丙種球蛋白的制備黃晨

丙種球蛋白的電泳制備姓名：黃晨班級(jí)：生物制藥1311學(xué)號(hào)：2013040836指導(dǎo)老師：彭加平韋平和丙種球蛋白概念中文簡(jiǎn)稱：“丙球”英文名稱：γ-globulin、gammaglobulin

別名：

免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙種球蛋白，丙種球蛋白，靜脈注射用人免疫球蛋白（pH4）丙種球蛋白預(yù)防傳染性肝炎，預(yù)防麻疹等病毒性疾病感染，治療先天性丙種球蛋白缺乏癥，與抗生素合并使用，可提高對(duì)某些嚴(yán)重細(xì)菌性和病毒性疾病感染的療效。注：由于人血中的免疫球蛋白大多數(shù)為丙種球蛋白（γ-球蛋白），有時(shí)丙種球蛋白也被混稱為“免疫球蛋白”。藥理作用

注射丙種球蛋白是一種被動(dòng)免疫療法。它是把免疫球蛋白內(nèi)含有的大量抗體輸給受者，使之從低或無免疫狀態(tài)很快達(dá)到暫時(shí)免疫保護(hù)狀態(tài)。由于抗體與抗原相互作用起到直接中和毒素與殺死細(xì)菌和病毒。因此免疫球蛋白制品對(duì)預(yù)防細(xì)菌、病毒性感染有一定的作用。適應(yīng)癥

丙種球蛋白是血液中一種蛋白質(zhì)，它通常來源于許多人獻(xiàn)的血液，常被用來防止和治療感染，對(duì)慢性疲勞癥有顯著的改善作用。適用于預(yù)防傳染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染,，治療先生性丙種球蛋白缺乏癥，可提高對(duì)某些嚴(yán)重細(xì)菌性和病毒性疾病感染的療效。制備丙種球蛋白的方法1、電泳法（聚丙烯酰胺凝膠電泳）定義：利用溶液中帶有不同量的電荷的陽離子或陰離子，在外加電場(chǎng)中以不同的遷移速度向電極移動(dòng)，而達(dá)到分離目的的分析方法2、層析法定義:是一種利用混合物中諸組分在兩相間的分配原理以獲得分離的方法。電泳作用：用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。原理聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。

圓盤電泳：

缺點(diǎn)：是由于聚合效應(yīng)，凝膠的長(zhǎng)度和直徑有細(xì)微差別，即使同一樣品在兩個(gè)凝膠柱上以同樣的條件電泳，其結(jié)果也會(huì)不同

優(yōu)點(diǎn)：研究工作中還會(huì)用到圓盤電泳，例如測(cè)定放射性標(biāo)記的樣品測(cè)定蛋白質(zhì)的生物活性；測(cè)定蛋白質(zhì)分離的最適pH，凝膠濃度；雙向電泳中第一相的分離。凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)；對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定,幾乎無吸附和電滲作用；樣品用量少，靈敏度可達(dá)10-6g;凝膠孔徑可調(diào)節(jié)；分辨率高。聚丙烯酰胺凝膠有下列特性盤狀電泳

圓盤電泳是帶電粒子(膠體顆粒、離子等)在電場(chǎng)的作用下在特定的介質(zhì)中向與其電荷性質(zhì)相反的電極方向定向泳動(dòng)的現(xiàn)象.廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離和鑒定。它是利用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成大分子的凝膠物。它同時(shí)兼有分子篩和電泳效應(yīng)。當(dāng)樣品通過凝膠進(jìn)行電泳時(shí)，便可以根據(jù)其樣品中各分子的電荷和分子量的不同而泳動(dòng)出不同的區(qū)帶。由于聚丙烯酰胺凝膠化學(xué)性質(zhì)較瓊脂穩(wěn)定，很少帶有側(cè)基，在電泳過程中，吸附作用與電滲作用均小，所以該技術(shù)的分辨率均高于其它瓊脂電泳技術(shù)。圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.9(2)濃縮膠pH6.9

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種效應(yīng)1、濃縮效應(yīng)每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。有效電荷多的，泳動(dòng)的快，反之則慢。

2、電荷效應(yīng)分子量大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時(shí)，受凝膠阻滯的程度不同，表現(xiàn)出不同的遷移率。3、分子篩效應(yīng)樣品在分離之前，首先在濃縮膠得到濃縮，變成狹窄（很?。┑臉悠穾?，使分辨率大大提高。實(shí)驗(yàn)方法分離膠的制備濃縮膠的制備待分離樣品的準(zhǔn)備加樣電泳脫色染色材料與試劑1．20％單體母液

丙烯酰胺（Aorylamide）19.60g

雙丙烯酰胺（N，N—methylene

Bisaerylamide）0.40g

H2O加至100.00ml2．pH8.0Tris—EDTA緩沖液

Tris（三羥基甲基氨基甲烷）6.05g

EDTA（乙二胺四乙酸）1.17g

H2O加至100.00ml3．B—三甲基胺基丙腈液（B—DMPN）

（Dimethylaminopropionitrile），原液于4℃冰箱保存4．10％過硫酸銨溶液

過硫酸銨0.50g

H2O加至5.00ml

現(xiàn)用現(xiàn)配或配后低溫保存不超過一周。5．0.025Mol/LpH9.0硼酸緩沖液

硼酸3.948g

硼砂30.512g

H2O加至1000.0ml

使用時(shí)取該液90ml加H2O至1440ml，即為電泳液。操作步驟

1、分離膠的制備：（1）、將清潔、無破碎干燥的小玻管一端，用膠布貼封后，朝下垂直放入有機(jī)玻璃凝膠玻管架的孔中，并在小玻管的7.0cm處作一記號(hào)。（2）用自動(dòng)取液器吸取上述配好的分離凝膠貯液沿著小玻管內(nèi)壁小心準(zhǔn)確加入7.0cm高。（3）凝膠溶液加畢后，隨即吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面，使其表面覆蓋一水層（水封，1.0cm高）。在灌膠和封水的過程中，操作要輕，以避免產(chǎn)生氣泡。（4）將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進(jìn)行聚合反應(yīng)，在正常情況下大約30-60分鐘后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時(shí)，表明膠已聚合完畢，即可加濃縮膠。2、濃縮膠的制備（1）、輕輕倒掉分離膠玻管上端的液體，并用吸水紙吸去未倒凈的液體（但不能觸及膠面）然后先小心用濃縮膠貯液洗滌凝膠表面1-2次，再小心加入該濃縮膠貯液1.5cm高。（2）、隨后同樣加1.0cm高的蒸餾水層覆蓋膠表面。大約也在20-40分鐘后，待濃縮膠出現(xiàn)乳白色時(shí)，表明膠已聚合完畢。3、加樣：取一根上次做好的凝膠小玻管用吸水紙輕輕吸去濃縮膠表面上的水層，然后用微量注射器加10ul測(cè)試樣品溶液。4、裝置凝膠管

將加好樣品的凝膠管的加樣端（上端），插入上電泳槽孔中，然后將已插滿凝膠管的上電泳槽放入加有電極溶液的下電泳槽內(nèi)。此時(shí)凝膠玻管下端管口易產(chǎn)生氣泡，可通過輕輕擺動(dòng)凝膠玻管以去除氣泡，插入上電泳槽的玻管上端，用滴管輕輕滴滿電極溶液，以免產(chǎn)生氣泡，最后將上電泳槽裝滿電極液。5、接通電源接通電泳槽的兩端電極與電泳儀的電源，上槽電極接負(fù)極，下槽電極接正極，穩(wěn)壓300V電泳開始時(shí)，電流應(yīng)由小逐步加大至額定值。這時(shí)的電流大約每管3.0-5.0mA

電流，直至指示劑前沿到達(dá)凝膠管底部約0.5cm處，（大約需時(shí)2小時(shí)），停止電泳。確定電泳結(jié)束時(shí)，不應(yīng)將溴酚蘭跑出凝膠管，以防止標(biāo)準(zhǔn)分子量中的最低分子量蛋白質(zhì)也跑出凝膠管。6、取出玻管內(nèi)的凝膠練習(xí)：將一支帶有長(zhǎng)針頭的注射器吸有適量水（蒸餾水或自來水），把針頭慢慢插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，一邊開始?jí)核?，一邊同時(shí)使針頭慢慢貼緊管壁呈螺旋式前進(jìn)，如果一端不行，再在管的另一端按同樣的方法剝離，這樣依靠水流的壓力和滑潤(rùn)力，使玻管內(nèi)壁與凝膠分離，最后用洗耳球在管的一端輕輕擠壓，另一端對(duì)著一干凈大小適宜的培養(yǎng)皿內(nèi)，此時(shí)可以將凝膠柱壓出玻管。8.凝膠染色

將取出的凝膠柱，放入一合適干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入適量染色液，于搖床上進(jìn)行振搖染色30分鐘，完畢，回收染色液，用清水洗凝膠柱2-3遍。在染色的同時(shí)，凝膠中蛋白質(zhì)區(qū)帶亦被固定。9.凝膠脫色在培養(yǎng)皿（或試管）內(nèi)加入適量脫色液于搖床上進(jìn)行振搖（2小時(shí)/次，需3次）脫色多次直至色帶完全清晰為止。10.繪圖

最后根據(jù)染色所出現(xiàn)的帶數(shù)和位置進(jìn)行繪圖，以確定被分析樣品的組分。另一種方法是通過密度掃描儀掃出各組分的峰形位置，這樣不僅能確定組分，而且能比較出各組分所占比例。注意事項(xiàng)樣品的離子強(qiáng)度、pH值盡可能與濃縮膠溶液相同，如含大量鹽類時(shí)，應(yīng)透析除鹽。最適合的樣品蛋白量是10μg～100μg，加入樣品量要少，血清樣品3μl～5μl，免疫球蛋白樣品可加15μl～20μl。凝膠柱面應(yīng)平整，操作過程切勿產(chǎn)生氣泡，否則電泳區(qū)帶不整齊。電泳中電流應(yīng)保持穩(wěn)定，避免電流強(qiáng)度過高，而產(chǎn)生大量的熱使分離失敗。電泳開始，樣品應(yīng)于5min～10min內(nèi)進(jìn)入凝膠柱內(nèi)為佳。藥品大部分有毒，應(yīng)注意防護(hù)。