人類基因組DNA提取

人類基因組DNA提取人類基因組人類基因組是由23對染色體（共46個）所構(gòu)成，每一個染色體皆含有數(shù)百個基因，在基因與基因之間，會有一段可能含有調(diào)控序列和非編碼DNA的基因間區(qū)段。人類擁有24種不同的染色體，其中有22個屬于體染色體，另外還有兩個能夠決定性別的性染色體，分別是X染色體與Y染色體。基因組DNA是指生物細(xì)胞的染色體DNA，基因組DNA是沒有組織特異性的，無論從何種人體組織制得的DNA都是一樣的。人類基因組DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，被組蛋白緊密地包裝起來組成染色體。

1.真核生物DNA一般存在于細(xì)胞核染色體上以及線粒體上，基因組DNA一般又稱核DNA。

2.哺乳動物的一切有核細(xì)胞都可以用來制備DNA，除特殊要求外，白細(xì)胞、肝或脾組織是最常用的材料。

3.原始材料較少或較難獲得時，還必須經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)來獲得足夠量的細(xì)胞;有時為了簡便易行起見，還可以無創(chuàng)傷地采集材料，如用口腔上皮細(xì)胞、發(fā)根細(xì)胞。產(chǎn)前診斷所用的材料為胎兒的羊水細(xì)胞或絨毛膜細(xì)胞。提取基因組DNA原理基因組DNA提取主要步驟一、樣品準(zhǔn)備：1.生物組織：（1）最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存-70℃或液氮（2）液氮冷凍敲碎研磨（3）組織勻漿法（3）液氮勻漿法2.培養(yǎng)細(xì)胞懸浮生長細(xì)胞：1500g離心，4℃10分種收集細(xì)胞單層培養(yǎng)細(xì)胞：可用刮棒或胰酶消化后離心收集3.血液樣品不同組織細(xì)胞基因組DNA提取方法有所不同，分離方法也有所差異，但原理相似，因此他們具有共同的步驟：二、DNA提取不同方法：1.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯。2.甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，透析獲得DNA。3.玻璃棒纏繞法：鹽酸胍裂解細(xì)胞，裂解物鋪于乙醇上，用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。4.異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）5.表面活性劑快速制備法：用TritonX-100A或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。6.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應(yīng)。7.堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。三、DNA的濃縮不同方法：1.固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量2.丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積。3.乙醇或異丙醇沉淀：（1）需要陽離子鹽的存在，醋酸鈉最常用,NaCl對含SDS樣品好，NH4Ac去除dNDP好。PiCl沉淀RNA好，但不能用于反轉(zhuǎn)錄前。（2）沉淀溫度與時間；0℃一4℃，12000g，10分鐘，小于100bpDNA需超速離心。4.精胺沉淀法：與DNA結(jié)合后使DNA結(jié)構(gòu)凝縮沉淀，需在無鹽或低鹽溶液。四、DNA分離純化總原則1、保證核酸一級結(jié)構(gòu)完整2、排除其他分子的污染：細(xì)胞內(nèi)：蛋白質(zhì)、糖類、脂類、RNA等提取過程：有機溶劑、金屬離子、外源DNA基因組DNA提取注意事項減少化學(xué)因素對核酸的降解：

如過量酸堿減少物理因素對核酸的降解：強烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融高溫高壓防止核酸的生物降解：核酸酶的預(yù)防常用方法：

人類外周血中提取基因組DNA方法從人全血中提取基因組DNA的方法人類口腔黏膜上皮細(xì)胞提取基因組DNA方法無限增殖化人類B淋巴細(xì)胞基因組DNA提取方法從口腔上皮脫落細(xì)胞中提取實驗材料與試劑材料：人口腔上皮細(xì)胞試劑：抽提緩沖液水飽和酚氯仿/異戊醇（V/V=24：1）75%乙醇、95%乙醇TE緩沖液實驗操作步驟取材：用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，咀嚼，用分泌出的唾液反復(fù)漱口；將唾液吐到杯中。用生理鹽水洗滌，2000rpm離心10分鐘，倒掉上清液；重復(fù)1次。收集細(xì)胞沉淀。提取與純化：加入0.5ml抽提緩沖液，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至離心管，混勻，65°C溫育30min。繼續(xù)抽提緩沖液：由SDS,EDTA,蛋白酶K組成

SDS：SDS是一種已知的能夠使蛋白質(zhì)變性的去污劑。它用于確定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝膠電泳。它也可以用于核酸抽提操作中破壞細(xì)胞壁及裂解核酸蛋白復(fù)合物。在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，使DNA釋放出來。在乳液聚合反應(yīng)中，可充當(dāng)兩相溶液的乳化劑。試驗中用來裂解細(xì)胞。EDTA:一種重要的絡(luò)合劑，能和堿金屬、稀土元素和過渡金屬等形成穩(wěn)定的水溶性配合物。試驗中用來絡(luò)合鎂等二價金屬離子，防止DNA酶對DNA的降解作用。蛋白酶K:一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。返回分離蛋白質(zhì)：加入等體積（0.5ml）的飽和酚，充分顛倒混勻（不要震蕩）12000rpm*5min，上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管加入等體積氯仿/異戊醇，等體積混勻12000rpm*5min（去除蛋白質(zhì)和SDS沉淀），上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管沉淀DNA：加入2倍體積95%乙醇顛倒混勻，12000rpm*10min試劑說明：酚和氯仿/異戊醇：抽提分離蛋白質(zhì)95%乙醇：沉淀DNA去鹽：棄上清，沉淀中加入75%乙醇，12000rpm*2min輕輕去上清液，打開離心管室溫靜置5~10min儲存DNA:1、短期儲存：

4℃或-20℃存放于TE緩沖液中（TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年）。2、長期貯存在70%乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿，-70℃保存。試劑說明：75%乙醇：去鹽，洗滌DNA沉淀TE溶液：溶解DNA實驗示意圖DNA提取的應(yīng)用1.人類基因組計劃人類基因組計劃（humangenomeproject,HGP）是由美國科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的。美國、英國、法蘭西共和國、德意志聯(lián)邦共和國、日該國和中國科學(xué)家共同參與了這一價值達(dá)30億美元的人類基因組計劃。這一計劃旨在為30多億個堿基對構(gòu)成的人類基因組精確測序息。與曼哈頓計劃和阿波羅計劃并稱為三大科學(xué)計劃。2.疾病基因的定位克隆人類基因組計劃的直接動因是要解決包括腫瘤在內(nèi)的人類疾病的分子遺傳學(xué)問題。6000多個單基因遺傳病和多種大面積危害人類健康的多基因遺傳病的致病基因及相關(guān)基因，代表了對人類基因中結(jié)構(gòu)和功能完整