多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段-

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR技術(shù))，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段溫故知新1:組成DNA分子的基本單位是什么?這些基本單位是如何連接成DNA分子的?DNA分子結(jié)構(gòu)有什么特點？12345DNA的基本單位－脫氧核苷酸OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖磷酸二酯鍵ATGCAGCTDNA分子的平面結(jié)構(gòu)氫鍵5'端3'端5'端3'端DNA分子的復(fù)制過程是怎樣的？DNA分子的復(fù)制需要哪些條件？溫故知新2DNA母鏈：提供復(fù)制的模板解旋酶：打開DNA雙鏈4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈ATP：為復(fù)制過程提供能量引物：使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸DNA復(fù)制的條件復(fù)制特點半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點復(fù)制。DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物2、DNA聚合酶作用過程當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸一、基礎(chǔ)知識

（一）PCR原理：①在80～100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性3、PCR原理②當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化4、TaqDNA聚合酶的應(yīng)用5、緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出6、PCR技術(shù)的特點①PCR過程需要的引物是RNA或DNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20－30個脫氧核苷酸7、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制PCR不同點解旋解旋酶，邊解旋邊復(fù)制80～100℃高溫解旋，雙鏈完全分開酶DNA解旋酶，DNA聚合酶，DNA連接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加溫度體內(nèi)溫和條件高溫子鏈合成一條鏈連續(xù)（先導(dǎo)鏈），另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由DNA連接酶連接（滯后鏈）兩條子鏈均連續(xù)合成相同點①需要提供DNA復(fù)制模板②四種脫氧核苷酸作為原料③子鏈延伸的方向都是從5’端到3’端細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制與PCR的比較PCR技術(shù)的原理總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DNA分子的擴(kuò)增。體外DNA復(fù)制的條件：四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。（二）PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復(fù)性和延伸①變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備2、循環(huán)過程靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性②復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火③延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸靶序列靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列3、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量1

22

43

820

1,048,57630

1,073,741,824二、PCR的反應(yīng)過程小結(jié)5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制55

55

5

5模板DNA55

555

5

5525～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬（220）倍以上。每個循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)過程：PCR反應(yīng)條件：

①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境②DNA模板③分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物④A、T、G、C四種脫氧核苷酸

⑤耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶

⑥能嚴(yán)格控制溫度變化的溫控設(shè)備三、PCR的實驗操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次PCR儀微量離心管微量移液器1、準(zhǔn)備2、移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑①過程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻。A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實驗中脫落或液體外溢。將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。①過程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s。4、離心5、反應(yīng)②離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。PCR三步曲預(yù)變性保溫變性94℃30s延伸72℃1min復(fù)性55℃30s94℃5min循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6、注意事項①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；②PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計算四、課題成果評價1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過計算DNA含量來評價擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)稀釋2μLPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零測定取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值計算DNA含量（g/ml）＝50×(260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)2.過程比色杯五、實驗小結(jié)

PCR儀加熱使（）變性,復(fù)性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復(fù)制的起點,合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,經(jīng)（）三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補(bǔ)Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復(fù)性和延伸72℃1.提示