majun-基因工程-分子基本操作技術(shù)

第四章分子基本操作技術(shù)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式存在的真核生物95%的DNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，5%的DNA在細(xì)胞器75%的RNA存在于細(xì)胞質(zhì)，10%在核內(nèi)，15%在細(xì)胞器其中rRNA（80～85%）tRNA及核內(nèi)小分子RNA（10～15%）mRNA（1～5%）第一節(jié)DNA的基本操作技術(shù)DNA提取原則保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性純化后不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的物質(zhì)排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取的幾種方法1、染色體DNA的提取CTAB法SDS法其它2、非染色體DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取，包括堿裂解法和煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取，主要是差速離心結(jié)合SDS裂解法基因組DNA－CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃

時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法

SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法流程圖

（以動(dòng)物組織為例）

動(dòng)物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法

根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：吸附材料結(jié)合法：

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料陰離子交換樹(shù)脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開(kāi)環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類(lèi)氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類(lèi)結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類(lèi)有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類(lèi)與DNA的結(jié)合鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaOAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取基因組DNA的檢測(cè)

提取的基因組DNA片段在20kb－30kb之間高質(zhì)量的基因組DNA帶型單一無(wú)拖尾現(xiàn)象DNA濃度及純度的檢測(cè)A260=1約50μg/mL雙鏈DNA；

A260/280約為1.8DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。DNA中含有蛋白、多糖、多酚類(lèi)雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子有RNA的存留

原因?qū)Σ咧匦录兓疍NA，過(guò)吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）加入RNase降解RNA問(wèn)題二：DNA降解。材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融

原因?qū)Σ弑M量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量，細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融問(wèn)題三：DNA提取量少。實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗滌時(shí)DNA丟失

原因?qū)Σ弑M量選用新鮮（幼嫩）的材料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁。高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）。增加吸附的時(shí)間，或低溫沉淀小心操作第二節(jié)RNA基本操作技術(shù)分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物RNA的不穩(wěn)定性核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解

RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活提取RNA的注意事項(xiàng)經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw和實(shí)驗(yàn)室用品上可能有RNase，會(huì)導(dǎo)致RNase污染。使用滅過(guò)菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。常用RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。RNA提取的步驟材料的裂解雜質(zhì)的去除RNA的吸附或沉淀異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，使DNA及蛋白沉淀到有機(jī)相。硅質(zhì)材料的吸附或用異丙醇沉淀濃縮RNA。經(jīng)DEPC處理的水溶解RNA材料準(zhǔn)備及裂解盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長(zhǎng)較快的幼嫩部位，現(xiàn)取現(xiàn)提。組培細(xì)胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位,細(xì)菌和酵母需要?jiǎng)驖{處理。對(duì)不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門(mén)的RNA樣品儲(chǔ)存液中保存。液氮研磨時(shí)不要使液氮揮發(fā)凈，隨時(shí)補(bǔ)充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。雜質(zhì)的抽提采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間，使蛋白質(zhì)、多糖和DNA分布到中間層和有機(jī)相中，RNA留在水相中對(duì)脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，可以再次用有機(jī)溶劑抽提RNA的沉淀和溶解含RNA的水相過(guò)吸附柱，通過(guò)去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等雜質(zhì)或使用異丙醇沉淀RNA應(yīng)充分的混勻并放置10min左右離心收集沉淀，70％乙醇洗滌，晾干用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水或?qū)ｉT(mén)的試劑來(lái)洗脫或溶解RNA樣品收集后或需長(zhǎng)期保存時(shí)應(yīng)置于－70℃或加入RNase抑制劑，分裝使用RNA的檢測(cè)電泳槽系統(tǒng)的處理乙二醛化瓊脂糖凝膠電泳含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳RNA純度及濃度的檢測(cè)（A260=1，約40μg/mLRNA；

A260/A280

約為1.9-2.1）RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題1抽提過(guò)程不徹底存在蛋白或多糖多酚的污染2DNA的污染

3離子濃度較高

原因?qū)Σ?保證徹底的裂解和一定轉(zhuǎn)數(shù)一定時(shí)間的離心；增加有機(jī)溶劑抽提的次數(shù)，用吸附柱純化2減少處理樣品的量；加入不含RNase的DNase處理；再次純化3增加漂洗次數(shù)問(wèn)題一：RNA樣品不純1樣品含有雜質(zhì)雜液2樣品過(guò)量或樣品裂解和勻漿不徹底3RNA未有效的吸附沉淀或洗脫4樣品RNA含量少

原因?qū)Σ?去除樣品中的雜質(zhì)，