HPLC在藥物分析中的應(yīng)用

1、高效液相色譜及其在藥物分析中的應(yīng)用摘要：高效液相色譜法的發(fā)展非常迅猛，許許多多的新方法不斷涌現(xiàn)，它具有分離效率高，選擇性好，分析速度快，操作自動(dòng)化和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。本文主要簡(jiǎn)單介紹高效液相色譜的知識(shí)及其在藥物分析中的廣泛應(yīng)用，通過實(shí)例描述了高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)。 高效液相色譜(HPLC)是結(jié)合經(jīng)典液相色譜及氣相色譜的分離原理。由于與氣相色譜法相比，高效液相色譜法具有下列主要優(yōu)點(diǎn)：不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣可選用不同性質(zhì)的各種溶劑作為流動(dòng)相，而且流動(dòng)相對(duì)分離的選擇性有很大作用，因此分離選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。因而廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)，生物醫(yī)學(xué)，石油化工

2、，合成化學(xué)，環(huán)境監(jiān)測(cè)，食品衛(wèi)生，以及商檢，法檢和質(zhì)檢等許多分析檢驗(yàn)部門。高效液相色譜不僅僅是一種有力的分析工具，而且越益成為分離制備和純化的手段。 液相色譜在國(guó)內(nèi)和國(guó)外已被廣泛地應(yīng)用于藥物分析，尤其在我國(guó)，近十幾年來HPLC方法越來越受到重視。中國(guó)藥典1985年版才規(guī)定使用，該版只有8個(gè)品種規(guī)定使用HPLC方法檢測(cè)，到了1995版達(dá)到113個(gè)品種，2000版藥典的應(yīng)用達(dá)到了282種，2005版僅藥典一部的應(yīng)用達(dá)到了479種，涉及518項(xiàng)；藥典二部中采用高效液相色譜法的品種有848種，較2000年版增加了566次，其中復(fù)方制劑、雜質(zhì)或輔料干擾因素多的品種多采用高效液相色譜法。2010年藥典則更多

3、的用液相色譜法取代了某些藥物含量測(cè)定的薄層法，并引入了各式各樣的檢測(cè)器。由此可見，我國(guó)高效液相色譜法在藥物分析中的重要性。 1. 高效液相色譜儀的進(jìn)展 高效液相色譜(HPLC)是20世紀(jì)70年代迅速發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)，是目前各種色譜模式中應(yīng)用最廣的一個(gè)領(lǐng)域。據(jù)估計(jì)，世界上幾百萬種化合物中除20宜用氣相色譜(Gc)分離分析外，其余80的化合物，包括大(高)分子化合物、離子型化合物、熱不穩(wěn)定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC(正相HPLC、反相HPLC、離子交換色譜和離子色譜、體積排除色譜、親合色譜等)進(jìn)行分離分析。因此，自80年代以來HPLC成為國(guó)際分析化學(xué)界發(fā)展最快

4、的一個(gè)分支，無論是儀器的銷售額，還是論文的發(fā)表數(shù)，均雄居同期所有分析儀器的首位，在很多學(xué)科領(lǐng)域內(nèi)都得到了廣泛的應(yīng)用。 HPLC儀器一般由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣器（現(xiàn)有很多的都是自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)）、色譜柱、檢測(cè)器和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(工作站)組成（如圖1），制備型儀器還配有餾份收集系統(tǒng)。其中，輸液系統(tǒng)主要有高壓輸液泵，有的儀器還有在線脫氣和梯度洗脫裝置，如液相色譜儀安捷倫1200四元系統(tǒng)可以在使用不同溶劑的方法之間進(jìn)行快速切換，可以使用二元、三元和四元梯度，還有島津儀器自動(dòng)進(jìn)樣，自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。檢測(cè)器用于連續(xù)檢測(cè)色譜柱流出的物質(zhì)，進(jìn)行定性定量分析。要求其靈敏度高、噪音小、基線穩(wěn)定、響應(yīng)值的線性范圍寬等

5、。常用的有紫外檢測(cè)器，包括光二極管陣列檢測(cè)器，可快速提供檢測(cè)物的紫外光譜，以幫助鑒別。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器適用于檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的組分，主要用于檢測(cè)糖類、高級(jí)脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等，但是其靈敏度較低，此外，流動(dòng)相必須是揮發(fā)性的，不能含有緩沖鹽等。熒光檢測(cè)器只適用于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，如生物胺、維生素和甾體化合物等。安培檢測(cè)器尤其適用于痕量組分的分析，具有氧化還原活性的物質(zhì)都能檢測(cè)，如活體透析液中生物胺，酚、羰基化合物等。而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，接口部分巳取得重要進(jìn)展。由粒子束、熱噴霧，發(fā)展到最近的電噴霧接口，聯(lián)用技術(shù)日趨成熟，性能大大改進(jìn)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用能給出分析物

6、的質(zhì)譜圖，提供分析物的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)鑒別非常有利。液相色譜一雙質(zhì)變聯(lián)用增加了分離能力，并提供更多的結(jié)構(gòu)信息，檢測(cè)靈敏度也大大提高。2. 高效液相色譜在藥物分析中的應(yīng)用 高效液相色譜在藥物分析中的應(yīng)用范圍越來越廣，高效液相色譜由于具有高選擇性、高靈敏度，并可同時(shí)用于有關(guān)物質(zhì)檢查與含量測(cè)定的特點(diǎn)，已成為醫(yī)藥研究的有力工具。如在中草藥有效成分的分離和純度測(cè)定、人工合成藥物成分的定性和定量測(cè)定、新型高效手性藥物中手性對(duì)映體含量的測(cè)定以及藥物代謝物的測(cè)定等方面都需要用到HPLC的不同測(cè)定方法予以解決。而目前高效液相色譜的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的應(yīng)用更體現(xiàn)了它在藥物分析中的重要地位。2.1天然藥物分析 天然藥物的

7、來源有動(dòng)物、植物和礦物之分，其中以植物類為主。由于天然藥物的化學(xué)成分復(fù)雜，其有效成分，可能有一個(gè)，也可以有多個(gè)，這對(duì)于控制藥品質(zhì)量，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來說比較困難，HPLC可通過對(duì)天然藥物的有效成分進(jìn)行分離鑒定，再測(cè)定有效成分的含量；通過指紋圖譜建立識(shí)別模式，可以判定藥材的質(zhì)量高低。2.2 天然藥物及復(fù)方成藥分析 復(fù)方制劑、雜質(zhì)或輔料干擾因素多的品種多采用高效液相色譜法。增免扶正片系由當(dāng)歸、黨參、黃芪等十幾味天然藥物精制而成，具有益氣生津、活血養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎、健脾開胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲勞、抗衰老，長(zhǎng)期服用可扶正祛邪，提高機(jī)體免疫功能，健身強(qiáng)體，益壽延年。該藥對(duì)心、肝、脾、腎虛、納差、心腦血

8、管疾病、神經(jīng)衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有較好的防治作用。 由于化學(xué)藥品的開發(fā)費(fèi)用昂貴，而且毒副作用大，近年來人們已把目光轉(zhuǎn)向自然、民族傳統(tǒng)醫(yī)藥、草藥、植物藥等天然藥物，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前全世界60多億人口中80的人使用過天然醫(yī)藥。在全世界藥品市場(chǎng)中，天然物質(zhì)制成的藥品已占30，國(guó)際上植物藥市場(chǎng)份額已達(dá)300億美元，且每年以20 以上的速度增長(zhǎng)。HPLC分析必定能為我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化，走向世界提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。2.3 抗生素分析如甲磺酸帕珠沙星，阿奇霉素，乳酸左氧氟沙星，氟羅沙星等品種的大容量注射液的鑒別，含量測(cè)定，相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定等都采用的是HPLC法，其避免了抗生素的高濃度下抑

9、菌性強(qiáng)，微生物法時(shí)間長(zhǎng)，專一性差的特點(diǎn)。 2.4 手性藥物分析 在生物體內(nèi)，幾乎所有具有重要生理意義的有機(jī)生物分子都有手性(chirality)，絕大多數(shù)都是旋光性物質(zhì)。兩種化學(xué)組成、分子式完全相同的化合物，但因組成化合物的原子在空間取向不同，而成為鏡像的化合物，稱為手性化合物。由于對(duì)映體的物理、化學(xué)性質(zhì)相同，實(shí)現(xiàn)它們的分離就比較困難，如大多數(shù)氨基酸都有右旋體和左旋體，但往往只能獲得右旋體和左旋體的混合物。還有乳酸左氧氟沙星，其對(duì)映體右旋屬于雜質(zhì)，在HPLC中就能很好的反應(yīng)出來。、圖-2乳酸左氧氟沙星及其光學(xué)異構(gòu)體的色譜圖手性藥物往往呈現(xiàn)一種對(duì)映體具有強(qiáng)的生物活性和藥效，而另一種卻無效。近年來

10、，對(duì)手性藥物的拆分定量分析進(jìn)行了廣泛深入的研究。其中，對(duì)生物體液中藥物對(duì)映體的分離分析，有利于了解各種對(duì)映體的藥代動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)代謝過程和生物利用度。因此對(duì)手性藥物對(duì)映體的拆分也是HPLC分析的熱點(diǎn)。手性HPLC拆分法是以現(xiàn)代HPLC技術(shù)為基礎(chǔ)引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異而進(jìn)行分離。HPLC法拆分手性藥物對(duì)映體可分為直接法和間接法。前者是將不對(duì)稱中心引入分子間，可分為手性流動(dòng)相添加劑(CMP)法和手性固定相(CSP)法；后者又稱為手性試劑衍生化(CDR)法，它是將不對(duì)稱中心引入分子內(nèi)。 手性試劑衍生化法是將對(duì)映體經(jīng)手性試劑衍生，生成非對(duì)映異構(gòu)體后，利用常規(guī)HPLC方法進(jìn)行分離和測(cè)

11、定。適用于不宜直接拆分測(cè)定的化合物如手性脂肪胺類、醇類等。該法分離效果好，分離條件簡(jiǎn)便，但對(duì)手性衍生試劑的要求較高，操作比較麻煩，多在其它方法無法實(shí)現(xiàn)時(shí)才采用。對(duì)生物樣品中對(duì)映體拆分過程中，由于內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的干擾，單用HPLC分析，易造成譜峰重疊，不能直接分析體內(nèi)手性藥物。目前，使用多柱偶聯(lián)技術(shù)已成功解決了該類問題。 目前，HPLC是在手性藥物拆分中應(yīng)用最多的方法之一，可以預(yù)見，該方法因其具有快速、方便、精確的特點(diǎn)，在未來的手性藥物研究中，將得到更廣泛的應(yīng)用。2.5 在鑒別中的應(yīng)用 在HPLC法中,保留時(shí)間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān),是定性的參數(shù),可用于藥物的鑒別.如中國(guó)藥典收載的藥物頭孢

12、羥氨芐的鑒別項(xiàng)下規(guī)定:在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中,供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品主峰的保留時(shí)間一致.頭抱拉定,頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進(jìn)行鑒別. 2.6 在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用 HPLC分離效能高,靈敏,在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛.主要用于藥物中有關(guān)物質(zhì)的檢查.“有關(guān)物質(zhì)”是指藥物中存在的合成原料,中間體,副產(chǎn)物,降解產(chǎn)物等物質(zhì),這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似,含量很低,只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測(cè).若雜質(zhì)是已知的,又有雜質(zhì)的對(duì)照品,可用雜質(zhì)對(duì)照品做對(duì)照進(jìn)行檢查.若雜質(zhì)是未知的,可以采用主成分自身對(duì)照法或峰面積歸一化法進(jìn)行檢查.如甲

13、磺酸帕珠沙星等莫西沙星等沙星類，還有氟康唑，替硝唑等產(chǎn)品都是用此法做鑒別。圖-3奧硝唑有關(guān)物質(zhì)的色譜圖2.7在含量測(cè)定中的應(yīng)用 用高效液相色譜法側(cè)定含量可以消除藥物中的雜質(zhì),制劑中的附加劑及共存的藥物對(duì)測(cè)定的干擾.中藥材及其制劑組成復(fù)雜,基中不少有效成分的含量測(cè)定也越來越多地采用了高效液相色譜法.如維生素B2，B6，替硝唑，氟康唑，氟羅沙星，氯霉素等藥品，均采用此法測(cè)含量。圖-4氯霉素滴耳液的含量測(cè)定色譜圖2.8 在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用 HPLC由于測(cè)定迅速準(zhǔn)確，流動(dòng)相選擇范圍廣，靈敏度高(10-12 gmL以上)，填充柱種類多，且可供選擇的檢測(cè)器也多。所以是實(shí)驗(yàn)室研究中一種很好的體內(nèi)分析方法

14、。在國(guó)內(nèi)外都很受重視大多數(shù)藥物都有紫外吸收，所以最常用的檢測(cè)器是紫外檢測(cè)器。多數(shù)藥物及內(nèi)源性物質(zhì)極性均較大，利用其極性差，可以采用RP-HPLC色譜柱，可獲得良好分離效果。3 .液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Liquid Chromatrography-Mass Spectrometry)是當(dāng)代最重要的分離和鑒定方法之一。它是以HPLC為分離手段,M S為檢測(cè)器的一門綜合性分析技術(shù),它集LC的高分離能力與MS的高靈敏度、極強(qiáng)的定性專屬特 異性于一體,成為藥物分析研究中不可或缺的有效工具。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/MS )由于彌補(bǔ)了傳統(tǒng)LC檢測(cè)器的不足,在過

15、去的10年中有力地推動(dòng)了藥物分析研究。目前,許多劑量小藥效強(qiáng)的藥物及其代謝產(chǎn)物多為極性強(qiáng)、難揮發(fā)的化合物,而且藥物隨著生物技術(shù)的發(fā)展,極性較強(qiáng)的生物活性化合物如多肽和高分子量的蛋白將占有越來越重要的地位。因此LC-MS作為一種高靈敏度和高選擇性的方法來分析上述化合物,將在藥物分析研究領(lǐng)域中起著重要的作用。尤其是對(duì)藥物的吸收、分布、代謝和排泄的研究,已部分提前到化合物篩 選階段進(jìn)行。而LC/MS接口技術(shù)的不斷改進(jìn),與強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)分析、定性和定量能力相結(jié) 合,較好地適應(yīng)了現(xiàn)代體內(nèi)藥物分析研究對(duì)高精密度和準(zhǔn)確度分析方法的需求,而獲得廣泛應(yīng)用。 LC-MS在藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用及其進(jìn)展質(zhì)譜作為液相色譜的一

16、個(gè)選擇性檢測(cè)器,大大增強(qiáng)了 LC的鑒定能力,因此LC-MS是分析和鑒定復(fù)雜混合物的強(qiáng)有力的工具,尤其適用于痕量測(cè)定的藥物分析領(lǐng)域,其在藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用已有所報(bào)道。 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ),將色譜的高分離性能和質(zhì)譜鑒別力強(qiáng)的特點(diǎn)相結(jié)合,組成了較完善的現(xiàn)代分析技術(shù)。正是由于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有高度的專屬性,對(duì)多數(shù)藥物的檢測(cè)靈敏度超過其他分析方法, 使定量測(cè)試速度顯著加快,可以對(duì)混合物中的微量組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,適應(yīng)了現(xiàn)代體內(nèi)藥物分析研 究中高通量和高精度的要求,無疑已經(jīng)成為藥物動(dòng)力學(xué)和代謝研究的核心分析技術(shù)。而且隨著現(xiàn)代 化高新技術(shù)的不斷發(fā)展及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)自

17、身的優(yōu)點(diǎn),液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)必將在未來幾年不斷發(fā)展且在藥物分析中發(fā)揮越來越重要的作用。4 .展望 中國(guó)加入WT0，這無疑給中國(guó)的醫(yī)藥行業(yè)帶來了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。在本世紀(jì)初年中國(guó)要完成醫(yī)藥企業(yè)的GMP認(rèn)證。許多企業(yè)由于在生產(chǎn)設(shè)備及檢測(cè)設(shè)備落后，而不能通過GMP認(rèn)證，企業(yè)將害被無情地淘汰出所行也。液相色譜的應(yīng)用大大加快中國(guó)醫(yī)藥行業(yè)同國(guó)際接軌的步伐，為我們參與競(jìng)爭(zhēng)打下基礎(chǔ)。中國(guó)的醫(yī)藥要想走出國(guó)際。尤其是中藥，必須要達(dá)到歐洲、美國(guó)、日矗等發(fā)達(dá)國(guó)家的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這是制約我國(guó)中藥現(xiàn)代化、科學(xué)化與國(guó)際接軌需要解決的首要問題。中藥材質(zhì)量的研究目前基本上停留在質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究的階段。最近，一些先進(jìn)的檢測(cè)儀器成功的用在了高效液相色譜分析法上，使得高效液相色譜的應(yīng)用更廣泛，并充分利用高效快速、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，建立更加系統(tǒng)的成分分析方法。以HPLC為主，同其它撿測(cè)手段如質(zhì)譜、核磁共振、紅外光譜等技術(shù)聯(lián)用，以及與分子生物學(xué)、現(xiàn)代分子藥理學(xué)相結(jié)合，必將在中藥分析中發(fā)揮很大作用，也是質(zhì)量規(guī)范化、國(guó)際化的重要途徑。 藥品是用于預(yù)防、治療和診斷疾病，有目的地調(diào)節(jié)人體生理功能并規(guī)定有適應(yīng)征或者功能主治、用法和用量的物質(zhì)。藥品是一種特殊商品，藥品質(zhì)量的好壞關(guān)系到用藥的安全和有效、關(guān)系到人民的身體健康和生命安全。因此，藥品的質(zhì)量控制具有特