多沙唑嗪對(duì)映體在動(dòng)物心血管系

多沙唑嗪對(duì)映體在動(dòng)物心血管系統(tǒng)的手性藥理學(xué)研究研究生姓名：孫家安導(dǎo)師：任雷鳴教授引言多沙唑嗪（doxazosin，DOX）最早由Pfizer制藥公司研制成功并于1988年首先在丹麥上市喹唑啉環(huán)衍生物,選擇性α1受體阻斷劑同時(shí)擴(kuò)張阻力血管和容量血管臨床應(yīng)用良性前列腺增生患者下尿路癥狀降低血壓對(duì)血脂代謝有良好的改善作用明顯降低血漿甘油三酯和總膽固醇水平，能降低低密度脂蛋白、提高高密度脂蛋白膽固醇水平，使HDL/LDL和（HDL-C）/TC比值顯著升高，減少血管壁的膠原合成，明顯降低冠狀動(dòng)脈疾病的易患性和危險(xiǎn)性DOX的意外退出多沙唑嗪提前退出抗高血壓和降脂治療預(yù)防心肌梗死的大規(guī)模臨床試驗(yàn)（ALLHAT）α受體阻斷劑也因此退出了高血壓治療的一線用藥（JNC7)DOX是否會(huì)導(dǎo)致心力衰竭及致心衰作用是否源于其α受體阻斷作用一直飽受爭(zhēng)議最近的大規(guī)模臨床研究又發(fā)現(xiàn)多沙唑嗪作為追加用藥用于治療高血壓病不會(huì)增加心力衰竭的發(fā)病率(ASCOT)目前DOX作為高血壓治療的輔助用藥仍然在臨床得到廣泛的應(yīng)用，尤其適用于同時(shí)合并有高血壓及BPH患者的治療多沙唑嗪對(duì)映體多沙唑嗪存在一對(duì)對(duì)映體[(-)DOX與(+)DOX]，而目前應(yīng)用于臨床的是其外消旋體[(±)DOX]。生物體內(nèi)廣泛存在具有手性識(shí)別能力的生物大分子，當(dāng)手性藥物與其相互作用時(shí)將產(chǎn)生立體選擇性的不同效應(yīng)，從而體現(xiàn)不同的藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特征。因此，DOX對(duì)映體在生物體內(nèi)的立體選擇性研究有著重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義。在不同組織的立體選擇性前列腺組織的選擇性，(-)DOX、(+)DOX及(±)DOX三者的pA2值相近(-)DOX、(+)DOX和(±)DOX拮抗苯腎上腺素誘發(fā)兔膀胱逼尿肌收縮反應(yīng)的pKB

值相近(-)DOX在兔離體胸主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈、耳動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和肺動(dòng)脈五種血管標(biāo)本上血管平滑肌α1受體的拮抗參數(shù)均明顯小于(+)DOX我們研究了(±)DOX及其兩種對(duì)映體對(duì)離體心房心肌收縮力和心率的影響，并與同樣是喹唑啉類高選擇性α受體阻斷藥的阿夫唑嗪（alfuzosin，ALF）及其對(duì)映體做了對(duì)比。心功能受損時(shí)導(dǎo)致激素與促炎細(xì)胞因子分泌腦利鈉肽（BNP）、核因子-κB（NF-κB）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）均是心力衰竭發(fā)生的血清生物學(xué)標(biāo)志物。BNP是在心室張力增加時(shí)主要由心室分泌的一種激素物質(zhì)，具有利尿利鈉的作用。NF-κB是廣泛存在于體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控炎癥介質(zhì)及免疫反應(yīng)基因的表達(dá)。多種病因心力衰竭患者的體內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)存在NF-κB的激活。IL-6是一種重要的炎癥介質(zhì)，其血清濃度也與心力衰竭心肌收縮力有相一定關(guān)系。DOX對(duì)心肌收縮力影響的機(jī)制DOX對(duì)映體的α受體阻斷外作用蛋白激酶C通過激活Na+/K+ATP酶、肌鈣蛋白和ATP敏感鉀通道，降低心肌收縮力磷脂酶C的使二磷酸磷酯酰肌醇(PIP2)磷酸化產(chǎn)生三磷酸肌醇（IP3），刺激大鼠心肌收縮。NO可活化鳥苷酸環(huán)化酶，通過cGMP-PKG信號(hào)途徑調(diào)控心肌細(xì)胞的L型鈣通道，產(chǎn)生抑制心肌收縮力的作用。而cAMP也參與了藥物誘導(dǎo)大鼠心肌正性肌力作用的機(jī)制。血漿蛋白結(jié)合研究的意義藥物與血漿蛋白結(jié)合的變化顯著影響其藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。對(duì)映體蛋白結(jié)合率的不同往往是它們藥代動(dòng)力學(xué)差異的原因之一。對(duì)映體蛋白結(jié)合的立體選擇性研究是明確其藥理學(xué)效應(yīng)、臨床療效及安全性必不可少的內(nèi)容。我室研究發(fā)現(xiàn)多沙唑嗪對(duì)映體對(duì)心肌收縮力具有相反的作用，且服用消(±)DOX后兩對(duì)映體的血藥濃度不同有必要對(duì)多沙唑嗪對(duì)映體蛋白結(jié)合的立體選擇性進(jìn)行研究。研究?jī)?nèi)容多沙唑嗪對(duì)映體對(duì)心率、心肌收縮力及心衰生物學(xué)標(biāo)志物的影響多沙唑嗪對(duì)映體在大鼠、犬和人血漿中的蛋白結(jié)合率研究多沙唑嗪對(duì)映體誘發(fā)大鼠心房肌收縮力變化的作用機(jī)制第一部分

多沙唑嗪對(duì)映體對(duì)心率、心肌收縮力及心衰生物學(xué)標(biāo)志物的影響

研究?jī)?nèi)容本研究采用小鼠離體心房組織，觀察(±)DOX及其兩種對(duì)映體、(±)ALF及其兩種對(duì)映體對(duì)小鼠離體心房心肌收縮力和心率的影響觀察長(zhǎng)期給予多沙唑嗪及其對(duì)映體對(duì)大鼠血漿氨基末端腦鈉肽前體（amino-terminalpro-brainnatriureticpeptide，NT-proBNP）、IL-6及NF-κB水平的不同影響。

材料與方法

儀器FA2004型電子天平

SC-15數(shù)控超級(jí)恒溫槽

BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

YSD-4G藥理生理實(shí)驗(yàn)多用儀DNM-9602酶標(biāo)儀白洋B600B臺(tái)式低速離心機(jī)

藥品

甲磺酸消旋多沙唑嗪

華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司甲磺酸左旋多沙唑嗪

華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司甲磺酸右旋多沙唑嗪

華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司甲磺酸消旋阿夫唑嗪

華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司甲磺酸左旋阿夫唑嗪

華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司甲磺酸右旋阿夫唑嗪

華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司NT-proBNP檢測(cè)試劑盒

上海源葉生物有限公司NF-κB檢測(cè)試劑盒

上海源葉生物有限公司Interleukin-6檢測(cè)試劑盒

上海源葉生物有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠，雄性，體重35~45g；SD大鼠，雄性，300~320g，均由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于室溫23℃±1℃，相對(duì)濕度50±5%，明暗各12小時(shí)的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自由進(jìn)食和飲水。

標(biāo)本的制備

右心房（含竇房結(jié)）標(biāo)本以25%烏拉坦（1.5g·kg-1）腹腔注射麻醉動(dòng)物后，經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物。小鼠處死后，迅速開胸，剪斷與心臟相連大血管，取出心臟置于95%O2+5%CO2預(yù)飽和的冷Krebs溶液中，沿房室溝剪去心室，小心剪下右心房（勿損傷竇房結(jié)）。在右心房?jī)啥思獠扛飨狄唤z線，一端固定于麥?zhǔn)显〔鄣撞浚硪欢诉B接張力換能器，并通過生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（BL-420E+）記錄右心房自發(fā)性收縮反應(yīng)。麥?zhǔn)显〔蹆?nèi)盛有10ml的Krebs溶液，持續(xù)充以95%O2+5%CO2的混合氣體，維持溫度37±0.25℃。初始前負(fù)荷0.8g，10min后以0.1g單位逐步升高前負(fù)荷，直至標(biāo)本的收縮反應(yīng)達(dá)到最適狀態(tài)。平衡1h，其間每20min換液一次。標(biāo)本平衡1h后開始實(shí)驗(yàn)。

左心房標(biāo)本

同法取出心臟標(biāo)本，沿房室溝剪去心室，小心剪下左心房。在左心房?jī)啥思獠扛飨狄唤z線，一端固定于帶有刺激電極的支架上，置于麥?zhǔn)显〔鄣撞?，另一端連接張力換能器。初始前負(fù)荷0.5g，標(biāo)本平衡30min后，電刺激（波寬2ms，頻率4Hz，120%閾電壓）驅(qū)動(dòng)左心房肌收縮，并通過生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（BL-420E+）記錄心肌收縮時(shí)的張力變化。電刺激期間，以0.1g單位逐步升高前負(fù)荷，直至標(biāo)本的收縮反應(yīng)達(dá)到最適狀態(tài)。麥?zhǔn)显〔蹆?nèi)盛有10mlKrebs溶液，連續(xù)充以95%O2+5%CO2的混合氣體，維持溫度在37±0.25℃。電刺激1h后開始實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組和處理

(±)DOX和(±)ALF及二者的對(duì)映體對(duì)小鼠離體右心房心率的影響

實(shí)驗(yàn)分七組，即(-)DOX、(+)DOX、(±)DOX、(-)ALF、(+)ALF、(±)ALF組和溶劑對(duì)照組。六個(gè)藥物的濃度均配制成2mmol·L-1。按照3、10和30μmol·L-1的終濃度，采用累積給藥法加入浴槽中，每個(gè)標(biāo)本只給予一種藥物。溶劑對(duì)照組同法給予等容積的蒸餾水。記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，對(duì)于給藥后出現(xiàn)停博的標(biāo)本不再計(jì)數(shù)心率；其他標(biāo)本均按實(shí)際標(biāo)本數(shù)計(jì)數(shù)心率指標(biāo)。以第一次給藥前10s內(nèi)的平均心率作為藥前值；每次給藥后，記錄藥后第20min時(shí)10s內(nèi)的平均心率作為藥物的效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)分組和處理

(±)DOX和(±)ALF及二者的對(duì)映體對(duì)小鼠離體左心房心肌收縮力的影響電刺激1h后，開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組、藥物配制、給藥方法同小鼠離體右心房實(shí)驗(yàn)。記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，以第一次給藥時(shí)的前3s內(nèi)平均收縮張力作為藥前值；給藥后，記錄藥后第20min時(shí)3s內(nèi)的平均收縮張力作為藥物的反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)分組和處理

(±)DOX及其對(duì)映體12周連續(xù)灌胃給藥對(duì)大鼠血漿NT-proBNP、NF-κB及IL-6的影響SD大鼠40只，按體重隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、(-)DOX組、(+)DOX組、(±)DOX組，每組10只。溶劑對(duì)照組灌服等容量蒸餾水，給藥組均給予相應(yīng)的藥物（8mg·kg-1），給藥容積10ml·kg-1。每周固定時(shí)間稱大鼠體重一次，根據(jù)新的體重調(diào)整給藥劑量。每周給藥7天，連續(xù)12周。末次給藥前大鼠禁食12小時(shí)，給藥后8小時(shí)，戊巴比妥鈉（50mg·kg-1）皮下注射麻醉大鼠，沿腹白線切開大鼠腹部，小心剝離，暴露大鼠腹主動(dòng)脈,采用一次性使用靜脈采血針及生化管（含肝素抗凝劑）收集大鼠血液5mL，-20℃保存，離心3000轉(zhuǎn)，10分鐘，分離血漿，保存于-20℃冰箱。

指標(biāo)檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法測(cè)定NT-proBNP、NF-κB及IL-6濃度。從室溫放置20min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔各孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL。用封板臘封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60min；棄去液體，吸水紙拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min；甩去洗滌液，吸水紙拍干，反復(fù)5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；每孔再加入終止液50μL；15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度（OD）值。在EXCEL工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，以O(shè)D值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以實(shí)測(cè)值和變化率的mean±SD表示。同一藥物不同濃度間的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析和Dunnett'stest；兩組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較采用組間t檢驗(yàn)。血漿指標(biāo)的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析和Bonferroni'stest。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖形處理使用GraphPadPrismversion5.00軟件（SanDiegoCaliforniaUSA）。結(jié)

果

Cardiacarrestofisolatedmouserightatriuminducedbydoxazosin,alfuzosinandtheirenantiomersGroupsnCardiacarrestnumbers/Preparationnumbers3μmol·L-110μmol·L-130μmol·L-1Doxazosin(-)Doxazosin

120/12(0)0/12(0)1/12(8.3)

(+)Doxazosin160/16(0)0/16(0)5/16(31.3)(±)Doxazosin120/12(0)1/12(8.3)1/12(8.3)Alfuzosin(-)Alfuzosin100/10(0)0/10(0)0/10(0)(+)Alfuzosin100/10(0)0/10(0)0/10(0)(±)Alfuzosin120/12(0)0/12(0)0/12(0)Percentageofchangeisindicatedinparenthesis.Concentration(μmol·L-1)Heartrate(beats·min-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin(±)Doxazosin0346.67±38.46348.33±33.53366.25±34.03356.67±44.183333.33±33.39300.00±42.64230.00±82.30**293.33±35.51*(-3.51±7.16)(-13.63±12.73)＃＃(-38.90±22.13)△△(-16.98±11.34)△△＃＃10338.33±39.50218.33±82.00**143.75±77.71**174.55±57.33**(-2.26±7.12)(-35.19±25.35)△△＃＃(-61.30±20.96)△△(-50.26±18.18)△△30335.00±36.31172.73±80.63**61.82±47.71**89.09±45.92**(-3.15±6.44)(-45.09±34.69)△△＃＃(-83.47±12.23)△△(-74.97±15.66)△△EffectsofdoxazosinanditsenantiomersonheartrateintheisolatedmouserightatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=11.*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug,△△

P<0.01vscontrol,＃＃P<0.01vs(+)doxazosin.

Effectsofalfuzosinanditsenantiomersonheartrateintheisolatedmoucerightatrium

ConcentrationHeartrate(beats·min-1)(μmol·L-1)Control(-)Alfuzosin(+)Alfuzosin(±)Alfuzosin0346.67±38.46328.00±34.25360.00±48.07340.00±22.563333.33±33.39314.00±28.36342.00±50.29330.00±31.33(-3.51±7.16)(-3.68±10.08)(-4.91±6.82)(-2.96±6.14)10

338.33±39.50298.00±30.48326.00±38.93320.00±33.03(-2.26±7.12)(-8.73±8.71)

△(-9.03±7.30)△(-5.85±7.55)30335.00±36.31282.00±25.73**306.00±32.73*305.00±34.25*(-3.15±6.44)(-13.05±7.27)△△(-14.27±9.75)

△△(-10.32±7.75)△△Percentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=10~12.*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug,△P<0.05,

△△P<0.01vscontrol.ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin(±)Doxazosin0120.00±32.66123.00±32.34135.00±27.59126.00±33.733116.00±34.71148.00±36.45126.00±28.36147.00±65.84(-3.80±6.87)(21.56±17.28)△△(-6.86±10.27)(14.33±27.98)△10118.00±46.62205.00±54.21**119.00±31.43160.00±55.38(-4.06±11.87)(67.59±25.32)△△#(-12.39±13.69)△(28.01±37.82)△△30114.00±35.34307.00±82.87**114.00±30.98220.00±72.72**(-5.71±5.07)(151.51±49.05)△△##(-15.89±12.98)△△(78.43±58.68)△△EffectsofdoxazosinanditsenantiomersoncontractileforceintheisolatedmouceleftatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=10.*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug,△P<0.05,△△P<0.01vscontrol,#P<0.05,##P<0.01vs(±)doxazosin.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Alfuzosin(+)Alfuzosin(±)Alfuzosin0120.00±32.66122.00±46.62117.00±26.69129.00±33.813116.00±34.71121.00±48.18115.00±31.71121.00±33.48(-3.80±6.87)(-1.43±9.55)(-1.75±12.86)(-6.47±3.80)10118.00±46.62117.00±44.73114.00±28.36121.00±38.43(-4.06±11.87)(-3.69±10.21)(-1.07±19.12)(-6.70±10.42)30114.00±35.34120.00±49.22115.00±25.50125.00±33.42

(-5.71±5.07)(-2.08±10.87)(-0.67±14.55)(-2.96±7.38)EffectsofalfuzosinanditsenantiomersoncontractileforceinthemouceisolatedleftatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=10.Concentration(ng·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin(±)DoxazosinNT-proBNP475.55±150.21635.00±343.52*375.55±127.09424.12±134.19NF-κB

888.46±343.36705.77±193.34*1140.00±365.26910.38±276.39IL-648.81±23.3975.13±21.5859.44±23.1770.19±37.44EffectsofdoxazosinanditsenantiomersonplasmaNT-proBNP,NF-κBandIL-6levelsintheratDatawereexpressedasmean±SD,n=10.*P<0.05vs(+)doxazosin.小結(jié)

DOX對(duì)小鼠離體心房的心率和心肌收縮力具有明顯的影響，高濃度尚可誘發(fā)心臟停博反應(yīng)；DOX的手性結(jié)構(gòu)對(duì)其上述活性具有明顯的影響。ALF僅輕度抑制小鼠心率，ALF的手性結(jié)構(gòu)對(duì)其心臟效應(yīng)無明顯影響。長(zhǎng)期灌胃給予DOX及其對(duì)映體未顯著影響大鼠心衰生物學(xué)標(biāo)志物NT-proBNP及IL-6的血漿濃度；但是，(+)DOX組大鼠的血漿NF-κB水平顯著高于(-)DOX組，提示(+)DOX對(duì)機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)有一定的影響。第二部分

多沙唑嗪對(duì)映體誘發(fā)大鼠心房肌收縮力變化的作用機(jī)制

ALLHAT實(shí)驗(yàn)中，DOX組具有較高的心血管事件，尤其是誘發(fā)充血性心力衰竭，因此使α受體阻斷劑退出了高血壓治療的一線用藥。然而在正常生理狀態(tài)下，對(duì)于心肌收縮力而言α1受體的影響相對(duì)于β受體微不足道我們實(shí)驗(yàn)室首次證實(shí)了DOX分子結(jié)構(gòu)中的手性碳原子，對(duì)其對(duì)映體阻斷兔前列腺平滑肌功能性α1A受體的活性無影響；但是顯著影響了其對(duì)映體阻斷大鼠主動(dòng)脈功能性α1D受體的活性。DOX兩對(duì)映體在大鼠離體心房肌標(biāo)本，產(chǎn)生了非α1受體介導(dǎo)的、完全相反的兩種變力效應(yīng)。

有研究發(fā)現(xiàn)(+)DOX可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，使心肌細(xì)胞數(shù)減少，并且這種作用與藥物阻斷α受體無關(guān)。Lee等發(fā)現(xiàn)，(+)DOX可抑制房室結(jié)組織的I(Ca，L)電流，致心律失常發(fā)生；而同為喹唑啉類的α受體阻斷藥bunazosin無此作用。在前述研究中，我們?cè)俅巫C實(shí)，(+)DOX對(duì)小鼠離體心房的心率和心肌收縮力具有明顯的影響，高濃度尚可誘發(fā)心臟停博反應(yīng)；DOX的手性結(jié)構(gòu)對(duì)其上述活性具有明顯的影響。相反，同為喹唑啉類的α1受體阻斷劑阿夫唑嗪的手性結(jié)構(gòu)對(duì)其心臟效應(yīng)無明顯影響。有關(guān)(+)DOX產(chǎn)生的非α1受體介導(dǎo)的心臟作用，國(guó)際上已有一些文獻(xiàn)報(bào)道

建立了(-)DOX誘發(fā)的大鼠離體左心房正性肌力模型以及(+)DOX誘發(fā)的大鼠離體左心房負(fù)性肌力模型；酚芐明阻斷α1受體和α2受體、阿托品阻斷M膽堿受體、普萘洛爾阻斷β受體、吲哚美辛阻斷前列腺素合成、維拉帕米阻斷L-型鈣通道、亞甲藍(lán)抑制可溶性鳥苷酸環(huán)化酶、H-89抑制cAMP依賴性蛋白激酶等條件下，DOX對(duì)映體誘發(fā)大鼠心房肌正性肌力作用或負(fù)性肌力作用的機(jī)制。本部分的研究?jī)?nèi)容材料與方法

FA2004型電子天平

上海良平儀器儀表有限公司SC-15數(shù)控超級(jí)恒溫槽

寧波天恒儀器廠BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

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安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院無線電二廠PHS-3C數(shù)字酸度計(jì)

杭州東星儀器設(shè)備廠50μl微量進(jìn)樣器

上海醫(yī)療激光儀器廠石英亞沸高純水蒸餾器（SYZ-B）

江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司YQY–12型氧氣減壓器

上海減壓器廠有限公司儀器

藥品配制精確稱取左旋多沙唑嗪以及右旋多沙唑嗪，加適量雙蒸水定容，超聲20min。溶液儲(chǔ)存于棕色瓶中，置陰暗干燥處保存?zhèn)溆谩I(yíng)養(yǎng)液的配制Krebs營(yíng)養(yǎng)液的成份為（mmol·L-1）：NaCl118.3、KCl4.6、CaCl22.5、MgSO41.2、NaH2PO41.0、NaHCO325.0、glucose11.1。除NaHCO3、CaCl2和glucose于實(shí)驗(yàn)前臨時(shí)加入外，其他成份均配成高濃度母液并于臨用前稀釋至所需濃度。配制好的營(yíng)養(yǎng)液以95%O2+5%CO2的混合氣體充分飽和后，用鹽酸調(diào)pH值至7.4。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，250~350g/只，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于室溫23℃±1℃，相對(duì)濕度50±5%，明暗各12小時(shí)的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自由進(jìn)食和飲水。

以25%烏拉坦（1.5g?kg-1）腹腔注射麻醉動(dòng)物后，經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物。動(dòng)物處死后，迅速打開胸腔，剪斷與心臟相連大血管，取出心臟置于95%O2+5%CO2預(yù)飽和的4℃Krebs溶液中，沿房室溝剪去心室，小心剪下左心房。在左心房?jī)啥思獠扛飨狄唤z線，一端固定于帶有刺激電極的支架上，置于麥?zhǔn)显〔鄣撞浚涣硪欢诉B接張力換能器。麥?zhǔn)显〔蹆?nèi)盛有10mlKrebs溶液，標(biāo)本持續(xù)通以95%O2+5%CO2的混合氣體，維持浴槽溫度在37±0.25℃。初始前負(fù)荷0.5g，標(biāo)本平衡30min后，電刺激（波寬2ms，頻率4Hz，120%閾電壓）驅(qū)動(dòng)左心房肌收縮，通過生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（BL-420E+）記錄心肌收縮時(shí)的張力變化。電刺激期間以0.1g單位逐步升高前負(fù)荷，直至標(biāo)本的收縮反應(yīng)達(dá)到最適狀態(tài)，1小時(shí)后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法

阿托品及普萘洛爾對(duì)DOX對(duì)映體改變大鼠心房收縮力的影響標(biāo)本刺激30min后加入10-6mol?L-1的阿托品和10-5mol?L-1的普萘洛爾，分別阻斷M膽堿受體和β受體；阿托品及普萘洛爾與標(biāo)本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個(gè)標(biāo)本只給予一種藥物，溶劑對(duì)照組給予等體積蒸餾水。以第一次給予DOX時(shí)的前3s內(nèi)平均肌張力作為藥前值；每次給予DOX后，記錄藥后第20min時(shí)3s內(nèi)的平均肌張力作為藥物的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

酚芐明對(duì)DOX對(duì)映體改變大鼠心房收縮力的影響標(biāo)本刺激30min后加入10-5mol?L-1的酚芐明，阻斷α受體；酚芐明與標(biāo)本作用10min后，用營(yíng)養(yǎng)液反復(fù)沖洗標(biāo)本7~8次，將營(yíng)養(yǎng)液中的酚芐明沖洗干凈；待標(biāo)本平衡后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個(gè)標(biāo)本只給予一種藥物，溶劑對(duì)照組給予等體積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的記錄同前。

吲哚美辛對(duì)DOX對(duì)映體改變大鼠心房收縮力的影響標(biāo)本刺激30min后加入10-6mol?L-1吲哚美辛（環(huán)氧合酶抑制劑），抑制前列腺素（PG）合成；吲哚美辛與標(biāo)本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個(gè)標(biāo)本只給予一種藥物，溶劑對(duì)照組給予等體積蒸餾水。

維拉帕米對(duì)DOX對(duì)映體改變大鼠心房收縮力的影響標(biāo)本刺激30min后加入5×10-6mol?L-1維拉帕米，阻斷Ca2+通道；維拉帕米與標(biāo)本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個(gè)標(biāo)本只給予一種藥物，溶劑對(duì)照組給予等體積蒸餾水。

亞甲藍(lán)對(duì)DOX對(duì)映體改變大鼠心房收縮力的影響標(biāo)本刺激30min后加入10-5mol?L-1亞甲藍(lán)（可溶性鳥苷酸環(huán)化酶抑制），抑制環(huán)鳥苷酸（cyclicguanosinemonophosphate，cGMP）生成；亞甲藍(lán)與標(biāo)本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個(gè)標(biāo)本只給予一種藥物，溶劑對(duì)照組給予等體積蒸餾水。

H-89對(duì)DOX對(duì)映體改變大鼠心房收縮力的影響標(biāo)本刺激30min后加入10-6mol?L-1的H-89，抑制cAMP依賴性蛋白激酶（cyclicAMP-dependentproteinkinase，PKA）；H-89與標(biāo)本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個(gè)標(biāo)本只給予一種藥物，溶劑對(duì)照組給予等體積蒸餾水。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以實(shí)測(cè)值和變化率的mean±SD或mean±SEM表示。同一藥物不同濃度間的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析和Dunnett‘stest。兩條濃度-反應(yīng)量效曲線之間的比較，采用雙因素方差分析，當(dāng)F值有顯著性（P<0.05）時(shí)，進(jìn)一步采用Bonferroni’stest比較兩對(duì)應(yīng)點(diǎn)間的差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖形處理均使用GraphPadPrism5.0軟件。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)

果

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0225.71±29.36215.71±39.52235.71±71.61

3

214.29±46.14245.71±44.29195.71±58.27(-5.70±9.91)(15.57±20.95)△(-15.61±14.15)△10225.71±64.51314.29±90.34*145.71±69.97*(0.59±18.94)(46.96±39.77)△(-36.99±23.58)30218.57±43.37357.14±68.49**△△57.14±41.12**△△(-3.62±9.24)(67.46±30.09)△△(-57.48±56.01)△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheratisolatedleftatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=7.

*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0225.33±24.37206.67±41.31215.00±25.103

219.26±38.42231.67±47.50200.00±64.19(-5.65±9.18)(13.02±16.66)(-8.02±21.43)10219.25±51.33305.00±37.82**△168.33±53.07(-2.19±15.67)(53.65±41.02)△△(-21.60±21.50)

30222.67±60.11338.33±64.01**△△81.67±59.47**△△(-4.67±8.66)(70.87±52.66)△△(-63.75±24.14)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithatropineandpropranololPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0223.28±37.25221.67±42.62211.67±42.623

213.75±38.54255.00±74.77175.00±46.80(-4.95)±12.18(13.71±14.39)(-14.08±23.48)10211.29±60.77300.00±64.19△131.67±39.20*△(-2.89±28.22)(35.48±11.90)△△(-33.08±17.85)△30219.27±55.05371.67±60.80**△△81.67±37.64**△△(-4.39±9.78)(71.62±37.20)△△(-60.73±17.21)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithphenoxybenzaminePercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.

*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0237.52±27.22211.67±39.20210.00±36.883

220.00±36.44250.00±33.47188.33±49.56(-3.56)±9.18(19.05±7.14)(-10.40±14.76)10221.25±50..05315.00±80.68**△△161.67±69.40(-3.23±18.34)(49.27±28.71)

△△(-23.73±26.18)30229.00±60.09353.33±41.79**△△70.00±20.00**△△

(-7.23±8.87)(71.21±35.57)△△(-65.63±6.52)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithethanolPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0216.67±35.02251.67±55.29246.67±46.763

220.00±38.99296.67±43.20△226.67±45.46(1.65±10.94)(19.87±13.06)△(-7.23±13.39)10218.33±31.88386.67±66.83**△△165.00±49.70*(1.10±6.54)(55.73±18.00)△△(-31.33±18.74)△△30206.67±38.30396.67±88.92**△△73.33±29.44**△△(–4.73±8.62)(60.25±35.25)△△(-70.42±8.90)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithindomethacinPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.

*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

(-)DOX明顯增強(qiáng)離體小鼠左心房肌條的收縮力，本研究中(-)DOX對(duì)大鼠離體左心房肌條的收縮力有同樣的作用。(-)DOX增強(qiáng)大鼠心房肌收縮力的作用與α受體無關(guān)。此前也曾有文獻(xiàn)報(bào)道DOX及哌唑嗪可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，并且這種誘導(dǎo)作用與α受體阻斷作用無關(guān)。心臟的M膽堿受體、β受體以及環(huán)氧合酶可能未參與(-)DOX的正性肌力作用。

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0176.25±72.30141.25±41.55187.50±95.883162.50±70.05172.50±43.34162.5±71.26(-10.12±10.33)(24.81±20.49)△△(-9.60±17.19)10152.50±65.63248.75±79.54**△118.75±57.93(-14.51±7.16)(75.98±23.00)△△(-33.47±9.43)△30152.50±58.25323.75±87.82**△△45.00±19.27**△△(-13.53±8.35)(131.15±17.56)△△(-72.23±14.65)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithverapamilPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=8.

**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

Ca2+拮抗劑維拉帕米預(yù)處理標(biāo)本使大鼠左心房標(biāo)本的心肌收縮力減弱，提示細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放參與了大鼠左心房標(biāo)本的心肌收縮反應(yīng)。盡管30μmol?L-1(-)DOX對(duì)維拉帕米預(yù)處理大鼠心肌標(biāo)本的收縮力增強(qiáng)百分比，顯著強(qiáng)于其對(duì)正常且未經(jīng)處理大鼠心肌標(biāo)本的作用；但是，3、10和30μmol?L-1(-)DOX誘發(fā)兩種不同處理標(biāo)本的正性肌力作用分別為（172.50±43.34mg）、（248.75±79.54mg）、（323.75±87.82mg）和（245.71±44.29mg）、（314.29±90.34mg）、（357.14±68.49mg）。因此，我們認(rèn)為維拉帕米對(duì)(-)DOX的正性肌力作用有一定的拮抗效應(yīng)；但是隨著(-)DOX濃度升高，維拉帕米的拮抗效應(yīng)逐漸減弱甚至消失，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0215.00±32.71223.33±36.15241.67±77.313

210.00±34.06303.33±45.90△△218.33±45.35(-1.18±11.57)(36.26±9.82)△△(-5.57±17.32)10208.33±21.37373.33±98.52**△△211.67±87.50(-2.14±10.34)(65.99±26.27)△△(-10.54±25.09)30201.67±24.01260.00±97.7898.33±49.56**△(-5.42±9.52)(16.02±35.33)(-58.27±15.47)△△EffectsofdoxazosinenantiomersonthecontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithmethylenebluePercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.亞甲藍(lán)預(yù)處理標(biāo)本后，低濃度(-)DOX的正性肌力作用有增強(qiáng)趨勢(shì)；但是最高濃度(-)DOX的正性肌力作用受到顯著抑制。該研究結(jié)果提示細(xì)胞內(nèi)cGMP可能在某種程度上參與了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0221.67±51.54261.43±67.18208.33±64.013

218.33±47.08338.57±96.86△178.33±78.34(-0.93±6.21)(28.96±9.49)△△(-17.71±16.37)10203.33±43.20471.43±107.61**△△153.33±75.28(-7.01±4.22)(81.93±20.75)△△(-30.76±18.38)△30216.67±43.20520.00±103.44**△△73.33±33.27**△△(-0.30±9.38)(101.53±51.95)△△(-64.67±10.74)△EffectsofdoxazosinenantiomersonthecontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithH-89Percentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.小結(jié)

(-)DOX增強(qiáng)大鼠心房肌收縮力的作用，可能與心肌α受體、M膽堿受體、β受體以及環(huán)氧合酶無關(guān)；L型Ca2+通道、細(xì)胞內(nèi)cGMP以及PKA可能在某種程度上參與了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。但是，心肌α受體、M膽堿受體、β受體、Ca2+通道、環(huán)氧合酶、cGMP及PKA，可能未參與(+)DOX對(duì)大鼠左心房的負(fù)性肌力作用。第三部分

多沙唑嗪對(duì)映體在大鼠、犬和人血漿中的蛋白結(jié)合率研究

血漿蛋白結(jié)合在藥物治療中起著重要的作用。藥物與血漿蛋白結(jié)合的變化顯著影響其藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。對(duì)映體蛋白結(jié)合的立體選擇性研究是明確其藥理學(xué)效應(yīng)、臨床療效及安全性必不可少的內(nèi)容。因此，有必要對(duì)多沙唑嗪對(duì)映體蛋白結(jié)合的立體選擇性進(jìn)行研究。本研究采用平衡透析法利用卵粘蛋白手性色譜柱同時(shí)測(cè)定大鼠、犬和人血漿中多沙唑嗪對(duì)映體的濃度，并計(jì)算其蛋白結(jié)合率。Agilent1260液相色譜系統(tǒng)（熒光檢測(cè)器，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器）色譜柱:UltronES-OVM手性柱(150mm×4.6mmi.d.,5μm,Shinwa,Japan)流動(dòng)相:

磷酸鹽緩沖液(20mM,pH5.32)-乙腈(86:14v/v)流速:1.0mL/min柱溫:30°C檢測(cè)光譜:激發(fā)波長(zhǎng)255nm，發(fā)射波長(zhǎng)385nm哌唑嗪,(-)DOX和(+)DOX保留時(shí)間分別為6.2min,10.0min及11.3min.色譜條件血漿蛋白濃度分析BCA

蛋白含量檢測(cè)試劑盒(MultisciencesBiotechCo.Ltd,Hangzhou,China)分析混和血漿蛋白濃度.試管中加入50ul稀釋血漿(稀釋100倍）及Bradford試劑(1.5mL)，37°C震蕩混勻。

TU-1901UV-VIS紫外分光光度計(jì)在562nm處測(cè)吸光度。以BSA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品的蛋白濃度。蛋白結(jié)合研究

平衡透析過程依照說明書準(zhǔn)備半透膜：煮沸去離子水浸泡20min,30%乙醇浸泡20min.去離子水沖洗,PBS浸泡60min.500ul血漿置于2cm長(zhǎng)半透膜透析袋中，兩端結(jié)扎，透析袋放入5mL試管（內(nèi)含200,400or800ng?mL-1(±)DOX的PBS緩沖液3mL）.密閉，37°C溫育15h.HPLC法測(cè)定透析袋內(nèi)及試管內(nèi)藥物濃度（各取5份樣品）。PBS緩沖液樣品處理

取400μL透析液加入20-μL內(nèi)標(biāo)溶液(prazosin1μg?mL-1)加入900μL正己烷－乙酸乙酯(1:1,v/v).渦旋2min,6000rpm離心4min.取上清移入另一試管，氮?dú)饬鞔蹈?00μL流動(dòng)相復(fù)溶.取10μL進(jìn)樣分析，檢測(cè)游離藥物濃度透析袋內(nèi)樣品處理

取100μL透析袋內(nèi)容加入20μL內(nèi)標(biāo)溶液(prazosin2μg?mL-1)及900μL正己烷

－乙酸乙酯渦旋2min,6000rpm離心4min.取上清移入另一試管，氮?dú)饬鞔蹈?00μL流動(dòng)相復(fù)溶.取10μL進(jìn)樣分析，檢測(cè)總藥物濃度結(jié)

果

采用高效液相色譜法手性分離血漿及PBS中的(±)DOX，專屬性良好，內(nèi)標(biāo)（哌唑嗪）、(-)DOX和(+)DOX達(dá)到基線分離，最低檢測(cè)