PCR原理及各類PCR儀

PCR原理及各類PCR儀PCR原理PCR全稱是PolymeraseChainReaction，即聚合酶鏈式反應，是一種用于體外擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，PCR的最大特點，是能將微量的DNA通過復制大幅增加。PCR技術發(fā)展歷程普通PCR（梯度）熒光定量PCR數(shù)字PCR普通PCR（梯度）簡單進行DNA復制擴增，然后可用電泳或者紫外分光光度計進行擴增產(chǎn)物的檢測。目的：大量獲得復制的DNA產(chǎn)物普通PCR儀（梯度PCR儀）其實就是一臺溫控儀！關鍵部件是溫控模塊！PCR反應圖解和要素要素1、模板DNA2、dNTP3、Taq酶4、引物5、精確的變化的溫度衡量普通PCR儀的參數(shù)

（以thermo的Arktik為例）樣品模塊規(guī)格：96×0.2ml、384×0.03ml、雙48孔×0.2ml溫度梯度范圍：1-30℃升降溫速率：>3℃/s溫度均一性：±0.4℃（95℃時）溫度精確性度：±0.3℃溫控范圍：4-99.9℃熱蓋溫控范圍：30-110℃可調(diào)用戶界面：反應曲線圖顯示尺寸重量電壓數(shù)據(jù)交換（USB接口）保質(zhì)期PCR儀三種控溫方法的區(qū)別

（calculated、block、probe）

以bio-rad的PCT-200型PCR儀為例：

A）計算控制（calculated）

計算控制在運行大多數(shù)程序中是最好的溫度控制方法，具有較好

的溫度一致性、可靠性。用計算控制時，儀器通過對樣品的管子或玻

片熱傳導的速度和樣品體積進行模塊溫度估算（當運行程序時，這些

樣品信息都會顯示）。因為這種估算是根據(jù)已知容量和熱力學的規(guī)律，

所以溫度比模塊或探針控制更加精確。運行計算控制能縮短實驗時

間，簡短的程序操作能保護酶的活性并減少引物的損失。

B）模塊控制（block）

模塊控制與計算控制精度相比較低。在模塊控制下，樣品溫度通

常是在模塊后才到達設置的溫度。這段延遲時間主要是因為管子的類

型和樣品體積引起的。

C）探針控制（probe）

通常，探針控制可用于不同的環(huán)境中，但是它需要小心使用。探

針不能用于微型板和玻片。

市場上主要的品牌和產(chǎn)品AB：2720、9700、ProFlex、VeritiBio-Rad：MJMini、MyCycler、PTC200、PTC240、C1000、S1000Eppendorf：MastercyclerproS/pro/pro384熒光定量PCR熒光定量PCR：在PCR反應體系中加入熒光基團，PCR反應過程中，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對起始模板進行定量分析的方法。目的：獲得初始模板DNA的濃度。熒光定量PCR儀的關鍵是溫控和熒光激發(fā)、檢測系統(tǒng)！如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數(shù)。定量原理

確定初始模板的濃度初始DNA量越多,熒光達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量熒光定量PCR兩種GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA1、染料法SYBRGreen1染料只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光2、探針法衡量熒光定量PCR儀的參數(shù)（招標）

（以AB7500為例）1工作條件：220V電壓，10A電源。相對濕度<80%。熱功率<2600W

2技術規(guī)格2.1熱循環(huán)系統(tǒng)2.1.1 加熱冷卻方式:半導體2.1.2 升降溫速率:3.5℃/秒以上*2.1.3溫度范圍:4℃-99.9℃*2.1.4控溫精確度:±0.25℃2.2樣品系統(tǒng)2.2.1 樣品通量:單管、8聯(lián)管、96孔板，并無需適配器2.2.2 反應體積:10-100ul2.2.3 運行時間:<2小時2.2.4 機械設計:樣品無需移動2.2.5反應后保存:可降溫至4℃保存2.3熒光系統(tǒng)2.3.1 熒光染料：FAMTM/SYBRGreenI,VIC/JOETM,NEDTM/TAMRATM/Cy3,ROXTM/TexasRed,Cy52.3.2 熒光校正：軟件支持Rox熒光校正去除誤差2.4光學系統(tǒng)2.4.1 激發(fā)光源：鹵鎢燈，配備時間監(jiān)測及自我診斷程序2.4.2 濾光系統(tǒng)：五色光源濾光片結合熒光濾光片（630nm-650nm，570nm-590nm，540nm-550nm，510nm-530nm，455nm-485nm）2.4.3 檢測系統(tǒng)：CCD攝像機一次成像2.4.4 檢測方式：實時動態(tài)檢測，動態(tài)顯示，可同時檢測5種熒光染料，必須有520nm，550nm，580nm，610nm，650nm這五塊濾光片*2.4.5實驗要求：必須能同時檢測FAM、VIC、TAMRA、ROX四種熒光，能進行探針法定量，開展CNV研究2.5 檢測性能2.5.1檢測靈敏度：能檢測到≤10個拷貝數(shù)的模板，置信度99.7%2.5.2線性范圍：109以上2.5.3檢測分辨率：99.7%置信度下能有效分辨5000和10000模板拷貝數(shù)的差異2.6分析功能2.6.1定量量型：能進行絕對定量和相對定量,可同時對無限個數(shù)據(jù)同時進行分析，比對和作柱形圖2.6.3分析應用：可以進行熔解曲線分析、突變分析、等位基因分析等2.7軟件系統(tǒng)

2.7.1 定量PCR軟件：有絕對定量和相對定量軟件*2.7.2PrimerExpress軟件：有，含正版引物與探針設計軟件，可進行TaqmanMGB探針的設計及合成2.7.3 熒光校正軟件：有*2.7.4拷貝數(shù)分析軟件：有，含CopyCaller分析軟件2.7.5 獨立相對定量軟件：有，可同時對無限個數(shù)據(jù)同時進行分析*2.7.6SNP分析軟件：有，含AutoCaller分析軟件2.8試劑盒2.8.1 安裝試劑盒：有2.8.2 基本試劑盒：原廠家可提供完備的基本試劑盒供選擇2.8.3 SNP試劑盒：可提供原廠家500萬種SNP檢測試劑盒

2.8.4 轉基因檢測試劑盒：原廠家可提供國際標準的轉基因檢測試劑盒2.8.5 拷貝數(shù)試劑盒：可提供原廠家160萬種SNP檢測試劑盒并有配套分析模塊2.8.6 藥物代謝酶分型試劑盒：原廠家可提供藥物代謝酶SNP分型試劑盒2.8.7MicroRNA分析試劑盒：原廠家可提供包含有針對人、小鼠、大鼠、擬南芥、果蠅和線蟲的MicroRNA分析產(chǎn)品。2.8.8 基因表達試劑盒：可提供原廠家100萬種基因表達檢測試劑盒*2.9 試劑、耗材：開放式2.10 裝機指標：99.7%的置信度下分辨5000和10000模板拷貝數(shù)的差異3基本配置和附件3.1商用主流計算機及UPS3.2安裝試劑盒和純熒光校正板3.3RNASEP校驗板3.4SDS系統(tǒng)操作軟件3.5PrimerExpress3.0引物和探針設計軟件

4選件：無

5資格證明：有ISO9001質(zhì)量認證，符合CE認證，有醫(yī)療器械注冊證

6技術服務

6.1安裝、調(diào)試：需要原生產(chǎn)廠家現(xiàn)場安裝調(diào)試6.2培訓：需要原生產(chǎn)廠家進行安裝培訓和售后培訓6.3技術資料：全套安裝、操作和維護使用說明書，軟件免費更新

7質(zhì)量保修期7.1保修期：自驗收合格日起整機（包括配件）一年全保，終身維護

7.2保修點：國內(nèi)至少三個保修點可提供部件更換，原廠專業(yè)維修

*8其他要求：近5年內(nèi)浙江省定量PCR（須為96孔板標準型配置），用戶不少于100個，提供詳細清單。市場上主要的品牌和產(chǎn)品ABI：7000、7300、7500、7700、7900HT、StepOnePlus、StepOne、PRISMStepOne；2015年新發(fā)產(chǎn)品：7300Plus??！BIO-RAD：CFX96、iQ5、MyiQ、DNAEngineOpticon2、Chromo4、MiniOpticon；Stratagene：MX3000P、MX3005P；Roche：LightCycler

480、LightCycler2.0、LightCyclerNano；Eppendorf：Masercycler；數(shù)字PCR數(shù)字PCR即DigitalPCR（dPCR)，是一種核酸分子絕對定量技術。相較于熒光定量PCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的絕對定量。應用：1、絕對定量2、稀有突變檢測（傳染病研究如HIV）3、轉基因檢測4、環(huán)境樣本檢測5、單細胞基因表達6、病毒載量鑒定數(shù)字