微孔板檢測(cè)技術(shù)的原理和應(yīng)用

微孔板檢測(cè)技術(shù)的原理和應(yīng)用張智彧應(yīng)用工程師原理及應(yīng)用介紹大綱光的物理簡(jiǎn)介光吸收檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例熒光檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例發(fā)光檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例光的物理簡(jiǎn)介光的本質(zhì)光的性質(zhì)光的本質(zhì)一種能量電磁波電子能級(jí)（軌道）波粒二相性衍射光電效應(yīng)紅外線光的性質(zhì)基本性質(zhì)速度：3×108m/s波長(zhǎng)：顏色頻率：能量E=hν其他性質(zhì)偏振熒光：激發(fā)c=λ×ν光的性質(zhì)物體的顏色白光是復(fù)合光單色光互補(bǔ)色光溶液的顏色由溶液中的質(zhì)點(diǎn)（分子，離子）吸收特定波長(zhǎng)的光，透射其互補(bǔ)色的光吸收曲線KMnO4溶液的吸收曲線(cKMnO4:a<b<c<d)原理及應(yīng)用介紹大綱光的物理簡(jiǎn)介光吸收檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例熒光檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例發(fā)光檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例光吸收檢測(cè)的原理當(dāng)光穿過(guò)待測(cè)物時(shí)，光的強(qiáng)度（能量）發(fā)生變化bcIIAbsorbance××lg0e==

（公式反應(yīng)了與濃度的依賴關(guān)系） I0

入射光強(qiáng)度 I 透射光強(qiáng)度

摩爾消光系數(shù)

b 光程 c 樣品濃度II0吸光值(Absorbance)的意義Absorbance(OpticalDensity):%ofLightTransmitted:%ofLightAbsorbed:0OD100%0%1OD2OD3OD4OD5OD6OD7OD8OD

1%0.1%0.01%0.001%0.0001%0.00001%0.000001%90%99%99.9%99.99%99.999%99.9999%99.99999%99.999999%10%影響結(jié)果的因素單色光不純非平行入射光介質(zhì)不均勻溶液濃度過(guò)高溶液中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)光吸收的應(yīng)用如果光的強(qiáng)度變化能夠反映被測(cè)量物的待測(cè)性質(zhì)，則顯色反應(yīng)都可以使用光吸收核酸和蛋白質(zhì)的紫外光吸收檢測(cè)酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ELISA）酶動(dòng)力學(xué)分析細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)乙酰膽堿脂酶檢測(cè)細(xì)胞活性檢測(cè)（MTT）環(huán)境監(jiān)測(cè)核酸的紫外光吸收檢測(cè)DNA，RNA的吸收峰在260nm標(biāo)準(zhǔn)曲線法光程測(cè)量法（光程未知【酶標(biāo)板】）校正吸收值到1cm光程通過(guò)水（如果溶劑是水）的1cm光程吸收值來(lái)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線法作光吸收最常用的方法已知濃度樣品吸收值（同一光程【比色杯】）標(biāo)準(zhǔn)曲線未知吸收值帶入，得到未知樣品濃度光程測(cè)量法光程不一致時(shí)（酶標(biāo)板）通過(guò)水的吸收值（1cm光程）來(lái)求得實(shí)際光程水在977nm有吸收峰，在900nm幾乎無(wú)吸收（與溶質(zhì)的吸收峰無(wú)重疊）Pathlength：實(shí)際的光程A977：水溶液樣品在977nm的吸光值A(chǔ)900：水溶液樣品本底Awatercm-1：1cm光程比色杯中水的吸光度值（A977）－本底值（A900）光程測(cè)量法水相樣品的吸收值/cm光程：光程的校正水：998nm等消光點(diǎn)（受溫度影響小）977nm吸收峰Asample：樣品在特定波長(zhǎng)的吸光值

實(shí)例：DNA濃度的測(cè)量水的吸光度/cm

Result: Awater:A998–A900:0.159OD/cm樣品的吸光度 A998–A900:0.132OD

A260:0.084OD實(shí)例：DNA濃度的測(cè)量光程的校正DNA的分光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，1OD/cm

相當(dāng)于50ng/ulDNA相當(dāng)于40ng/ulRNA相當(dāng)于33ng/ulOligo結(jié)果計(jì)算：0.101×50ng/ul=5.05ng/ul實(shí)例：蛋白定量CoomassieBrilliantBlueG-250加入蛋白質(zhì)酸性環(huán)境下呈茶色與蛋白質(zhì)結(jié)合變藍(lán)色

CBG是一種指示劑470nm595nm實(shí)例：ELISA抗原，抗體，底物，顯色反應(yīng)陰性域值，陽(yáng)性程度，定量實(shí)例：細(xì)胞活性檢測(cè)（MTT）細(xì)胞代謝活動(dòng)與活細(xì)胞數(shù)直接成比例（線粒體的活性脫氫酶的活性）MTT：一種甲氮唑鹽，是細(xì)胞線粒體脫氫酶的底物；活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶可將MTT分解產(chǎn)生藍(lán)黑色（fromazan）產(chǎn)物進(jìn)入活細(xì)胞，被分解，裂解細(xì)胞，分析吸光度Fromazan吸光譜實(shí)例：細(xì)胞活性檢測(cè)（MTT）實(shí)例：內(nèi)毒素檢測(cè)（LPS）LPS：存在于革蘭陰性(G－)細(xì)菌細(xì)胞壁外層，脂多糖，為細(xì)菌類屬的共同抗原，介導(dǎo)多種生物效應(yīng)。可作為多種與G－細(xì)菌相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后指標(biāo)方法：鱟血細(xì)胞基質(zhì)染色試驗(yàn)原理：LPS作用于鱟血細(xì)胞溶解物中的凝固酶原使之成為凝固酶。凝固酶水解人工底物顯色。（檢測(cè)波長(zhǎng)：405nm）實(shí)例：乙酰膽堿脂酶檢測(cè)乙酰膽堿酯酶（AChE）：可作為反映胎兒神經(jīng)系統(tǒng)成熟度的指標(biāo)。方法：乙酰膽堿酯酶水解乙酰膽堿生成膽堿及乙酸，膽堿可以與巰基顯色劑反應(yīng)生成TNB黃色化合物。（檢測(cè)波長(zhǎng)：450nm）光吸收的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)優(yōu)勢(shì)技術(shù)成熟設(shè)備和試劑成本低操作簡(jiǎn)單光吸收的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)缺點(diǎn)動(dòng)態(tài)范圍窄靈敏度低（核酸到ng級(jí)）特異性不強(qiáng)受溶液的濃度和粘稠度影響細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中采用的吸收底物往往有細(xì)胞毒性相互作用檢測(cè)很難實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)無(wú)法做多標(biāo)記檢測(cè)原理及應(yīng)用介紹大綱光的物理簡(jiǎn)介光吸收檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例熒光檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例發(fā)光檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例熒光原理熒光：某些物質(zhì)吸收特定波長(zhǎng)的光能量（能量高），從基態(tài)(S0)成為激發(fā)態(tài)(S1)；被激發(fā)的分子通過(guò)內(nèi)部轉(zhuǎn)化失去能量并回到基態(tài)；同時(shí)發(fā)出波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光（能量低）熒光原理Excitationinfemtoseconds(10E-15seconds)Internalinpicoseconds(10E-12seconds).Emissionintherelativelylongtimeperiodofnanoseconds(10E-9seconds)Tremendouslysensitiveemissionprofiles,spatialresolution,andhighspecificityoffluorescenceinvestigations,thetechniqueisrapidlybecominganimportanttoolingeneticsandcellbiology.熒光的優(yōu)勢(shì)靈敏度高——可以低到單個(gè)分子對(duì)環(huán)境敏感細(xì)胞毒性較小，可以進(jìn)行活細(xì)胞或活體檢測(cè)實(shí)時(shí)檢測(cè)多標(biāo)記檢測(cè)（如藍(lán)色細(xì)胞核，紅色線粒體等等）檢測(cè)模式多樣，具有多種類型的熒光探針和熒光染料兼容性強(qiáng)——可以兼容多種儀器平臺(tái)和多種樣本形式使用方便，高效安全，無(wú)輻射以熒光為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)熒光強(qiáng)度(FI)時(shí)間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)熒光強(qiáng)度（FI）DNA、RNA的熒光定量熒光ELISA酶動(dòng)力學(xué)分析藥物代謝（CYP450）氧化酶的呼吸爆發(fā)細(xì)胞凋亡研究細(xì)胞基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞吸附、細(xì)胞滲透、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒理研究等）鈣流檢測(cè)報(bào)告基因檢測(cè)（GFP）DNA的熒光定量Figure2λ-DNAmeasuredwithPicoGreen（485/535nm）Figure1λ-DNAmeasuredwithabsorbanceat260nm靈敏度比較：260nm光吸收：50－250ng/mlPicoGreenFluorescence：300pg/ml細(xì)胞貼壁研究細(xì)胞的貼壁性反映了細(xì)胞的狀態(tài)，類型傳統(tǒng)方法：細(xì)胞計(jì)數(shù)，繁瑣不準(zhǔn)確熒光強(qiáng)度方法熒光標(biāo)記細(xì)胞微孔板孵育洗去未粘附細(xì)胞檢測(cè)板底熒光強(qiáng)度死細(xì)胞數(shù)目檢測(cè)藥物的毒性；外界刺激細(xì)胞受損死亡細(xì)胞的膜破裂PI（PropidiumIodide），一種膜不滲透性DNA熒光染料PI的熒光強(qiáng)度反映了死細(xì)胞數(shù)目PIPIPIPIPIPIPIPIPIPIPIPIPI活細(xì)胞

死細(xì)胞或受損細(xì)胞細(xì)胞凋亡分析某些細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路包括Caspase3的酶活性提高模擬Caspase3底物Z-DEVD-R110NonfluorescentCaspase3Caspase3Rhodamine110FluorescentCaspase在細(xì)胞凋亡中起著中心作用酶活性分析藥物代謝酶活性分析細(xì)胞色素P450酶家族成員負(fù)責(zé)大約20％普通藥物代謝P450酶活性的調(diào)節(jié)P450的抑制物的篩選酶活性分析底物構(gòu)造熒光染料＋封閉基團(tuán)＝不發(fā)熒光加入酶促反應(yīng)之后，底物被切開，熒光染料與封閉基團(tuán)分離加入候選藥物分子，可篩選作用于藥物代謝通路的調(diào)解物e.g.CYP3A4DrugcandidatesX酶活性分析加入不同濃度的底物的CYP的反應(yīng)曲線CYP抑制劑篩選紫外熒光利用蛋白內(nèi)部發(fā)色團(tuán)（Tryptophan、Tyrosine、Phenylalanine）作為熒光指示劑（紫外激發(fā)），可分別對(duì)蛋白結(jié)構(gòu),構(gòu)象,亞基組裝，酶與底物結(jié)合，蛋白結(jié)構(gòu)的共效應(yīng)因子進(jìn)行研究。發(fā)色團(tuán)的暴露或掩藏還可以研究一些電子傳遞鏈的耦連劑NADHFADB族維生素，維生素A，E檢測(cè)紫外熒光－蛋白質(zhì)的折疊/變性RNaseA的熱變性曲線熒光強(qiáng)度應(yīng)用的不足部分熒光素激發(fā)峰與發(fā)射峰往往相隔很近，干擾檢測(cè)發(fā)射光產(chǎn)生極快，且持續(xù)時(shí)間短，容易與激發(fā)光重疊，干擾檢測(cè)時(shí)間分辨熒光（TRF）以鑭系元素(稀土離子：銪、釤、鏑、鋱）為標(biāo)記發(fā)射功率低，螯合Europiumion時(shí)間分辨熒光（TRF）激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)差距大（>200nm）光譜窄發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)ElapsedTimeIntensity

ExcitationAutoFluorescenceFluoresceinEmission

EuropiumEmission較長(zhǎng)延遲時(shí)間------Measurement------Eu:激發(fā)波長(zhǎng)320nm，發(fā)射波長(zhǎng)612/620nm時(shí)間分辨熒光（TRF）和普通熒光相比，排除了背景光干擾所有普通熒光強(qiáng)度（FI）檢測(cè)，如干擾影響極大，無(wú)法排除，均可采用時(shí)間分辨熒光標(biāo)記來(lái)解決以熒光為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)熒光強(qiáng)度(FI)時(shí)間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)用FI的方法檢測(cè)分子間結(jié)合缺點(diǎn)：1、步驟繁瑣，需要洗滌2、且每次洗滌強(qiáng)度很難一致，造成結(jié)果有差異，重復(fù)性差。優(yōu)點(diǎn)：1、步驟簡(jiǎn)單，無(wú)需洗滌2、試驗(yàn)均一性，重復(fù)性好非均相試驗(yàn)孵育(結(jié)合)洗滌（去除非結(jié)合）

檢測(cè)均相試驗(yàn)孵育(結(jié)合)檢測(cè)熒光偏振（FP）的原理光的偏振性PolarizerAnalyzerAnalyzerPolarizer熒光偏振（FP）的原理如果熒光基團(tuán)在處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間內(nèi)（如Fluorescein為4ns)保持靜止，那么它發(fā)射出的熒光也是與激發(fā)光是同平面的polarizedexcitation100%0%stationaryfluorophore熒光偏振（FP）的原理如果熒光基團(tuán)在處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間內(nèi)是運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，那么它發(fā)射出的熒光會(huì)發(fā)生偏振平面的改變polarizedexcitation<100%>0%fluorophoreinmotion熒光偏振（FP）的原理熒光偏振改變反映了分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，也可以說(shuō)反映了分子所處的環(huán)境的狀態(tài)分子運(yùn)動(dòng)快，偏振方向改變大分子運(yùn)動(dòng)慢，偏振方向改變小熒光偏振：分子運(yùn)動(dòng)越快，P值越小分子運(yùn)動(dòng)越慢，P值越大熒光偏振（FP）的原理分子體積與運(yùn)動(dòng)速度的關(guān)系體積越大，運(yùn)動(dòng)速度越慢體積越小，運(yùn)動(dòng)速度越快分子所處環(huán)境與運(yùn)動(dòng)速度的關(guān)系溶液的粘稠度利用熒光偏振的特性可以研究相互作用分子結(jié)合，體積改變，運(yùn)動(dòng)速度變化，P值相應(yīng)發(fā)生變化溶液狀態(tài)變化，溶液的粘稠度改變，其中的分子運(yùn)動(dòng)速度變化，P值相應(yīng)發(fā)生變化熒光偏振（FP）研究分子相互作用原則熒光基團(tuán)標(biāo)記在小分子上，偏振值低當(dāng)小分子與較大的分子結(jié)合后體積增加，偏振值增加偏振值的大小反映了兩個(gè)分子之間的結(jié)合效率與結(jié)合數(shù)量熒光偏振（FP）研究分子相互作用配體受體結(jié)合

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合抗原抗體結(jié)合蛋白質(zhì)與DNA的相互作用

DNA雜交酶活性檢測(cè)膜的流動(dòng)性分析Estradiol與EstradiolReceptorER：能和小分子疏水配體結(jié)合的核受體超家族成員，穿梭于胞漿和胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄因子的作用（DNA結(jié)合），包括ERα、ERβ兩種亞型Estradiol（雌激素）：與ER結(jié)合，引起其入核，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄Estradiol類似物ER-β競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的篩選雌激素受體ER-β競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物可作為候選的藥物成分具體步驟熒光標(biāo)記的雌激素ES2與ER-β結(jié)合，復(fù)合物較大，P值較大加入競(jìng)爭(zhēng)物之后，則能夠?qū)S2替換下來(lái)，單獨(dú)的ES2體積小，P值減小P值的減小程度與競(jìng)爭(zhēng)物的濃度的關(guān)系反映了競(jìng)爭(zhēng)物的競(jìng)爭(zhēng)性ER-β競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的篩選Estradiol-ER與DNA結(jié)合ER核受體，Estradiol與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄傳統(tǒng)方法EMSA放射性，繁瑣Estradiol-ER與DNA結(jié)合熒光偏振方法親和層析純化ERFAM標(biāo)記的DNA結(jié)合序列偏振分析激酶活性分析競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析檢測(cè)激酶活性被激酶磷酸化的產(chǎn)物與熒光標(biāo)記的磷酸化示蹤物競(jìng)爭(zhēng)磷酸化抗體熒光標(biāo)記的磷酸化示蹤物與抗體結(jié)合后熒光偏振值增加激酶活性決定了磷酸化產(chǎn)物比例，熒光偏振值增加的程度與激酶活性成反比例抑制物對(duì)激酶活性的影響激酶活性分析蛋白酶活性分析蛋白酶將大分子的蛋白切割成小的片斷，熒光偏振值變小研究蛋白酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)peptidefragmentsProteaseProtein偏振中數(shù)據(jù)處理問(wèn)題G值儀器分別測(cè)量與激發(fā)光偏振平面平行和垂直的偏振光時(shí)，使用相同但是不是同一個(gè)光學(xué)元件校準(zhǔn)，使用已知偏振值的熒光物質(zhì)及其相應(yīng)的緩沖液計(jì)算G值。P實(shí)際＝G×P測(cè)量G＝((RFU－BUF)×(1＋Pref))/((RFU－BUF)×(1＋Pref))偏振中數(shù)據(jù)處理問(wèn)題只有當(dāng)被測(cè)樣品的信號(hào)變化比對(duì)照組（正μC+、負(fù)μC-）有足夠的標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果才有意義。偏振中數(shù)據(jù)處理問(wèn)題熒光偏振優(yōu)勢(shì)均相(無(wú)分離/洗滌）在溶液中進(jìn)行，沒(méi)有固相的參與，因此反應(yīng)速度較快，操作也相應(yīng)簡(jiǎn)單測(cè)量的是比值，結(jié)果與熒光基團(tuán)的絕對(duì)濃度/強(qiáng)度無(wú)關(guān)無(wú)破壞性(可重復(fù)測(cè)量)無(wú)放射性可實(shí)現(xiàn)高通量熒光偏振缺點(diǎn)FP使用具有較短壽命的熒光素（如Fluorescein,TAMRA)，它被限定為：熒光標(biāo)記的小的配體（如抗原）和大的受體（如抗體）的結(jié)合。檢測(cè)依賴于分子結(jié)合造成的分子體積的顯著改變。以熒光為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)熒光強(qiáng)度(FI)時(shí)間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）FRET：一對(duì)合適的熒光物質(zhì)，前者的發(fā)射波長(zhǎng)正好是后者的激發(fā)波長(zhǎng)，當(dāng)二者達(dá)到一定的分子距離時(shí)（1～9nm），供體發(fā)出的光子能量會(huì)傳遞給受體分子，受體被激發(fā)，發(fā)射熒光供受體的激發(fā)光譜要分得足夠開供體的發(fā)射光譜要與受體的激發(fā)光譜重疊供受體的發(fā)射光譜要分得足夠開熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光能量傳遞的效率與分子間的作用距離相關(guān)因此能量傳遞的發(fā)生及強(qiáng)度可以作為分子間發(fā)生相互作用以及相互作用強(qiáng)弱的指示特征FRET的應(yīng)用分子間相互作用藥篩模型蛋白質(zhì)與核酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象研究/蛋白質(zhì)復(fù)合物的分配與組裝測(cè)量DNA寡聚體的結(jié)合（溶液中DNA雜交的動(dòng)力學(xué)測(cè)量）膜融合研究分子內(nèi)和分子間的距離測(cè)量標(biāo)記的大分子上特定位點(diǎn)的距離測(cè)定供體和受體的距離，受體/配基相互作用激酶反應(yīng)檢測(cè)FRET熒光素對(duì)標(biāo)記底物分子位點(diǎn)特異性的酶不能切開被激酶磷酸化的底物，保持FRET；磷酸化的底物失去FRET測(cè)量Donor的發(fā)射光（445nm）和Acceptor的發(fā)射光（520nm），計(jì)算比值445/520。比值越大，激酶活性越強(qiáng)FRET的優(yōu)勢(shì)均相檢測(cè)(無(wú)分離和洗滌步驟)在溶液中進(jìn)行，沒(méi)有固相的參與，因此反應(yīng)速度較快，操作也相應(yīng)簡(jiǎn)單可以很好地觀察活細(xì)胞內(nèi)酶活性變化，并且能做到定時(shí)、定量、定位，是一種非常有效的研究手段無(wú)放射性FRET的缺點(diǎn)供體與受體的距離限定為10-80?，而許多生物結(jié)構(gòu)（如蛋白-DNA復(fù)合物，大的蛋白，膜等）為80-130?信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1；背景噪聲來(lái)自供體熒光干擾及受體被直接激發(fā)供體與受體濃度的比率很關(guān)鍵必須有兩種熒光標(biāo)記以熒光為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)熒光強(qiáng)度(FI)時(shí)間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)結(jié)合TRF與FRET，選擇發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)的稀土元素作為Donor，使得Acceptor的發(fā)光時(shí)間更長(zhǎng)選擇檢測(cè)時(shí)間，避開激發(fā)光和Acceptor直接被激發(fā)的發(fā)光時(shí)間區(qū)域解決信噪比問(wèn)題應(yīng)用實(shí)例：cAMP濃度檢測(cè)cAMP重要的第二信使傳統(tǒng)的報(bào)告基因方法HTRF供體: 抗cAMP抗體用銪螯合物Eu(K)標(biāo)記受體: cAMP用XL665(Allophycocyanin)標(biāo)記樣品分子: 處理后的細(xì)胞裂解物cAMP與標(biāo)記的cAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體計(jì)算受體發(fā)射光與供體發(fā)射光的比值，比值越大則細(xì)胞中cAMP的濃度越低應(yīng)用實(shí)例：cAMP濃度檢測(cè)YenergytransferXL665EuExcitationat320nmEmissionat665nmlong-liveddecayat665nmTimeIntensitycAMP由于Eu元素的熒光壽命較長(zhǎng)，當(dāng)FRET效應(yīng)存在時(shí)，會(huì)使得XL665也保持較長(zhǎng)的能量衰減時(shí)間EnergyTransferfromEutoXL665應(yīng)用實(shí)例：cAMP濃度檢測(cè)cAMPExcitationat320nmEmissionat665nmshort-livedsignalat665nm,

discriminatedbytimingparametersTimeIntensityXL665如果不存在FRET效應(yīng)，激發(fā)光直接激發(fā)APC，APC所發(fā)出的是一個(gè)短壽命的熒光NoEnergyTransfer應(yīng)用實(shí)例：cAMP濃度檢測(cè)YEuExcitationat320nmEmissionat612/620nmlong-livedsignalat612/

620nm,

discriminatedbywavelengthTimeIntensityNoEnergyTransfer對(duì)于部分沒(méi)有結(jié)合的Eu標(biāo)記的抗體分子，同樣會(huì)被激發(fā)出長(zhǎng)壽命的熒光均相時(shí)間分辨熒光的優(yōu)勢(shì)鑭系元素標(biāo)記，能量傳遞效率更高，放大了所能檢測(cè)到的作用距離范圍(100-200?)，提高了檢測(cè)的靈敏度及應(yīng)用范圍時(shí)間分辨的檢測(cè)方法，可極大地降低背景熒光的干擾，提高信噪比均相，操作簡(jiǎn)單快速，僅需三個(gè)步驟:加樣，孵育，測(cè)量采用比率計(jì)算，更為準(zhǔn)確，降低了系統(tǒng)誤差以熒光為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)熒光強(qiáng)度(FI)時(shí)間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)熒光壽命（FLT）熒光壽命τ：熒光分子在回到基態(tài)之前之前維持激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間一般在ns范圍內(nèi)熒光壽命受到許多條件的影響，可作為一種分子狀態(tài)（環(huán)境）改變的標(biāo)志檢測(cè)速度是其他方法的幾百萬(wàn)倍對(duì)分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，時(shí)間顯微技術(shù)熒光壽命（FLT）I(t)=I0e(-t/t)

熒光壽命：當(dāng)熒光強(qiáng)度衰減到最高值的1/e時(shí)（一般是37%)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間外界環(huán)境和分子自身的狀態(tài)變化影響熒光壽命τ=1/(krad+knonrad)使用FLT篩選藥物快速，高通量篩選人類α凝血酶抑制子已知aptamer是一種有效的抑制因子用IRIS-5標(biāo)記aptamer，與α凝血酶結(jié)合或分離表現(xiàn)不同的熒光壽命代篩選的物質(zhì)與aptamer競(jìng)爭(zhēng)α凝血酶導(dǎo)致aptamer的分離改變熒光壽命使用FLT篩選藥物篩選窗口FP驗(yàn)證熒光技術(shù)總結(jié)FI，TRF相對(duì)而言是一項(xiàng)異相操作技術(shù)，相比均相檢測(cè)技術(shù)較為煩瑣，但應(yīng)用范圍更廣，操作靈活FP、FRET、HTRF均是均相分子檢測(cè)技術(shù)，擯棄了異相操作的煩瑣步驟、洗滌條件的嚴(yán)格控制、結(jié)果的不均一化等條件的限制FP技術(shù)整體操作簡(jiǎn)單易行，所耗試劑成本較低，而且可以進(jìn)行動(dòng)力學(xué)計(jì)算，但容易受一些外界因素影響（背景干擾，溶液離子環(huán)境）、檢測(cè)范圍相比而言較窄（分子量的限制）FRET技術(shù)相比FP而言可進(jìn)行活體檢測(cè)，是一項(xiàng)動(dòng)態(tài)分析檢測(cè)技術(shù)，可以計(jì)算分子間相互作用的平衡常數(shù)以及反應(yīng)速率。但試劑成本較高，而且容易受直接激發(fā)干擾，分子間的檢測(cè)距離也往往受到一定的限制。熒光技術(shù)總結(jié)HTRF技術(shù)能解決分子間檢測(cè)距離的限制，也基本不受溶液離子環(huán)境，溫度、背景熒光，激發(fā)光等的干擾，且能排除加樣體積等的影響HTRF采用的是比率計(jì)算，從而消除了分子濃度不均一等造成的系統(tǒng)誤差。因此相比而言，HTRF是一項(xiàng)信噪比絕佳的熒光分析技術(shù)。而且HTRF還是一項(xiàng)動(dòng)態(tài)分析檢測(cè)技術(shù)FLT是一項(xiàng)新技術(shù)，以其檢測(cè)敏感，時(shí)間短和高通量為優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)儀器配置要求很高原理及應(yīng)用介紹大綱光的物理簡(jiǎn)介光吸收檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例熒光檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例發(fā)光檢測(cè)的原理與應(yīng)用實(shí)例發(fā)光原理發(fā)光：與熒光類似，同樣是由于電子的躍遷產(chǎn)生的，但促成電子的躍遷的能量不是由光源直接激發(fā)造成的，而是來(lái)源于反應(yīng)中產(chǎn)生的能量化學(xué)發(fā)光是能量來(lái)自于化學(xué)反應(yīng)引起的發(fā)光生物發(fā)光是能量來(lái)自于酶促催化下的生化反應(yīng)引起的發(fā)光分類連續(xù)發(fā)光型（輝光型）：發(fā)光長(zhǎng)效持久，無(wú)需自動(dòng)加樣器。(eg.Alkalinephosphatase)瞬時(shí)發(fā)光型（閃光型）：發(fā)光時(shí)間短，變化快

，需使用自動(dòng)加樣器。(eg.Aequorin)發(fā)光原理Intensitytime20minutes1.5-2hoursFlashlumiassay:PicaGene–singlecolorGlowlumiassay:PicaGeneLT(longlifetime)發(fā)光的應(yīng)用領(lǐng)域報(bào)告基因檢測(cè)化學(xué)發(fā)光免疫分析核酸定量(PCRQuantification)酶活分析活性氧分析BRET分析報(bào)告基因檢測(cè)評(píng)價(jià)啟動(dòng)子調(diào)控效率和其中作用元件的有效方法雙報(bào)告系統(tǒng)同時(shí)向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入兩種報(bào)告基因其中一種為待研究的啟動(dòng)子控制（熒火蟲熒光素酶），另一種為不被處理所影響的啟動(dòng)子控制（海腎熒光素酶）作為內(nèi)參消除系統(tǒng)誤差報(bào)告基因檢測(cè)Transfectcells分別將兩個(gè)載體中的SV40啟動(dòng)子替換成一個(gè)目標(biāo)啟動(dòng)子和一個(gè)內(nèi)參啟動(dòng)子分別測(cè)量?jī)蓚€(gè)報(bào)告系統(tǒng)中l(wèi)uciferase表達(dá)量將結(jié)果用內(nèi)參均一化（比值）報(bào)告基因檢測(cè)得出報(bào)告基因活性在不同條件下的相對(duì)值報(bào)告基因檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)減小隨機(jī)誤差比率計(jì)算避免了系統(tǒng)誤差超高的靈敏度（極低的背景干擾）動(dòng)力學(xué)范圍更廣發(fā)光強(qiáng)度在4～6個(gè)數(shù)量級(jí)之間與測(cè)定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系無(wú)需昂貴的設(shè)備投入手段更為靈活生物發(fā)光共振能量傳遞（BRET）研究分子間相互作用EnergytransferfrombioluminescentDonor

fluorescentAcceoptorDonor=Renillaluciferase(Rluc)Acceptor=GreenFluorescentProtein(GFP2)生物發(fā)光共振能量傳遞（BRET） 加入底物DeepBlueCTM，Rluc發(fā)射藍(lán)光(390-400nm)，當(dāng)A蛋白和B蛋白結(jié)合，生物共振能量傳遞發(fā)生，GFP發(fā)射綠光(505-508nm)RlucDeepBlueC?GFP2ProteinAProteinBDeepBlueC?RlucGFP2BRET2BRET的應(yīng)用領(lǐng)域蛋白組學(xué)監(jiān)測(cè)蛋白-蛋白相互作用檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞器間的相互作用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)酵母雙雜交結(jié)果的驗(yàn)證受體研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路研究BRET的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)優(yōu)勢(shì)避免了光漂白信號(hào)穩(wěn)定：可維持1小時(shí)分析方法靈活缺點(diǎn)步驟繁瑣，難度高在細(xì)胞中要同時(shí)表達(dá)兩種蛋白融合蛋白總結(jié)各種技術(shù)的影響因素GeniosPro檢測(cè)模式及儀器特點(diǎn)主要競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品分析December,2004GeniosPro之檢測(cè)模式及儀器特點(diǎn)December,2004檢測(cè)模式應(yīng)有盡有－堪稱全能戰(zhàn)士：光吸收（230－1000nm）熒光強(qiáng)度（230－900nm）熒光偏振(275–750nm)時(shí)間分辨熒光均相時(shí)間分辨熒光底部閱讀熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET化學(xué)發(fā)光：連續(xù)和瞬時(shí)化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移BRET雙報(bào)告系統(tǒng)：Chroma-Glo

GeniosPro之檢測(cè)模式及儀器特點(diǎn)December,2004儀器設(shè)計(jì)獨(dú)到巧妙－－堪稱濾光片系統(tǒng)的精致之作每一個(gè)細(xì)節(jié)都體現(xiàn)著精致：光源：高能閃爍氙燈——檢測(cè)范圍更廣，從紫外區(qū)到遠(yuǎn)紅外區(qū)使用壽命更長(zhǎng)（可閃爍1百萬(wàn)次以上）無(wú)需預(yù)熱，工作狀態(tài)更穩(wěn)定適合瞬時(shí)檢測(cè)

GeniosPro之檢測(cè)模式及儀器特點(diǎn)December,2004每一個(gè)細(xì)節(jié)都體現(xiàn)著精致：光路：

發(fā)光、頂部和底部閱讀各自采用獨(dú)立的光路系統(tǒng)，避免了相互干擾無(wú)光纖，內(nèi)置多個(gè)二分鏡，由二分鏡分光，最大限度的減少了光傳播途徑中的能量損失。

GeniosPro之檢測(cè)模式及儀器特點(diǎn)December,2004每一個(gè)細(xì)節(jié)都體現(xiàn)著精致：檢測(cè)器：光吸收、熒光和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)分別由三個(gè)各自獨(dú)立優(yōu)化的檢測(cè)器完成：

光電二極管：檢測(cè)范圍廣，滿足4O.D以下的吸收光檢測(cè)

低暗電流PMT：具有大光敏面積，適用于各類熒光檢測(cè)

單光子計(jì)數(shù)PMT：用于化學(xué)發(fā)光及BRET的檢測(cè)，具有增益值高、暗電流小、噪聲低、時(shí)間分辨率高、量子效率高、紅光敏感等特點(diǎn)。

（其他產(chǎn)家產(chǎn)品多數(shù)只有兩個(gè)探測(cè)器，一個(gè)針對(duì)光吸收，一個(gè)針對(duì)熒光，兼顧較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光）

GeniosPro之檢測(cè)模式及儀器特點(diǎn)December,2004每一個(gè)細(xì)節(jié)都體現(xiàn)著精致：濾光片——濾光片分組放入條形架中，可隨意插入，取出，既保護(hù)了濾光片，又使濾光片更換象更換電腦軟盤一樣方便。每臺(tái)機(jī)器可自定義多達(dá)42片濾光片，充分滿足科研需要。（PE,BMG,Berthold都是濾光片輪，更換時(shí)需旋下濾光片）

GeniosPro之檢測(cè)模式及儀器特點(diǎn)December,2004每一個(gè)細(xì)節(jié)都體現(xiàn)著精致：底部與頂部閱讀——只需軟件設(shè)置，無(wú)需手動(dòng)更換附件內(nèi)置式加樣器－美觀適用用于各種快速動(dòng)力學(xué)加樣，瞬時(shí)反應(yīng)加樣

GeniosPro之檢測(cè)模式及儀器特點(diǎn)December,2004每一個(gè)細(xì)節(jié)都體現(xiàn)著精致：超強(qiáng)化學(xué)發(fā)光配置專配濾光片輪可倍比弱化過(guò)強(qiáng)發(fā)光，擴(kuò)大檢測(cè)線性范圍

可增加檢測(cè)功能（如雙報(bào)告基因檢測(cè)，BRET檢測(cè)）Z軸可調(diào)——在不同液面高度的檢測(cè)中均能找到最佳測(cè)量位置，得到最強(qiáng)的信號(hào)

Infinite?

200系列酶標(biāo)儀特點(diǎn):經(jīng)典雙子座,無(wú)限自由風(fēng)配置最靈活的高端全能型酶標(biāo)儀配置最靈活——可選擇F200濾光片型或M200光柵型；八種模塊自由選擇功能全面——

九種功能模式高端性能——FI/Lum等靈敏度處于高端水平直觀化操作性