞，浸潤入腦的炎癥細胞及中樞神經系統固有細胞如星形膠質細胞和小膠質細胞。MMPs共有二十多個成員，根據作用底物不同分為四類，即（1）膠原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13)；（2）明膠酶(MMP-2、MMP-9)；（3）基質溶解酶(MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11、MMP-12)；（4）模型基質金屬蛋白酶(MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17)。。MMPs的功能主要有二，一是幾乎能降解除了糖以外的所有細胞外基質成分，其二是激活別的MMPs，形成瀑布效應。MMPs的自我平衡調節(jié)是通過其內源性抑制因子TIMPs完成的。TIMPs家族主要有四個成員（TIMP-1、－２、－３、－４）,他們與MMPs間的特異性抑制關系并不十分清楚.但TIMP-1和TIMP-2分別對MMP-9和MMP-2有較特異的抑制作用[2]。MMPs／TIMPs與血腦屏障（BBB）

BBB通透性增強，與血管性水腫及顱內高壓相關。某些致病因素如感染、偏頭痛、中風，外傷等，可通過使內皮細胞收縮[3]

或者釋放蛋白酶和自由基[4]等機制激活MMPs而改變血腦屏障的通透性［2、4，5］。MMPs破壞內皮細胞緊密連接、周細胞（pericyte），星形膠質細胞足突和基膜。基膜內含有ECM如膠原蛋白Ⅳ，層粘連蛋白和纖維連接蛋白，大多數是MMPs的底物（特別是MMP-2和MMP-9）。這可能是BBB通透性增加的主要原因。腦內MMPs特別是MMP-9隨著血腦屏障通透性增高而增高。MMPs具體通過何機制引起血腦屏障破壞，仍待進一步研究。血腦屏障破壞后，炎癥細胞及其產生的致病因子進入腦組織，引起腦損傷。

MMPs／TIMPs與中樞神經系統免疫反應

MMPs與中樞神經系統感染及自身免疫性疾?。ㄈ缍喟l(fā)性硬化）相關，參與了中樞神經系統的免疫反應。病毒［1，6］侵入機體，激活T淋巴細胞，浸潤至中樞神經系統，通過分泌細胞因子刺激中樞神經系統固有細胞（主要是星形膠質細胞）表達MMPs，TIMPs（MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-12和TIMP-1、TIMP-2、TIMP－3）。激活的T淋巴細胞也可和星形膠質細胞相互作用，使后者表達MMP-3、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2。MMP-9的活性還與浸潤到腦的中細粒細胞有關，在腦組織血管周隙的神經細胞中可有單核細胞浸潤表達的MMP-9，這與淋巴細胞通過血腦屏障的能力有關[7]與此役以相同的是YushchenkoM等[29]發(fā)現，MMP-9的表達與各種神經系統疾病的腦脊液中細胞數升高有關。若腦脊液中細胞數正常，MMP-9的表達水平就沒有改變。T淋巴細胞產生的細胞因子包括前炎癥細胞因子（TNF-α，TNF-β，IL-1α）和抗炎癥細胞因子（IL-4，IL-5）；前炎癥細胞因子使MMP-3，MMP-9和TIMP-3表達上調[9]，而抗炎癥細胞因子與TIMP-1的表達上調有關。前炎癥細胞因子誘導MMPs過表達[8]，但對TIMPs的影響較小，引起MMPs/TIMPs表達的平衡失調。T淋巴細胞刺激星形膠質細胞產生TIMPs，是控制MMPs的上調的反應。但在該試驗模型中TIMP-1和TIMP-3未抑制蛋白酶活性。這可能與MMP-3表達增多有關，MMP-3參與激活酶原形式的MMP-9，這就從另一方面加劇了MMPs/TIMPs表達比例的失調。所以說，MMPs/TIMPs平衡的改變與免疫介導的中樞神經系統疾病，包括T淋巴細胞激活，高度相關。淋巴細胞透過血腦屏障依賴于黏附分子的協調連接[11]，細胞因子及其受體相互作用，也需要MMPs和TIMPs的作用。可通過增加BBB的通透性，促進免疫分子透過血腦屏障［2，12］。T淋巴細胞不僅能產生MMPs，還能產生TIMP-1，其透過血腦屏障的能力較B淋巴細胞低。但MMPs在免疫細胞透過血腦屏障過程中的具體作用并不清楚。TNF-α和IFγ[13]誘導單核細胞和巨噬細胞縫隙連接的形成，細胞－細胞縫隙連接的形成，整合蛋白介導的細胞粘附[6]也參與了MMPs水平的改變。在多發(fā)性硬化中[14,15]，CD8＋細胞毒性T淋巴細胞表達MMPs，MMPs通過參與BBB的破壞，使中樞神經系統脫髓鞘和抗原決定簇擴散，而中樞神經系統髓鞘的持續(xù)降解可暴露額外的自身抗原，使自身免疫反應持續(xù)存在。ONO-4817（一種人工合成MMPs抑制因子）可以通過抑制MMPs，T淋巴細胞增殖和減少TNF-α生成，進而顯著減輕BBB的破壞，又可抑制炎癥細胞浸潤和髓鞘破壞，從而有效延緩實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）[16]。也即，MMPs通過免疫機制參與了多發(fā)性硬化脫髓鞘的病理變化。在與人類免疫缺陷病毒－1相關的癡呆的研究過程中[17]，MMPs／TIMPs通過影響了單核巨噬細胞的遷移，參與其病理過程。病毒感染和／或免疫激活單核細胞轉化而成的巨噬細胞及胎兒小膠質細胞，表達MMP-1、-2、-3、-9、TIMP-1，TIMP-2。MMPs的表達促進了單核巨噬細胞的分化，小膠質細胞表達的MMPs激活了CD40配體介導的細胞。MMPs引起B(yǎng)BB也參與了這一過程，淋巴細胞和單核細胞通過血腦屏障進入腦內發(fā)揮其病理作用。MMPs還可能通過直接的降解腦內ECM，參與了該病理過程。MMPs/TIMPs在癲癇腦中表達的研究在海人酸(KA)誘導的癲癇模型中，癇性發(fā)作后，可檢測到MMP-9mRNA和MMP-9蛋白的表達上調，MMP-9活性增強[18]，TIMP-1mRNA和TIMP-1蛋白的表達上調，TIMP-1的活性也增強［19］。充分提示MMP-9/TIMP-1與癇性發(fā)作相關。同時報道還提示，以上改變呈時間依賴性和部位特異性MMPs的表達原位雜交和免疫組化分析［19］，正常情況下，MMP-9在神經元表達豐富，在膠質細胞中表達很低。亞細胞水平研究發(fā)現，MMP-9主要集中在核周區(qū)，也可在近樹突區(qū)。而MMP-2的表達則不同，該實驗中主要在星形膠質細胞中表達，而Vaillant等［20］發(fā)現MMP-2主要表達在小腦神經元和它們的樹突，而不是膠質細胞中，Zuo等［21］在樹突生長帶測到MMP-2。這些差異可能與各實驗中應用的抗體不同有關。但正常成年大鼠中樞神經系統中確實有MMPs的表達，而且表達水平和在細胞中的分布的差異可能受神經元發(fā)育和/或神經元功能狀態(tài)調節(jié)。KA注射后，MMP-9mRNA、MMP-9蛋白和酶活性特異性的時空分布特點。在海馬，KA理后2h，酶原形式的MMP-9的活性已增高，6h達高峰，24h時其活性開始降低，但仍高于對照組。24h之后，隨著酶原形式MMP-9的降低，其活性形式逐漸增多。在早期，MMP-9的聚集是由突觸活動增強引起的，是神經元活動依賴性的［22］。后期，是一些參與組織重塑的因子使MMP-9mRNA上調并轉化為活性形式，這些因子包括神經營養(yǎng)因子，生長因子和粘附分子。MMP-9mRNA主要分布在海馬CA1和CA3的顆粒細胞層和齒狀回的顆粒細胞，MMP-2mRNA分布較均一，尤其在大腦灰質，但表達水平較MMP-9mRNA低。MMP-9主要分布在齒狀回的顆粒細胞和部分膠質細胞，在CA1－3區(qū)和齒狀回MMP-2的表達極低。KA注射后，MMP-9mRNA在齒狀回顆粒細胞的樹突區(qū)表達增多，活性增強，。說明MMP-9mRNA從胞體轉移至樹突區(qū)，該轉移促進了樹突合成突觸蛋白［23］。該試驗同時發(fā)現，易損區(qū)（CA1、邊緣皮質，杏仁體區(qū)）未能測到MMP-9蛋白和及其mRNA，提示MMP-9不會引起細胞死亡。而重組MMP-9能選擇性誘導培養(yǎng)基上錐體細胞的死亡，并能加劇KA誘導的神經元活動而引起的神經元死亡。也就是說，MMP-9與神經元死亡的關系并不明確。另有研究提示，KA注射后12h，顳葉MMP-9的表達，在成年大鼠較幼年鼠顯著增多。以上資料表明，MMPs特別是MMP-9參與了興奮毒性反應后神經元的損害，以及繼發(fā)的神經炎癥反應，可能通過影響突觸的生理活性，參與了興奮依賴性的樹突結構重建。TIMPs的表達RiveraS[24]等用KA誘導大鼠興奮毒性發(fā)作，觀察其中樞神經系統中TIMP-1的表達。結果顯示，TIMP-1在癇性發(fā)作后是作為一種早期反應基因，先在神經元中被誘導而表達上調。隨后，在膠質細胞中的表達也增強。KA處理后，TIMP-1mRNA首先在海馬區(qū)迅速增多；KA注射后8h，TIMP-1蛋白在圍胞體區(qū)和樹突-軸突的免疫反應增強；KA處理后3d，免疫反應在膠質細胞和抵抗性神經元如齒狀回細胞的胞體及樹突-軸突區(qū)增強。提示：TIMP-1在聯系癇性發(fā)作引起的神經元和膠質細胞早期細胞反應事件和介于組織重組和/或神經保護長時間變化的調節(jié)過程中，可能有一定的作用。癇性發(fā)作改變了神經元內TIMP-1分布和表達水平。多數相關研究中，癇性發(fā)作后TIMP-1mRNA表達上調，隨后通常有TIMP-1免疫反應的增強。事實上，KA注射后90分鐘時，齒狀回顆粒細胞TIMP-1mRNA的大量而快速表達。KA注射后8h時，TIMP-1免疫活性的增高。KA注射后72h，TIMP-1mRNA恢復到對照組水平時，顆粒細胞免疫反應升高。海馬區(qū)在KA注射后8-16h，TIMP-1免疫反應主要在錐體細胞和顆粒細胞的圍胞體區(qū)和樹突區(qū)增強，說明TIMP-1蛋白通過分泌途徑轉移定位。KA注射后72h，TIMP-1的免疫反應不僅在海馬的樹突-軸突區(qū)顯著增強，在顆粒細胞胞體也顯著增強，提示隨著時間的改變，TIMP-1的合成、貯存、運輸和分泌的調節(jié)不同。這些神經元內TIMP-1的遲發(fā)性聚集，可能是由于在膠質細胞主要作用于胞外TIMP-1庫時，其分泌減少。此時，CA1區(qū)變性，持續(xù)的TIMP-1mRNA表達與該亞區(qū)神經元內免疫反應增強無關。這表面上的矛盾可能由于TIMP-1轉化能力改變，或者由于該蛋白的蛋白分解作用增強。此外，膠質細胞浸潤到CA1神經元層可能對保持較高的TIMP-1mRNA水平有作用。結果提示：在易損CA1神經元內TIMP-1蛋白的缺乏和抵抗的顆粒細胞TIMP-1蛋白的表達之間存在有意義的聯系。在腦的興奮毒性發(fā)作中，局灶的MMPs/TIMPs比例改變，有病理學意義。TIMP-1先在神經元，之后在膠質細胞表達，說明TIMP-1的轉導調節(jié)在癇性發(fā)作腦內可能有細胞和刺激依賴性。盡管神經元的高度興奮性可以誘導神經元內早期TIMP-1的表達，但是在癇性發(fā)作始動期，其他因素即可影響神經元內TIMP-1的表達，稍后可影響其在膠質細胞的表達。這些因素包括前炎癥細胞因子（如IL-1β，TNF-α）和堿性成纖維生長因子（bFGF），是可由癇性發(fā)作誘導并可能在損傷后參與組織修復的因子。TIMP-1，除了具有已被廣泛認識的抑制MMPs的功能，還表現出神經營養(yǎng)活性。且由于癇性發(fā)作后細胞內短暫的TIMP-1表達，TIMP-1可能在神經細胞間營養(yǎng)作用的級聯反應過程中有一定作用值得注意的是，TIMP-1的免疫反應在72h依然很強烈，且14d時在形態(tài)學類似星形膠質細胞的細胞中繼續(xù)升高，這主要在腦的易損區(qū)如海馬，杏仁核或內嗅區(qū)觀察到。綜上所述，癇性發(fā)作后，星形膠質細胞對腦組織重塑的作用，是基于它們引起細胞外基質成分改變的能力，也能通過調節(jié)MMPs/TIMPs的比例來調節(jié)它的轉換。KA注射后2周，海馬樹突區(qū)和膠質細胞內仍可見到增強的TIMP-1的免疫反應，這一事實強有力的證明了，TIMP-1參與了癇性發(fā)作后組織重塑。綜上所述，MMPs/TIMPs,以MMP-9/TIMP-1的研究較為明確，在KA注射后8h，在齒狀回顆粒細胞表達增多。MMP-9的表達由胞體區(qū)（核周和近樹突區(qū)）轉移到樹突區(qū)。TIMP-1在KA注射后8h，在神經元樹突區(qū)和樹突-軸突區(qū)反應增強；3d時，在膠質細胞和耐受性神經元如齒狀回細胞的胞體及樹突軸突區(qū)增強。腦易損區(qū)海馬的CA1，TIMP-1表達缺乏，MMP-9表達亦不明顯。另外，MMP-9在神經元中的表達是神經元活動依賴性的，而TIMP-1的表達是非神經元活動依賴性的。KA誘導的大鼠興奮毒性發(fā)作過程中，神經元活動可誘導MMPs的表達升高，前炎癥細胞因子參與調節(jié)神經元和膠質細胞表達MMPs/TIMPs，在不同時期，由不同部位的細胞表達。而且MMPs/TIMPs在細胞中的分布也發(fā)生改變，這可能是神經元及神經膠質細胞發(fā)生突觸聯系的基礎。同時MMPs分解腦組織細胞外基質，MMPs/TIMPs分布不一致及比例失調，都參與了興奮毒性誘導的癇性發(fā)作。小結MMPs/TIMPs，作為調節(jié)中樞神經系統細胞外基質的一個酶系，受多種因素的精細調節(jié)，保證了腦內環(huán)境的穩(wěn)定。在某些致癇因子的的刺激下，MMPs／TIMPs的表達發(fā)生改變，與腦內免疫反應互相促進，共同參與了癲癇的發(fā)病過程。在癥狀性癲癇當致癇因子刺激機體時，機體發(fā)生免疫反應，免疫細胞在細胞因子的刺激下表達MMPs，MMPs和炎癥反應通過不同的機制，都可使BBB通透性增加。BBB破壞后，激活了腦內的免疫反應，引起了腦損傷。免疫細胞表達MMPs/TIMPs，免疫反應同時激活了腦固有細胞表達MMPs/TIMPs，使其在腦內的表達水平提高。MMPs/TIMPs可通過其本身的生物學作用，降解腦的細胞外基質，打破腦內壞境的穩(wěn)定，這可能影響了腦內某些信號通道的生理功能，如Ca2＋通道和Na＋通道。還可以影響神經元和神經膠質細胞樹突重建，從而參與癇形放電環(huán)路的形成。癲癇作為一種臨床常見疾病，其發(fā)病機制尚欠清楚，MMPs/TIMPs可能通過免疫機制參與其發(fā)病，但具體機制有待進一步研究。明確它們之間的關系，有利于臨床上選擇特異性MMPs的抑制因子，阻止癇性放電，從而治療癲癇。參考文獻[1]ZhouJh,StohlmanSA,AtkinsonR,etal.

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