分子標(biāo)記概述2003

DNA分子標(biāo)記目錄概述1.常用分子標(biāo)記技術(shù)原理及操作2.幾種分子標(biāo)記方法比較3.分子標(biāo)記在園藝植物中的應(yīng)用4.1、基本概念遺傳標(biāo)記指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段或者某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。是表示遺傳多樣性的有效手段，可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。它具有兩個(gè)基本特征，即可遺傳性和可識(shí)別性。分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，直接在DNA水平上檢測(cè)生物個(gè)體之間的遺傳差異，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映常用遺傳標(biāo)記的類型細(xì)胞學(xué)標(biāo)記生化標(biāo)記分子標(biāo)記3形態(tài)標(biāo)記124廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)分子標(biāo)記狹義分子標(biāo)記是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段DNA分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問(wèn)題自然界存在許多等位變異，無(wú)需人為創(chuàng)造，多態(tài)性高遍布整個(gè)基因組，可檢測(cè)的基因座位是無(wú)限的理想的分子標(biāo)記具有高的多態(tài)性共顯性遺傳檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快速選擇中性分子標(biāo)記均勻分布于整個(gè)基因組能明確辨別等位基因遍布整個(gè)基因組成本低，重復(fù)性好以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)例如SSR（1982）RAPD（1990）AP-PCR（1990）AFLP（1993）ISSR（1994）SAGE（1995）第二類分子標(biāo)記以Southern雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)例如RFLP（1974）第一類分子標(biāo)記以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)

例如SNP（1998）SRAP（2001）TRAP（2003）第三類分子標(biāo)記DNA分子標(biāo)記產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)PCR技術(shù)基因組DNA限制性內(nèi)切酶引物DNA聚合酶帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)電泳核酸分子由于帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極定向運(yùn)動(dòng)核酸電泳PCR反應(yīng)步驟高溫變性低溫退火中溫延伸使DNA雙鏈解開讓引物與單鏈模板互補(bǔ)結(jié)合以互補(bǔ)的引物為復(fù)制起點(diǎn)，dNPTs為原料，進(jìn)行復(fù)制。

核酸電泳常用分子標(biāo)記方法SSRRAPDSRAPISSRRFLPSNPRFLP標(biāo)記法（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）不同材料的DNA用已知的限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生許多大小不等的DNA片段，電泳分離、Southern印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用放射性標(biāo)記的探針與膜上變性的酶切DNA進(jìn)行雜交，放射自顯影，即可顯示出不同材料的多態(tài)性圖譜，即顯示出所分析的DNA序列間

原理

RFLP標(biāo)記特點(diǎn)

遍布，無(wú)限不受外界環(huán)境、發(fā)育階段、器官等影響探針多DNA需求量大，純度高技術(shù)要求高，成本大RFLP標(biāo)記基本步驟DNA雜交及放射自顯影Southern印記轉(zhuǎn)移瓊脂糖凝膠電泳酶切DNA的分離

RAPD標(biāo)記法（RandomAmplifiedPolymorphismDNA）以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以一系列人工合成的不同的隨機(jī)排列順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為十聚體）為引物對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR酶促體外擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)EB染色（或銀染、放射自顯影）來(lái)檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴(kuò)增片段多態(tài)性便反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。原理RAPD標(biāo)記特點(diǎn)試驗(yàn)步驟少?zèng)]有物種特異性技術(shù)簡(jiǎn)便DNA樣品量少存在共遷移問(wèn)題重復(fù)性不高顯現(xiàn)標(biāo)記易發(fā)現(xiàn)多態(tài)性ADNA的提取B用隨機(jī)引物對(duì)兩個(gè)相對(duì)性狀個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增C用凝膠電泳分開產(chǎn)物DNA片段D查找特異的與目的性狀共分離的DNA片段RAPD標(biāo)記基本步驟SSR標(biāo)記法（simplesequencerepeat）根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計(jì)算等位基因頻率。

原理SSR原理

?

重復(fù)單元：1~6bp,如

CA,CTCG

?

重復(fù)次數(shù)：5~30次

?

覆蓋長(zhǎng)度：10~300bpSSR標(biāo)記特點(diǎn)1.數(shù)量多且平均分布2.位于內(nèi)含子中3.共顯現(xiàn)遺傳4.結(jié)果重復(fù)性高5.引物問(wèn)題SSR標(biāo)記的步驟TwoThreeOne構(gòu)建小片段或大片段的基因組篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序、設(shè)計(jì)引物、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)確認(rèn)后，全部或經(jīng)過(guò)隨機(jī)挑選后測(cè)序，然后根據(jù)微衛(wèi)星序列兩側(cè)保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增的條件，獲得穩(wěn)定、可靠的SSR標(biāo)記。ISSR標(biāo)記法（inter-simplesequencerepeat）在SSR的3’或5’端加錨1~4個(gè)嘌呤或嘧啶堿基,引起特定位點(diǎn)退火,使引物與匹配SSR的一端結(jié)合,從而對(duì)基因組中特定片段進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè),最后根據(jù)譜帶的有無(wú)及相對(duì)位置分析不同樣品間ISSR標(biāo)記的多態(tài)性。原理

5’錨定引物3’錨定引物

NNNN（CA）n（CA）nNNCACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCACACACACACACACA

NNn（CA）

（CA）nNNNN3’錨定引物5’錨定引物

3’錨定引物的PCR產(chǎn)物5’錨定引物的PCR產(chǎn)物ISSR標(biāo)記特點(diǎn)FiveFourThreeTwoOne技術(shù)簡(jiǎn)單檢測(cè)迅速，容易靈敏度高，特異性強(qiáng)具有高的多態(tài)性

穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好用6%的聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳分離，用EB或銀染后放入可見光或紫外光下觀察，統(tǒng)計(jì)帶紋的有無(wú)及相對(duì)位置。在PCR儀上對(duì)基因組中的SSR間序列進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增步驟與RAPD技術(shù)相似,但不同引物、不同植物材料的擴(kuò)增條件存在差異,需通過(guò)預(yù)備實(shí)驗(yàn)對(duì)體系反應(yīng)加以設(shè)計(jì)可采用常規(guī)方取用于ISSR分析的DNA樣品,如SDS法或CTAB法DNA提取PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)SRAP標(biāo)記法（Sequence—relatedAmplifiedPolymorphism）

利用基因外顯子里G、C含量豐富，而啟動(dòng)子和內(nèi)含子里A、T含量豐富的特點(diǎn)設(shè)計(jì)兩套引物，對(duì)開放讀碼框架（ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增。原理SRAP標(biāo)記特點(diǎn)技術(shù)簡(jiǎn)單快速引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單具高多態(tài)性信息量豐富在基因組中分布均勻穩(wěn)定可靠重復(fù)性好ONETWOTHREEFOURSRAP標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)SRAP-PCR擴(kuò)增凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)與片段測(cè)序

SRAP標(biāo)記的步驟SNP標(biāo)記（SingleNucleotidePolymorphism）原理

單個(gè)核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性，形式包括單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等

不同生物個(gè)體基因組DNA序列之間單個(gè)核苷酸的差異，這種差異可以通過(guò)設(shè)計(jì)特異PCR引物擴(kuò)增和電泳檢測(cè)顯示出來(lái)。位點(diǎn)豐富、分布廣泛具有更高的遺傳穩(wěn)定性，尤其是處于編碼區(qū)的SNP檢測(cè)快速、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析富有代表性二態(tài)性和等位基因性SNP標(biāo)記特點(diǎn)6種分子標(biāo)記方法比較DNA質(zhì)量要求DNA檢測(cè)范圍遺傳特點(diǎn)多態(tài)性技術(shù)難度及重復(fù)性RFLP高低拷貝區(qū)共顯性中等高、高RAPD低整個(gè)基因組顯性較高中等、低SSR中高重復(fù)序列區(qū)共顯性高低、高ISSR中高重復(fù)序列區(qū)顯性高低、低SRAP低整個(gè)基因組共顯性高低、低SNP高整個(gè)基因組共顯性高高、高RFLP標(biāo)記的應(yīng)用

構(gòu)建基因組遺傳圖譜及育種1

基因定位及基因突變分析

2

遺傳多態(tài)性分析3

細(xì)胞質(zhì)遺傳研究4莊杰云等選用覆蓋整個(gè)水稻遺傳圖譜的129和106個(gè)DNA探針,分別分析了汕稻品系IR54、5460、5460S之間和粳稻品系農(nóng)墾58

、農(nóng)墾58s及其育性回復(fù)突變系之間的RFLp。結(jié)果表明人工誘變能引起水稻染色體組各座位同時(shí)發(fā)生廣泛的非致死性突變;自發(fā)突變較普遍,且多為回復(fù)突變。農(nóng)墾58等3個(gè)粳稻品系之間的差異較小,但具有類似的趨勢(shì)。應(yīng)用舉例RAPD標(biāo)記的應(yīng)用天然居群內(nèi)及居群間的遺傳變異種質(zhì)資源搜集及品種鑒定種間或?qū)匍g親緣關(guān)系遺傳圖譜構(gòu)建基因定位與分離等尹艷杰等利用RAPD標(biāo)記分析了桂林市23個(gè)桂花品種的親緣關(guān)系，研究表明，4個(gè)品種群內(nèi)的不同品種間的親緣關(guān)系接近，而不同品種群間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中圓瓣金桂、桃葉金桂、湘金桂、金蓮首先聚為一類，被命名為金桂品種群;南溪丹桂、貴妃紅、籽丹桂、丹心被劃分為丹桂品種群:四季桂、月月桂屬于四季桂品種群，其余的品種，如紫粵、滿天星、弄潮兒等都屬于銀桂品種群應(yīng)用舉例SSR標(biāo)記的應(yīng)用生物雜交育種及純度鑒定01遺傳連鎖圖譜02種群遺傳多樣性03系統(tǒng)發(fā)生等04應(yīng)用舉例

張敏等采用SSR標(biāo)記技術(shù)，選用100對(duì)引物在鄂茄子2號(hào)親本間進(jìn)行PCR擴(kuò)增．從中篩選出的3對(duì)引物SMl7、SM29、SM51在雙親本間能夠擴(kuò)增出差異互補(bǔ)的條帶。利用這3對(duì)引物對(duì)鄂茄子2號(hào)雜種一代群體進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果為97．1％；與同批次種子的田間鑒定結(jié)果(96．1％)接近，說(shuō)明應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)實(shí)施茄子雜種一代種子的純度鑒定是可行的．ISSR標(biāo)記的應(yīng)用群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究遺傳作圖與基因定位品種和種質(zhì)鑒定物種和種群親緣關(guān)系研究品種純度鑒定李嚴(yán)龍等將金葉女貞和平抗金葉女利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，鑒定發(fā)生變異的平抗金葉女貞品種。結(jié)果表明，平抗金葉女貞為金葉女貞品種在某一基因位點(diǎn)發(fā)生基因突變產(chǎn)生的單位點(diǎn)自然變異品種。應(yīng)用舉例SRAP標(biāo)記的應(yīng)用1

構(gòu)建遺傳圖譜2

遺傳多樣性分析3

比較基因組學(xué)4

標(biāo)定基因等楊建用RAP分子標(biāo)記，以鵝掌楸種間雜交(BMxS)Fl代群體為材料，構(gòu)建了一張鵝掌楸分子標(biāo)記連鎖遺傳圖。并