中藥制劑中各類化學(xué)成分分析

第一節(jié)含生物堿類成分的分析

一、含生物堿類成分中藥制劑的定性鑒別

(一)生物堿的沉淀反應(yīng)

(1)生物堿的酸性水溶液或稀醇（小于50%）溶液中，滴加硅鎢酸、磷鎢酸、磷鉬酸試劑數(shù)滴，生成（BH+）4[Si（W3O10）4]沉淀（淡黃色或灰白色）、3BHPO412WO32H2O沉淀（白色至褐色）、3BH3PO412MoO32H2O沉淀（白色至黃褐色，加氨水轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色）。

(2)生物堿的酸性水溶液或稀醇（小于50%）溶液中，滴加碘-碘化鉀試劑數(shù)滴，產(chǎn)生棕色或褐色沉淀，

BH++I2-K+I-→BI2HI（棕、褐色）+K+(3)生物堿的酸性水溶液或稀醇（小于50%）溶液中，滴加碘化鉍鉀、碘化汞鉀試劑數(shù)滴，產(chǎn)生紅棕色沉淀、類白色沉淀。

BH++BiI3KI→BBiI3HI（紅棕色）+K+BH++HgI2KI→BHgI22HI（類白色）+K+

2021/5/71

(二)生物堿的色譜鑒別

1．薄層色譜法首先用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛∩飰A，提取液經(jīng)濃縮后直接或經(jīng)過(guò)必要的凈化后，點(diǎn)在薄層板上，層析后噴灑生物堿顯色劑，再根據(jù)生物堿的特性，選擇特異的顏色反應(yīng)或熒光，并應(yīng)用純品對(duì)照，或標(biāo)準(zhǔn)藥材對(duì)照，同時(shí)須作陰性對(duì)照后確定。如用硅膠為吸附劑時(shí)，一般應(yīng)用堿性系統(tǒng)展開(kāi)劑較多，或使生物堿的薄層分離在堿性環(huán)境下進(jìn)行。

2．紙色譜法多為薄層色譜所代替，利用多緩沖紙色譜來(lái)快速鑒別烏頭中雙酯類生物堿和醇胺類生物堿有其獨(dú)到之處。

3．高效液相色譜法在恒定的高效液相色譜條件下，各種生物堿都具有一定的保留時(shí)間，可作為定性鑒別的參數(shù)。一般要求取得兩個(gè)色譜系統(tǒng)的保留時(shí)間，或應(yīng)用二級(jí)管陣列檢測(cè)器作出鑒定。

4．氣相色譜法適用于具揮發(fā)性且過(guò)熱不分解的生物堿分離和鑒定，目前在應(yīng)用上有一定的局限性。2021/5/72

二、含生物堿類成分中藥制劑的含量測(cè)定

(一)經(jīng)典化學(xué)方法

1.重量法重量法測(cè)定中藥制劑中生物堿多為測(cè)定其總生物堿的含量。本法可用于混合總堿、未知結(jié)構(gòu)或分子量相差較大的生物堿的含量測(cè)定。缺點(diǎn)是揮發(fā)性生物堿不宜用此法，在蒸發(fā)提取溶劑或加熱、干燥時(shí)能分解破壞以及加堿使生物堿游離時(shí)可發(fā)生水解的生物堿也不可用此法。本法取樣量大，得到的殘?jiān)诜Q量的準(zhǔn)確度內(nèi)方可應(yīng)用。應(yīng)用本法要求定量的將生物堿提取完全，并盡可能除去雜質(zhì)，須注意選擇合適的提取溶劑。實(shí)例見(jiàn)P135苦參片中苦參總堿的測(cè)定

2．容量法

(1)酸堿滴定法：

a.游離生物堿不溶于水，可先將生物堿溶于過(guò)量標(biāo)準(zhǔn)酸溶液中，再用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液回滴。

b.游離生物堿能溶于水或水-乙醇溶液中的可直接滴定。

c.生物堿鹽在水或乙醇介質(zhì)中，用強(qiáng)堿溶液滴定。一般使其溶于90％乙醇溶液中，可用標(biāo)準(zhǔn)堿乙醇液滴定，用酚酞作指示劑。2021/5/73

(2)兩相滴定法：

因邊滴邊使游離生物堿溶于有機(jī)溶劑中，不致影響終點(diǎn)的觀察。更重要的是由于游離生物堿進(jìn)入有機(jī)相，明顯地增大了生物堿鹽的電離常數(shù)pKa。生物堿鹽在兩相中的水解為pKa(D)=pKa-log(1+PC)，即與分配系數(shù)有關(guān)。一般的測(cè)定方法是稱取生物堿鹽類溶于水中(加氯化鈉少許)，然后加一定量有機(jī)溶劑，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，并不斷攪拌振搖。常用的有機(jī)溶劑有氯仿、乙醚等，以氯仿用的較多，常用的指示劑如酚酞。

如滴定劑選用酸性染料作為生物堿的兩相滴定，則稱之為酸性染料滴定法。利用在一定的pH條件下，酸性染料能與生物堿結(jié)合而定量地被有機(jī)溶劑提出，當(dāng)?shù)味ǖ竭_(dá)終點(diǎn)時(shí)，由于稍過(guò)量的酸性染料，使水層產(chǎn)生顏色而指示終點(diǎn)。為了保證酸性染料與生物堿的結(jié)合，可在水層中加入緩沖溶液。

BH++In-→BHIn

本方法測(cè)定生物堿含量時(shí)，應(yīng)注意選擇合適的pH、合適的酸性染料和合適的有機(jī)溶劑。酸性染料現(xiàn)以溴酚藍(lán)、溴麝香草酚藍(lán)及溴甲酚綠應(yīng)用較多。有機(jī)溶劑應(yīng)用最多的是氯仿，其次是苯和二氯乙烷。要求有機(jī)溶劑應(yīng)對(duì)生物堿與酸性染料結(jié)合物有很好的溶解度。2021/5/74

(3)絡(luò)合滴定法：重金屬鹽類如碘化鉍鉀、碘化汞鉀和碘化鎘鉀等可使生物堿或其鹽生成沉淀，將沉淀溶解，然后用絡(luò)合滴定劑直接滴定原來(lái)沉淀中的重金屬；或者濾出沉淀，滴定濾液中剩余的過(guò)量的重金屬而求得生物堿含量。本測(cè)定方法手續(xù)繁瑣，目前僅應(yīng)用于原料藥材的生物堿含量測(cè)定，在中藥制劑中應(yīng)用較少。

(4)沉淀容量法：利用多數(shù)生物堿與硅鎢酸、雷氏鹽、四苯硼鈉等試劑，生成沉淀，組成一定，直接或間接測(cè)定其含量。例如生物堿或其鹽類與一定量四苯硼鈉溶液作用，過(guò)量的四苯硼鈉用陽(yáng)離子表面活性劑如氯化十六烷基吡啶或氯化烴基二甲基芐基銨溶液回滴過(guò)量的四苯硼鈉，以溴酚藍(lán)為指示劑，終點(diǎn)時(shí)多一滴以上季銨鹽溶液與溴酚藍(lán)生成鮮藍(lán)色絡(luò)合物以指示終點(diǎn)，此方法亦多用于原料藥材的生物堿含量測(cè)定。2021/5/75

(二)光譜法

(1)雷氏鹽比色法：生物堿與雷氏鹽生成沉淀后，將沉淀分離，溶于丙酮，于520～526nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定吸收度，換算生物堿的含量。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明生物堿的雷氏鹽沉淀的丙酮溶液所呈現(xiàn)的吸收特征，是由于分子結(jié)構(gòu)中的硫代氰酸鉻銨部分，而不是結(jié)合的生物堿部分，其吸收值與樣品或溶劑無(wú)關(guān)。硫代氰酸鉻銨在丙酮中的克分子吸收系數(shù)為106.5(單鹽)或213.0(雙鹽)。故可根據(jù)其吸收值A(chǔ)按下式直接測(cè)得樣品重而不需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

W=（A/ε）×M×V/1000

式中，M：生物堿雷氏鹽沉淀的分子量，W：生物堿雷氏鹽沉淀的重量；A：吸收度；ε：克分子消光系數(shù)；V：丙酮毫升數(shù)。

本方法可不需要標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，但需注意生物堿生成單鹽或雙鹽，并要注意樣品的凈化。2021/5/76

(2)酸性染料比色法：在一定pH的介質(zhì)中，生物堿B與氫離子H+結(jié)合成鹽(BH+)，與某些酸性染料的陰離子In-結(jié)合成有色化合物[BH+In-]，它能定量的被有機(jī)溶劑提取出來(lái)，此結(jié)合物堿化或酸化后，即定量放出染料可進(jìn)行比色，或測(cè)定該有色的有機(jī)溶液。此方法的關(guān)鍵：選擇合適的pH、合適的酸性染料和合適的有機(jī)溶劑。含有1個(gè)N原子的生物堿與酸性染料(溴酚藍(lán))生成分子1∶l的結(jié)合物，與2個(gè)N原子的生物堿生成分子1∶2的結(jié)合物(pH應(yīng)較低pH3.0～5.8)。此外，應(yīng)防止操作時(shí)混入水分。同時(shí)也須注意帶入水相中過(guò)量染料影響測(cè)定的結(jié)果。實(shí)例P147延胡索乙素酸性染料比色法2021/5/77

(3)苦味酸鹽法：凡是在弱酸或中性溶液中能與苦味酸定量發(fā)生沉淀的生物堿，都可按本方法測(cè)定含量。

a.是濾取生物堿-苦味酸鹽沉淀，加堿使生物堿-苦味酸鹽解離，然后以有機(jī)溶劑提出生物堿，將苦味酸的堿性水溶液進(jìn)行比色，再換成生物堿的含量。

b.是在pH為7的緩沖液中，使生物堿與苦味酸結(jié)合成鹽，用氯仿提取此鹽，然后再以pH為11的堿性緩沖液使氯仿中苦味酸鹽解離，并將苦味酸提取到堿性水溶液中再進(jìn)行比色。

c.是直接在pH為4～5的緩沖溶液中，用氯仿提取生物堿苦味酸鹽，將氯仿提取液直接進(jìn)行比色。

（4）其他如色譜-光譜連用技術(shù)、導(dǎo)數(shù)光譜法等實(shí)例：P141小檗堿的紫外分光光度法

P145麻黃堿的測(cè)定（Cu2+-二硫化碳法）2021/5/78

(三)色譜法

1．高效液相色譜生物堿類成分進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)，可采用正相、反相和離子對(duì)色譜，其中以反相高效液相色譜應(yīng)用較多。在反相高效液相色譜中為了克服游離硅醇基的影響，采取了以下的措施，

(1)流動(dòng)相方面的改進(jìn)：

a.加入硅醇基抑制劑，最常用的硅醇基抑制劑是三乙胺;b.在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑;c.在流動(dòng)相中加入季銨鹽試劑，例如在水-甲醇流動(dòng)相中加入0.01mol／L的溴化四甲基胺。

機(jī)理是流動(dòng)相不斷地流入色譜柱后，即連續(xù)地添加掩蔽性試劑(季胺鹽)，被分離的堿性化合物和硅醇基之間的相互作用被阻礙，從而使生物堿類成分得到很好的分離。流動(dòng)相中水-甲醇比例的改變以及pH的變化都不影響峰的對(duì)稱性。

(2)固定相方面的改進(jìn)：選擇碳鏈較短的鍵合相硅膠填料，例如C8比C18好。

(3)增加流動(dòng)相的脂溶性。

(4)調(diào)整流動(dòng)相的pH值,pH>pKa+1或<pKa-1條件下用離子對(duì)試劑。

(5)升高柱溫。2021/5/79

基本流程

1）樣品供試液制備：樣品根據(jù)生物堿通性提取、凈化、定容制備供試液。（如利用生物堿溶于氯仿，生物堿鹽不溶于氯仿，通過(guò)萃取與反萃取達(dá)到提取凈化，再定容后制成樣品供試液）。

2）標(biāo)準(zhǔn)液配制：先配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再配制成系列標(biāo)準(zhǔn)液。

3）系統(tǒng)適應(yīng)性：色譜柱、流動(dòng)相、流速、檢測(cè)器、測(cè)試波長(zhǎng)等。

4）選擇定量方式，并相應(yīng)進(jìn)樣、檢測(cè)、計(jì)算含量。

實(shí)例：P142-143小檗堿的HPLC分析

P145-146麻黃堿與偽麻黃堿的HPLC分析2021/5/7109、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20235:07:52PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32021/5/711

2．薄層色譜法薄層色譜技術(shù)在生物堿類成分分離和測(cè)定須結(jié)合生物堿的通性選擇合適的提取溶劑制成供試品溶液，需要采用化學(xué)方法提取和純化，常用液-液萃取或液-固萃取，或結(jié)合生物堿的特性進(jìn)行純化。常使用堿性展開(kāi)劑或在堿性氣氛中展開(kāi)。在薄層直接掃描定量時(shí)，須首先作一工作曲線，目的是考察工作曲線是否為通過(guò)原點(diǎn)的直線，以便決定采用外標(biāo)一點(diǎn)法或外標(biāo)兩點(diǎn)法進(jìn)行定量，其次需要找出線性范圍，以便摸索樣品點(diǎn)樣量。采用薄層直接掃描定量還需要隨行對(duì)照品進(jìn)行，同時(shí)要考察穩(wěn)定性，同板、異板效應(yīng)和精密度等。實(shí)例安宮牛黃丸1）小檗堿的TLC-比色法

2）小檗堿的TLC掃描法P142

胃特靈、沉香舒氣丸中延胡索乙素的TLC法1472021/5/712

3．氣相色譜法氣相色譜法適用于有揮發(fā)性的，遇熱不分解的生物堿類。游離堿或鹽都只能得到一個(gè)游離堿的色譜峰，但生物堿鹽在急速加熱器中產(chǎn)生的酸對(duì)色譜柱和檢測(cè)器不利，所以一般多經(jīng)提取后進(jìn)柱。例如麻黃堿、苦參堿和顛茄類生物堿。實(shí)例疏風(fēng)定痛丸中麻黃堿含量測(cè)定P1442021/5/713第二節(jié)黃酮類制劑的分析

一、含黃酮類成分的定性鑒別

定性鑒別方法主要有化學(xué)顯色反應(yīng)，紙色譜和薄層色譜

(一)化學(xué)顯色反應(yīng)

1.還原反應(yīng)

鹽酸-鎂粉反應(yīng)顯色反應(yīng)的機(jī)理是黃酮類成分經(jīng)還原反應(yīng)后生成花色甙元及其二聚物。

定性鑒別的操作：將中藥制劑用適當(dāng)方法提取分離。組分較少的制劑可用有機(jī)溶劑提取，常用的溶劑有甲醇、乙醇或乙酸乙酯；取樣品液5～10mL，加入數(shù)滴鹽酸，然后加入少許鎂粉，如果有黃酮、黃酮醇或其二氫化合物存在，數(shù)分鐘后則可產(chǎn)生橙色或紅色。必要時(shí)，需作空白試驗(yàn)。

2021/5/7142．與金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)

黃酮類成分能與金屬離子如Al3+，Zr4+等產(chǎn)生絡(luò)合作用，產(chǎn)生熒光或顏色加深等。

絡(luò)合作用的條件是黃酮類成分必須具備下述條件之一，即5-羥基(a)、3-羥基(b)或鄰二酚羥基(c)，(a)、(b)都是羥基與4位羰基共同與金屬離子形成絡(luò)合物。

三氯化鋁、硝酸鋁和二氯氧鋯的醇溶液常作為黃酮類成分的重要定性試劑及薄層與紙層析的顯色劑。

2021/5/715

(二)紙色譜法

黃酮類成分紙色譜的溶劑系統(tǒng)可歸納為酸性溶劑與中性溶劑系統(tǒng)兩個(gè)方面。

酸性溶劑系統(tǒng)是多種不同比例量的混合酸性溶劑，對(duì)絕大多數(shù)黃酮成分的分離，均能取得適當(dāng)?shù)腞f值，分離較好，色點(diǎn)擴(kuò)散也小，尤以正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)應(yīng)用最為普遍。此外，適當(dāng)濃度的稀釋乙酸如乙酸-水(6∶4)也能得到較滿意的分離，尤以黃酮甙類結(jié)果更好。假若增加乙酸濃度，一般可以使游離黃酮類的Rf值增大。

中性溶劑系統(tǒng)是用水和有機(jī)溶劑組成的。利用水對(duì)各種黃酮及其甙類不同的溶解度，易于產(chǎn)生化合物間分配系數(shù)的差別。乙酸乙酯-水，氯仿-水，正丁醇-水等，都是實(shí)用的溶劑系統(tǒng)。

2021/5/716

(三)薄層色譜法

黃酮類成分的薄層定性，一般采用吸附薄層，常用的吸附劑有硅膠與聚酰胺，也有用纖維素、硅酸鎂、氧化鎂。硅膠色譜分離弱極性化合物較好聚酰胺色譜分離含游離酚羥基的黃酮及其甙較理想纖維素薄層則適用于分離多糖甙混合物展開(kāi)后的顯色反應(yīng)可采用在紫外光下觀察熒光和噴顯色劑相配合的方法。

2021/5/7171．硅膠薄層色譜

用硅膠分離黃酮成分遵循正相色譜層析規(guī)律，化合物極性越強(qiáng)，所需溶劑的極性越大。其Rf值順序如下：RCH3>RH>ROCH3>R-O-糖>ROH常用的溶劑系統(tǒng)有：甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)，分離黃酮甙元；苯-甲醇(95∶5)，分離黃酮甙元；苯-甲醇-乙酸(35∶5∶5)，分離黃酮甙；氯仿-甲醇(8∶2)，分離黃酮甙元及甙；苯-乙酸乙酯(7.5∶2.5)或苯-丙酮(9∶1)，分離黃酮甙元衍生物如甲醚或乙酸酯中性成分；甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)，分離雙黃酮成分。溶劑系統(tǒng)中各組分的配比可根據(jù)薄層色譜的需要加以調(diào)整。2021/5/718

實(shí)例淫羊藿的鑒別

供試液制備取本品粉末0.5g，加50％乙醇30ml置水浴上回流30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干乙醇后，加水少量溶解，加至聚酰胺小柱上，先后用水，乙醇各lOOml洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)靡掖既芙猓钩?ml，作為供試品溶液。

對(duì)照液制備取淫羊藿甙對(duì)照品，用乙醇制成0.5mg/ml的溶液。

薄層板硅膠G加0.1MNa2HPO4的0.3％CMC-Na+自制板；厚度：250um

點(diǎn)樣供試品溶液10uL，對(duì)照品溶液2uL；條帶狀點(diǎn)樣。

展開(kāi)劑醋酸丁酯-甲酸-水(1.3∶1∶1)10℃以下放置后的上層溶液。

展開(kāi)方式展開(kāi)劑預(yù)平衡15分鐘；上行展開(kāi)；展距：8cm

顯色噴以5％AlCl3乙醇溶液，105℃加熱約數(shù)分鐘后，置紫外光燈(365nm)下檢視。

色譜識(shí)別供試品色譜中，在與淫羊藿甙對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)。

注意事項(xiàng)溫度在25℃以上；控制濕度在18-47％范圍內(nèi)色譜效果較好。2021/5/719123456樣品：

1.淫羊藿甙2.淫羊藿3.箭葉淫羊藿

4.朝鮮淫羊藿5.柔毛淫羊藿6.巫山淫羊藿2021/5/720

2．聚酰胺薄層色譜聚酰胺薄層色譜用于分離含游離酚羥基的黃酮甙與甙元較好。由于各種黃酮類成分取代基團(tuán)的性質(zhì)、多少和位置的不同，與聚酰胺形成氫鍵的能力有所差異而得到分離。一般說(shuō)來(lái)，展開(kāi)劑中大多含醇、酸、水，或二者兼有。常用的溶劑系統(tǒng)有：甲醇-水(8∶2)，分離黃酮甙元及甙，乙醇-水-乙酰丙酮(2∶4∶1)，水-乙醇-丁酮-乙酰丙酮(13∶3∶3∶1)，苯-丁酮-甲醇(6∶2∶2)，分離黃酮甙元；甲酸-甲醇-乙酸乙酯(1∶21∶8)，乙酸-水(1∶2)，分離黃酮甙。如鼻炎康片中黃芩甙的薄層色譜。取片劑細(xì)粉，加50％乙醇于60℃水浴中熱浸30分鐘，濾過(guò)，取濾液點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，用36％醋酸展開(kāi)，以黃芩甙為對(duì)照品，展開(kāi)后于紫外燈下觀察（365nm)，黃芩甙呈紫色斑點(diǎn)，Rf值約為0.30。

2021/5/721

3．纖維素薄層色譜纖維素薄層色譜可用于分離黃酮甙類較好，原理與紙色譜相同，色譜流動(dòng)相可套用紙色譜所有的流動(dòng)相。常用的展開(kāi)劑有，

(1)正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)。

(2)2％甲酸；不同濃度的乙酸(6％、10％、40％、60％)；乙酸乙酯-甲酸-水(8∶2∶3，上層)。

(3)異丙醇-氫氧化銨-水(8∶1∶1)。

a.黃酮類成分的纖維素色譜行為是：分子中酚羥基增多時(shí)，無(wú)論用上述任意一溶劑系統(tǒng)Rf值均減少；當(dāng)分子中羥基為甲基或甲氧基所取代時(shí)，Rf值增加，

b.黃酮甙分子中醇羥基增多，用不同濃度的乙酸展開(kāi)，Rf值增加，而用正丁醇乙酸水系統(tǒng)則相反。2021/5/722

二、黃酮類成分定量分析

(一)比色法最常用的是與鋁鹽反應(yīng)，試劑為三氯化鋁和硝酸鋁。測(cè)定總黃酮時(shí)常用蘆丁作對(duì)照品。實(shí)例降壓丸中蘆丁的測(cè)定---鋁鹽絡(luò)合比色法

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密吸取蘆丁液分別置于25ml量瓶中，分別加入5％亞硝酸鈉1.0ml，混勻，放置6分鐘，加入10％硝酸鋁1.0ml，混勻，放置6分鐘，加入4％氫氧化鈉溶液10.0ml，用水稀釋至刻度，混勻，放置15分鐘，在500nm處分別測(cè)定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品液體積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2021/5/723

供試品測(cè)定將丸劑粉碎，精密稱取相當(dāng)于1.0g槐米的細(xì)粉，置于索氏提取器中，加入60ml乙醚，回流至無(wú)色，放冷，除去乙醚，再加甲醇60ml回流提取至無(wú)色，放冷。將甲醇提取液轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，定容。精密吸取10m1，置于另一100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。精密吸取3.0ml于25ml量瓶中，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下“加5％亞硝酸鈉1.0ml……”操作，測(cè)定吸收度，再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)曲線中查出相當(dāng)于蘆丁對(duì)照品液的體積，應(yīng)用下列算式計(jì)算蘆丁的含量。蘆丁%=V×F×100%/（3×W）2021/5/724

（二)紫外分光光度法黃酮類化合物吸收帶I在較長(zhǎng)波長(zhǎng)(330～380nm)，是由B環(huán)的桂皮?；鸬?；Ⅱ帶在較短波長(zhǎng)(240～280nm)，系A(chǔ)環(huán)的苯甲?；鸬?。最大吸收波長(zhǎng)范圍因各類型結(jié)構(gòu)不同而異，

a.黃酮、黃酮醇I帶330～350nm，Ⅱ帶250～270nm；

b.雙氫黃酮I帶吸收弱310～330nm，Ⅱ帶275～290nm；

c.異黃酮無(wú)I帶吸收，Ⅱ帶250～270nm；

d.查耳酮I帶360～390nm，Ⅱ帶吸收較弱240～260nm。

一般隨共軛程度和羥基數(shù)目的增加，吸收帶向長(zhǎng)波移動(dòng)。中藥制劑的成分復(fù)雜，一般需經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶崛》蛛x(如正丁醇、乙酸乙酯萃取，聚酰胺柱、C18柱分離）后，才能進(jìn)行定量分析。

2021/5/725實(shí)例：

1.復(fù)方蘆丁片中蘆丁的測(cè)定——單波長(zhǎng)分光光度法2.銀黃注射液中黃芩甙和綠原酸的測(cè)定——聯(lián)立方程法

P156A276=A黃276+A綠276=ε黃276C黃L+ε綠276C綠LA324=A黃324+A綠324=ε黃324C黃L+ε綠324C綠LL=1cmC黃=(ε綠324A276-ε綠276A324)/(ε黃276ε綠324-ε黃324ε綠276)C綠=(ε黃324A276–ε黃276A324)/(ε綠276ε黃324-ε綠324ε黃276)2021/5/726

(三)薄層色譜法薄層色譜法測(cè)定中藥制劑中單體黃酮類成分的關(guān)鍵是分離。樣品經(jīng)有機(jī)溶劑或水提取后，可用硅膠、纖維素或聚酰胺進(jìn)行層析，以達(dá)到分離的目的。層析后可TLC-比色法測(cè)定；也可以用薄層掃描儀直接測(cè)定。實(shí)例1銀黃注射液中黃芩甙的測(cè)定----TLC-比色法實(shí)例2枳實(shí)導(dǎo)滯丸中橙皮甙的測(cè)定----熒光薄層掃描法2021/5/727

(四)高效液相色譜法

黃酮類成分的RP-HPLC：大多用C18鍵合相，流動(dòng)相常用甲醇-水-乙酸(或磷酸緩沖液)及乙腈-水。實(shí)例

1.生脈注射液中麥冬高異黃酮的測(cè)定

2.海馬補(bǔ)腎丸中淫羊藿甙的測(cè)定

3.鼻炎康片中黃芩甙的測(cè)定

4.復(fù)春片中淫羊藿甙的測(cè)定。

5.香砂養(yǎng)胃丸中橙皮甙的測(cè)定2021/5/728黃酮類成分的NP-HPLC：

a.無(wú)羥基的黃酮類化合物或乙?；S酮類化合物，固定相為硅膠，流動(dòng)相可套用薄層色譜條件，但極性要相對(duì)小一點(diǎn)。

b.乙酰化黃酮、有一個(gè)羥基的黃酮類成分，采用-CN鍵合相色譜，流動(dòng)相為乙烷-氯仿。

c.含有2個(gè)以上羥基的黃酮類成分可選用-NH2鍵合相，流動(dòng)相可選用二氧六環(huán)-二氯甲烷(1∶9)。2021/5/729第三節(jié)皂甙類制劑的分析

一、皂甙類成分的定性分析

(一)泡沫反應(yīng)取中藥材粉末約1g，加水10ml，煮沸10分鐘后過(guò)濾，將濾液于試管內(nèi)強(qiáng)烈振搖，如產(chǎn)生持久性泡沫(15分鐘以上)即為陽(yáng)性反應(yīng)。所產(chǎn)生的泡沫多少與pH有關(guān)，取2支試管，一管加入0.1mol/L鹽酸液5ml，另一管加入0.1mol/L氫氧化鈉液5ml，再各加入中藥水溶液，使酸管的pH為1，堿管pH為13，強(qiáng)烈振搖，如兩管所形成的泡沫高度相同，則中藥中含三萜皂甙，如堿管泡沫較酸管泡沫高數(shù)倍，則中藥中含甾體皂甙。

2021/5/730(二)顯色反應(yīng)1。醋酐-濃硫酸反應(yīng)取含皂甙樣品置試管中，加醋酐1ml溶解后，沿試管壁加入少量濃硫酸，在兩液層中間出現(xiàn)色環(huán)，甾體皂甙生成藍(lán)色或藍(lán)黑色，而三萜皂甙則出現(xiàn)紅、粉紅或紫色。2．三氯醋酸反應(yīng)取皂甙溶液滴在濾紙條上，滴三氯醋酸試劑，加熱到60℃，若斑點(diǎn)生成紅色漸變?yōu)樽仙?，則樣品為甾體皂甙；若需加熱到100℃才出現(xiàn)以上顏色變化，則樣品為三萜皂甙。3．氯仿-濃硫酸反應(yīng)樣品溶解于氯仿，沿管壁滴加濃硫酸后，在氯仿層呈現(xiàn)紅或藍(lán)色，并有綠色熒光出現(xiàn)。4．冰醋酸-乙酰氯反應(yīng)樣品溶于冰醋酸中，加入乙酰氯數(shù)滴及氯化鋅結(jié)晶數(shù)粒，稍加熱，則呈現(xiàn)淡紅色或紫紅色。5．五氯化銻反應(yīng)樣品加五氯化銻的氯仿液呈紫藍(lán)色。

2021/5/731

(三)薄層色譜皂甙類成分進(jìn)行薄層分離時(shí)采用吸附劑常用的是硅膠或氧化鋁以及特殊需要的硅藻土。親水性強(qiáng)的皂甙通常要求硅膠的吸附活性較弱些，展開(kāi)劑的極性要大些，才能得到較好的分離效果。常用的溶劑系統(tǒng)有：氯仿-甲醇-水(13∶7∶2，下層)、正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)等。

皂甙元的極性較小，如以硅膠為吸附劑，展開(kāi)劑的親脂性要求強(qiáng)烈，所用的溶劑系統(tǒng)常以苯、氯仿、己烷、異丙醚等為主要組分，再加以少量其他極性溶劑。常用的溶劑系統(tǒng)有環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1)、苯-乙酸乙酯(1∶1)、氯仿-乙酸乙酯(1∶1)等。

2021/5/732

薄層色譜后，皂甙類化合物常用的顯色劑：

(1)25％磷鉬酸乙醇溶液：噴后置140℃加熱5～10分鐘，皂甙元均呈深藍(lán)色，靈敏度高(0.5μg即能顯色)，不易褪色。

(2)三氯化銻的濃鹽酸或氯仿溶液：噴后在90℃烤10分鐘，因有毒性，應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，加熱后不同的皂甙元在可見(jiàn)光或紫外光下顯出不同種顏色，有助于鑒別皂甙元。

(3)硫酸-甲醇(1∶1)：噴后加熱，顯紅褐色、紫色、黃色或黑色，與加熱溫度有關(guān)。2021/5/733

(4)氯磺酸-乙酸(1∶2)溶液：噴后130℃加熱5分鐘，各種皂甙元顯不同顏色，如天藍(lán)、紫、粉紅、淡棕色等，在紫外光燈下也顯不同熒光，比較靈敏，可檢出10-1～10-3μg，可用于鑒別和定量。

(5)碘蒸氣：靈敏度約為1～2μg，碘的優(yōu)點(diǎn)是易揮發(fā)，顯色后揮去碘，斑點(diǎn)可作定量分析，常用于確定斑點(diǎn)位置。

注：皂甙類化合物的薄層色譜鑒別往往要求控制相對(duì)濕度與溫度，如三七皂甙在10℃以下展開(kāi)，可與人參皂甙Re分開(kāi)，在室溫展開(kāi)則不能使兩者分開(kāi)。一般可控制展開(kāi)溫度在20℃以下，相對(duì)濕度在47%左右。2021/5/734實(shí)例人參三七西洋參的薄層鑒別

供試液制備取本品粉末1g，加氯仿40ml，置水浴回流1小時(shí)，棄氯仿液，藥渣揮干，加水飽和正丁醇10ml，超聲處理30min，取上清，加氨試液三倍量，搖勻，放置分層，取上層正丁醇液蒸干，加甲醇溶解制成1ml供試液。對(duì)照液制備取人參皂甙Rb1，Rb2，Rc，Re，Rd，Rg1，Rf對(duì)照品和偽人參皂甙F11對(duì)照品，加甲醇制成每lml各含2mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

薄層板硅膠60預(yù)制板(Merck)2021/5/735

點(diǎn)樣供試液與對(duì)照液分別點(diǎn)樣1ul

展開(kāi)劑氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15402210)10℃以下放置后的下層溶液。

展開(kāi)方式展開(kāi)劑預(yù)平衡15分鐘；上行展開(kāi)；展距：12-14cm

顯色噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱數(shù)分鐘至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365nm)下檢視熒光色譜。

色譜識(shí)別

1.人參皂甙Rf為人參含有，西洋參不含，可作為人參與西洋參的區(qū)別依據(jù)之一；2．西洋參含的人參皂甙Fll，人參不含，可作為西洋參的鑒別特征；3.生曬參與紅參之區(qū)別，在于Rgl以上的“微量皂甙”，紅參較生曬參明顯。4.三七色譜較簡(jiǎn)單，最明顯的是Rbl，Re，Rgl三個(gè)主斑。需注意的是Re斑點(diǎn)與三七皂甙R1重疊。2021/5/736樣品：1-2．生曬參；3-5．紅參；6-9．朝鮮紅參；10-12．西洋參(進(jìn)口)；

13-14．西洋參(國(guó)產(chǎn))；15．三七；

16．人參皂甙對(duì)照品Rb1(S1)，Rb2(S2)，Rc(S3)，Re(S4)，Rd(S5)，

Rg1(S6)，Rf(S7)，F(xiàn)ll(S8)。2021/5/737二、皂甙類成分的定量分析

總皂甙的含量測(cè)定一般需用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛。缂状?80％～95％)、乙醇等，提取后經(jīng)分離（如水飽和的正丁醇萃取，大孔吸附樹(shù)脂經(jīng)處理后溶劑洗脫）得到總皂甙成分，再根據(jù)皂甙類化合物的各自特征來(lái)選擇含量測(cè)定方法。最常用的方法是比色法。皂甙元的含量測(cè)定時(shí)可按總皂甙的提取分離方法得到總皂甙，再加酸(如硫酸、鹽酸)加熱水解，得到皂甙元；也可以將樣品先行水解，再用有機(jī)溶劑從水解后的混合液中提取皂甙元。測(cè)定皂甙元含量的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法和比色法。單體皂甙的含量測(cè)定方法主要為薄層色譜法和高效液相色譜法。2021/5/738

(一)比色法

常利用皂甙能與某些試劑反應(yīng)后產(chǎn)生顏色，然后于可見(jiàn)光區(qū)進(jìn)行比色測(cè)定常用的皂甙顯色試劑有：

濃硫酸可以作為測(cè)定皂甙元的一種通用試劑，甾體皂甙元與濃硫酸反應(yīng)常顯黃色，但需在較高溫度(80～90℃)反應(yīng)30～60分鐘。

高氯酸用于測(cè)定有Δ5的皂甙元。

硫酸-醋酐、硫酸-冰醋酸主要用于檢測(cè)甾體皂甙

芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸

常用的皂甙類顯色劑

對(duì)-二甲氨基苯甲醛主要用于檢測(cè)三萜皂甙。實(shí)例復(fù)方丹參片中三七總皂甙的測(cè)定--大孔吸附樹(shù)脂分離-比色法

2021/5/739

(二)薄層色譜法樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)娜軇┨崛?，用薄層色譜法分離定量。定量方法可用薄層洗脫-比色法或薄層掃描法。實(shí)例龜齡集中人參總皂甙的測(cè)定--薄層色譜-比色法

歸脾丸中遠(yuǎn)志皂甙元的測(cè)定—薄層掃描法

2021/5/740薄層色譜-比色法的一般步驟：

1.供試品的制備：包括樣品的提取與預(yù)處理。

2.對(duì)照品溶液的配制

3.薄層板的制備

4.點(diǎn)樣取適量的供試品溶液容定量毛細(xì)管或半自動(dòng)點(diǎn)樣器在薄層板距底邊1-1.5cm處點(diǎn)樣（斑點(diǎn)狀或條帶狀），同時(shí)點(diǎn)上對(duì)照品的應(yīng)用溶液作隨行對(duì)照。對(duì)照品與供試品交叉點(diǎn)樣。

5.展開(kāi)：包括預(yù)平衡與樣品展開(kāi)、展開(kāi)方式，展開(kāi)劑，展距。

6.定位：日光下、紫外燈下觀察或碘蒸氣定位。

7.斑點(diǎn)捕集

8.洗脫與定量：用合適的溶劑洗脫后加顯色劑顯色，或加顯色劑顯色后離心取上清，以相同大小的固定相為空白同法操作，于合適波長(zhǎng)處比色定量。2021/5/741

薄層掃描法的一般步驟：

1.供試品的制備：包括樣品的提取與預(yù)處理。

2.對(duì)照品溶液的配制

3.薄層板的制備

4.點(diǎn)樣取適量的供試品溶液容定量毛細(xì)管或半自動(dòng)點(diǎn)樣器在薄層板距底邊1-1.5cm處點(diǎn)樣（斑點(diǎn)狀或條帶狀），同時(shí)點(diǎn)上對(duì)照品的應(yīng)用溶液作隨行對(duì)照。對(duì)照品與供試品交叉點(diǎn)樣。

5.展開(kāi)：包括預(yù)平衡與樣品展開(kāi)、展開(kāi)方式，展開(kāi)劑，展距。

6.顯色：采用合適的顯色劑噴霧顯色或衍生化顯色，與合適的溫度下烤干。

7.掃描定量：在穩(wěn)定顯色的時(shí)間內(nèi)，采用薄層掃描儀選擇合適的參數(shù)掃描定量。2021/5/742

（三）高效液相色譜法主要用于單體皂甙和皂甙元的含量測(cè)定。具有較強(qiáng)紫外吸收的皂甙類成分可用HPLC法分離測(cè)定并用紫外檢測(cè)器（HPLC-UVD）無(wú)紫外吸收或紫外吸收較弱的皂甙類成分可用HPLC法分離測(cè)定并用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）2021/5/743第三節(jié)醌類成分的分析

中藥中存在的蒽醌衍生物多為羥基蒽醌和它們的甙。常用的含蒽醌類化合物的中藥，首推大黃，此外還有蘆薈、決明、茜草、虎杖、何首烏、番瀉葉、萱草等。

含有醌類成分的中成藥制劑比較多見(jiàn)，以含大黃、何首烏、紫草、丹參的中藥制劑為代表。一、蒽醌類成分的定性分析

(一)化學(xué)顯色反應(yīng)

1.Borntrager反應(yīng)：羥基蒽醌類化合物遇堿顯紅～紫紅色

2021/5/744

2.有α-酚羥基或鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的蒽醌類化合物可與Mg2+形成橙紅、紫紅、橙黃、藍(lán)紫等顏色的絡(luò)合物。生成的產(chǎn)物具有下列結(jié)構(gòu)：2021/5/745

(二)薄層色譜法薄層色譜法是鑒別含蒽醌類成分的中藥制劑的最主要的定性方法。

吸附劑多用硅膠，

展開(kāi)溶劑系統(tǒng)：

a.用于蒽醌類成分的大都是各種溶劑的混合系統(tǒng)，而且大多含有水或甲醇。

b.乙酸乙酯-甲醇-水(100∶16.5∶13．5或相近的配比)是用途最廣的展開(kāi)劑，適于分離蒽醌甙元和蒽醌甙。

c.正丙醇-乙酸乙酯-水(4∶4∶3)和異丙醇-乙酸乙酯-水(9∶9∶4)適于分離番瀉甙和二蒽酮甙。

顯色方法主要有噴堿性試劑或醋酸鎂甲醇液、氨氣熏及在紫外燈下觀察熒光，亦可在可見(jiàn)光下直接觀察色斑。

2021/5/746

(三)升華法游離的蒽醌及其他醌類衍生物多具有升華性。中藥制劑中如含有這類成分量較大，可采用升華法得到升華物，可見(jiàn)光下觀察或加堿性試液顯色定性。2021/5/747二、蒽醌類成分的定量分析

(一)比色法

1.加堿比色法

1）游離蒽醌的測(cè)定稱取中藥制劑粉末適量，在索氏提取器中用氯仿回流提取至無(wú)色。氯仿提取液移入分液漏斗中，以5％氫氧化鈉-2％氫氧化銨混合堿液分次提取至無(wú)色，合并堿液，用少量氯仿洗滌，氯仿棄去，堿液調(diào)整至一定體積，若不澄清，可用垂熔漏斗過(guò)濾，濾液在沸水浴中加熱4分鐘，用冷水冷卻至室溫，30分鐘后在490nm處比色，以1，8-二羥基蒽醌為對(duì)照品，計(jì)算含量。

2）總蒽醌的測(cè)定稱取中藥制劑粉末適量，先用鹽酸或硫酸水解蒽醌甙。然后用非極性溶劑如氯仿提取甙元后同上法測(cè)定。3）結(jié)合蒽醌的測(cè)定

a.結(jié)合蒽醌=總蒽醌-游離蒽醌

b.極性溶劑提取蒽醌甙，水解成甙元后，用1）法測(cè)定。2021/5/748

2.醋酸鎂比色法

1）游離蒽醌的測(cè)定稱取中藥制劑粉末適量，在索氏提取器中用氯仿回流提取至無(wú)色。將氯仿提取液蒸干，殘?jiān)?.5%醋酸鎂甲醇液溶解，并定容。在498nm處比色，以1，8-二羥基蒽醌為對(duì)照品，計(jì)算含量。

2）總蒽醌的測(cè)定稱取中藥制劑粉末適量，先用鹽酸或硫酸水解蒽醌甙。然后用非極性溶劑如氯仿提取甙元后同上法測(cè)定。2021/5/749

二)薄層色譜法薄層色譜法主要用于分離測(cè)定單體蒽醌類化合物。

蒽醌類化合物的薄層色譜條件和顯色方法可參考定性分析部分。

實(shí)例當(dāng)歸龍薈丸中大黃素的測(cè)定--洗脫定量法

--TLC掃描法

(三)高效液相色譜法高效液相色譜法也主要用于分離單體蒽醌類化合物。實(shí)例黃連上清丸中大黃游離蒽醌甙元的測(cè)定P172-1732021/5/7502021/5/751第五節(jié)揮發(fā)性成分分析

概述

揮發(fā)性成分是指中藥中一類具有芳香氣并易揮發(fā)的成分，其化學(xué)組成復(fù)雜主要包括：1.揮發(fā)油類成分

2.其他分子量較小、易揮發(fā)的化合物。2021/5/752揮發(fā)油，又稱精油，為可隨水蒸汽蒸餾得到的易流動(dòng)的油狀液體，具香味和揮發(fā)性，其中有些組分的純品在常壓下為固體。許多常用中藥中都含有揮發(fā)油，中草藥中的揮發(fā)油一般在1%以下，亦有少數(shù)達(dá)10%以上，如丁香中含揮發(fā)油可高達(dá)14～21%。揮發(fā)油中所含成分相當(dāng)復(fù)雜，一種揮發(fā)油常含有幾十種到一、二百種成分，但其中往往以某種或數(shù)種成分占較大的量。2021/5/753含揮發(fā)油成分的常用中藥

厚樸：β-桉油醇、α-蒎烯、檸檬烯、醋酸龍腦酯肉桂：桂皮醛、桂皮酸、乙酸苯丙酯陳皮：檸檬烯、檸檬醛川芎：藁本內(nèi)酯、3-丁叉苯酞、香檜烯薄荷：薄荷酮、薄荷腦、乙酸薄荷酯當(dāng)歸：棕櫚酸、香荊芥酚、當(dāng)歸酮、正丁烯酜內(nèi)酯、藁本內(nèi)酯

丁香：丁香酚、水楊酸甲酯、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酰丁香酚蒼術(shù)：蒼術(shù)醇、茅術(shù)醇、蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素白術(shù)：蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇、白術(shù)內(nèi)酯2021/5/754一.結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)

結(jié)構(gòu)特征

:揮發(fā)油中成分按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類，可分為萜類化合物、脂肪族化合物及芳香族化合物。。1.主要成分——單萜、倍半萜及其含氧衍生物其中含氧的衍生物大多生物活性較強(qiáng)，并具有芳香氣味，如薄荷醇、薄荷酮、樟腦、龍腦、茴香酮、蒼術(shù)酮

2.脂肪族化合物——正庚烷、正癸烷、辛烯、異戊酸、異戊醛、甲基正壬酮等。

3.芳香族化合物——如苯丙烷類衍生物，多具有C6-C3骨架，多為苯酚化合物或其酯類，如桂皮醛、茴香腦、丁香酚

2021/5/755理化性質(zhì)

1.物理性狀：揮發(fā)油在通常情況下為具有特殊而濃烈氣味的油狀液體，多數(shù)比重小于1，沸點(diǎn)70～300℃之間；且具有強(qiáng)烈的折光性；不溶于水而易溶于大多有機(jī)溶劑中，在高濃度的乙醇中能全部溶解。2.顯色反應(yīng)：酚類成分——加三氯化鐵乙醇溶液，可產(chǎn)生藍(lán)色、藍(lán)紫色或綠色反應(yīng)

羰基化合物——加苯肼或苯肼衍生物、羥胺等試劑，可生成結(jié)晶性的衍生物

內(nèi)酯類化合物——樣品的吡啶溶液中加入亞硝酰鐵氰化鈉及氫氧化鈉溶液，出現(xiàn)紅色并逐漸消失

2021/5/756二.定性鑒別

1.化學(xué)反應(yīng)法

根據(jù)制劑中所含揮發(fā)油組分的結(jié)構(gòu)或功能基的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行鑒別萜類成分－多含有雙鍵，能與溴、氫鹵酸等起加成反應(yīng)內(nèi)酯類－與羥胺反應(yīng)生成羥污酸，與三氯化鐵呈顏色反應(yīng)注意：中藥復(fù)方制劑中成分復(fù)雜，干擾因素眾多，專屬性不強(qiáng)。2021/5/7572.薄層色譜法

揮發(fā)油成分TLC主要是根據(jù)極性大小加以分離揮發(fā)油所含各類化合物的極性順序?yàn)椋簾N（萜）＜醚＜酯＜醛、酮＜醇、酚＜酸

可試用不同極性的展開(kāi)劑在硅膠、氧化鋁薄層上將各類化合物相互分開(kāi)。最常用展開(kāi)劑－正己烷、石油醚，適于分離極性小的成分（不含氧的烴類成分）石油醚或正己烷中加少量醋酸乙酯（或苯），增大極性后，則可用于分離極性大的成分（含氧化合物）也可使用其他展開(kāi)劑－如苯、乙醚、四氯化碳、氯仿、醋酸乙酯以及不同比例的混合展開(kāi)劑。2021/5/758常用的薄層顯色劑有：茴香醛-濃硫酸試劑：與揮發(fā)油中各成分產(chǎn)生多種鮮艷的顏色。2%高錳酸鉀水溶液：在粉紅色背景產(chǎn)生黃色斑點(diǎn)時(shí)表明含不飽和化合物。熒光素-溴試劑：在長(zhǎng)波長(zhǎng)的紫外光燈下觀察，如薄層斑點(diǎn)顯黃色熒光，則表明含乙烯基化合物。

2.4-二硝基苯肼試劑：噴試劑后如產(chǎn)生黃色斑點(diǎn)表明可能含有醛或酮類化合物。2021/5/759異羥肟酸鐵試劑：噴試劑后如產(chǎn)生淡紅色斑點(diǎn)表明含有內(nèi)酯類化合物。三氯化鐵試劑：斑點(diǎn)顯藍(lán)色或綠色，含有酚性物質(zhì)0.05%溴酚藍(lán)乙醇溶液：斑點(diǎn)顯黃色表明含酸類物質(zhì)硝酸鈰銨試劑：在黃色背景上顯棕色斑點(diǎn)，表明含有醇類物質(zhì)。碘化鉀-冰醋酸-淀粉試劑：斑點(diǎn)顯藍(lán)色表明含過(guò)氧化物。

根據(jù)顯色情況，初步推測(cè)該斑點(diǎn)屬于那一類化合物注意防止假陽(yáng)性（顯色專屬性不強(qiáng)）2021/5/760TLC除硅膠、氧化鋁外，也可采用硝酸銀薄層，因?yàn)檩祁惢衔锟梢罁?jù)其雙鍵數(shù)目和位置不同與硝酸銀形成π配合物難易及穩(wěn)定性的差異，而得到分離。硝酸銀在吸附劑中含量以2.5%為宜2021/5/7613.氣相色譜法

（1）常用對(duì)照品對(duì)照法進(jìn)行定性鑒別，即在相同的色譜條件下測(cè)定供試品與對(duì)照品的保留時(shí)間，以確定某組分的存在與否。（2）也可采用加大峰面積的方法作為對(duì)已知化合物的定性鑒別一般應(yīng)在2種以上不同極性色譜柱上進(jìn)行比較，結(jié)果才較可靠（3）對(duì)于原料藥材、注射劑的鑒別還可采用GC-MS聯(lián)用，GC-FTIR聯(lián)用分析2021/5/762三.含量測(cè)定

含量測(cè)定包括總揮發(fā)油和單一成分的測(cè)定總揮發(fā)油測(cè)定：采用揮發(fā)油測(cè)定器，用蒸餾法測(cè)定，可分別測(cè)定相對(duì)密度在1.0以下和1.0以上的揮發(fā)油含量。（按藥典附錄方法）單一成分測(cè)定：首選氣相色譜法其次HPLC，TLCS,GC-MS

關(guān)鍵是分離，色譜法是揮發(fā)油成分分析的主要方法2021/5/7631.氣相色譜法

方法：一般氣相色譜閃蒸氣相色譜法頂空氣相色譜法閃蒸氣相色譜法——將樣品置閃蒸器內(nèi)，在一定溫度下，揮發(fā)性成分氣化，被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分析頂空氣相色譜——在熱力學(xué)平衡的蒸氣相與被分析樣品同時(shí)存在于一個(gè)密閉恒溫的樣品瓶中，測(cè)定恒溫后樣品瓶蒸氣相中揮發(fā)性成分的含量2021/5/764固定液——聚乙二醇類、聚酯類、硅氧烷類和阿皮松類等，大多采用極性固定液?jiǎn)屋疲簶O性固定液（沸點(diǎn)接近）倍半萜：極性、非極性固定液含氧萜類衍生物：如含醇、醛、酮、酯等揮發(fā)油類成分，極性固定液聚乙二醇和聚酯類分離效果較好2021/5/765色譜柱：石英毛細(xì)管柱

檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）定量方法：（1）測(cè)定已知成分，含量較高且分離度好，多用內(nèi)標(biāo)法（2）有未知成分，不加校正因子的歸一化法（3）外標(biāo)法準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響較大2021/5/766供試品前處理原料藥材：粉碎后，直接水蒸氣蒸餾，所得揮發(fā)油用乙醚、石油醚提取制劑：有機(jī)溶劑提取2021/5/7672.高效液相色譜法揮發(fā)性成分有些具有紫外吸收，如芳香族化合物類（桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、茴香腦等），可用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

3.薄層掃描法

主要用于定性分析，定量較少。因?yàn)閾]發(fā)油成分復(fù)雜，薄層分離困難，往往很難達(dá)到定量要求，僅用于主要成分含量高的揮發(fā)油的制劑分析；再者大多揮發(fā)油成分都需顯色后才可測(cè)定，操作復(fù)雜，引入誤差機(jī)會(huì)較多

2021/5/7684.GC-FTIR和GC-MS聯(lián)用技術(shù)氣相-紅外（GC-FTIR）和氣相-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)不但可用于揮發(fā)性成分的鑒別，而且也可以對(duì)其中成分進(jìn)行定量，具有方法簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn).

特別是在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品而需要定性未知物時(shí)，可從譜庫(kù)檢索中得到特征官能團(tuán)有價(jià)值的信息對(duì)化合物進(jìn)行定性，用歸一化法進(jìn)行百分含量計(jì)算。

2021/5/769四、常見(jiàn)揮發(fā)性成分分析

P.161薄荷醇(menthol)－GC丁香酚(eugenol)－GC龍腦(borneol)－GC,TLCS樟腦(camphor)-GC桂皮醛(cinnam-aldehyde)－GC，HPLC,TLCS桉油精(cineole)－GC丹皮酚(paeonol)-HPLC,GC,UV,TLCS

2021/5/770第六節(jié)木脂素類成分分析

概述

木脂素是一類在生物體內(nèi)由二分子苯丙素衍生物聚合而成的化合物。

常用中藥五味子、厚樸、刺五加、細(xì)辛都含有木脂素類成分，此外紫杉科紫杉屬（Taxus）、小檗科鬼臼屬（Podophyllum）及八角蓮屬(Dysosma)植物中均含有木脂素類成分。。2021/5/771一.結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)

結(jié)構(gòu)特征

:木脂素在植物體中大多為脂溶性成分，以游離形式存在，少數(shù)以苷的形式存在。分子結(jié)構(gòu)類型較多，尤其立體結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜；結(jié)構(gòu)中除均含有兩個(gè)苯環(huán)外，多數(shù)具有醇羥基、酚羥基、甲氧基、亞甲二氧基、醚環(huán)及內(nèi)酯環(huán)等含氧取代基，木脂素類的性質(zhì)主要由這些功能基所引起。2021/5/772理化性質(zhì)

1.物理性狀：木脂素大多數(shù)呈無(wú)色結(jié)晶，無(wú)揮發(fā)性，少數(shù)如去甲二氫愈創(chuàng)酸能升華。大多具有光學(xué)活性。

2.溶解性：游離的木脂素具親脂性，一般難溶于水，在石油醚中溶解度較小，易溶于苯，氯仿，乙醚、丙酮及乙醇等有機(jī)溶劑，具有酚羥基的木脂素類還可溶于苛性堿水溶液中。木脂素與糖結(jié)合成苷時(shí)親水性增加，對(duì)水的溶解性增大，可溶于甲醇、乙醇3.顯色反應(yīng)

:木脂素類沒(méi)有共有的特征顏色反應(yīng)，但對(duì)于一些非特征性試劑如磷鉬酸乙醇溶液、硫酸乙醇溶液等，不同的木脂素化合物可顯示不同的顏色，常用于薄層色譜的顯色。

2021/5/773Labat反應(yīng)－可作為具有亞甲二氧基的木脂素的特征反應(yīng)，化合物加濃硫酸，再加沒(méi)食子酸，可產(chǎn)生藍(lán)綠色。如以變色酸代替沒(méi)食子酸，并保持溫度在70-80℃，20min，可產(chǎn)生藍(lán)紫色，此反應(yīng)稱為Ecgrine反應(yīng)。4.紫外光譜特征多數(shù)木脂素的UV光譜具有苯環(huán)的特征吸收，二個(gè)取代芳環(huán)是二個(gè)孤立的發(fā)色團(tuán)，UV吸收峰位置在250—350nm之間，吸收強(qiáng)度是二者的總和，立體結(jié)構(gòu)對(duì)紫外光譜影響不大，苯環(huán)上取代基可影響峰的位置。

2021/5/774二.定性鑒別

1.化學(xué)反應(yīng)法

利用木脂素分子結(jié)構(gòu)中的功能基具有的顏色反應(yīng)進(jìn)行檢識(shí)。酚羥基－可與一些酚類試劑如三氯化鐵試劑、重氮化試劑反應(yīng)亞甲二氧基－Labat反應(yīng)和Ecgrine（變色濃硫酸試劑）反應(yīng)。2021/5/7752.色譜鑒別--薄層色譜法《中國(guó)藥典》（2005版）中凡以木脂素成分為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的，使用的方法均為薄層色譜法。木脂素類成分一般具有較強(qiáng)的親脂性，采用硅膠吸附薄層色譜可獲得較好的分離效果。，展開(kāi)劑：一般采用親脂性的溶劑

如苯、氯仿、氯仿:甲醇（9:1）、氯仿:乙酸乙酯（9:1）、氯仿:二氯甲烷（9:1）和乙酸乙酯:甲醇（95:5）等系統(tǒng)。

2021/5/776藥典收載的顯色方法大多用香草醛試劑和10％濃硫酸試劑,110℃加熱5min，除此之外還可用5％～10％磷鉬酸乙醇液、碘蒸氣熏后呈黃棕色或置紫外燈下觀察熒光。

2021/5/777供試液制備－一般利用其親脂性用低極性有機(jī)溶劑（如氯仿、乙醚等）提取，用優(yōu)點(diǎn)雜質(zhì)較少，但提取率較低用乙醇、丙酮等極性較大的溶劑，提取率提高，但提出的雜質(zhì)較多需凈化。可利用待測(cè)成分的特點(diǎn)凈化，如結(jié)構(gòu)中有酚羥基、羧基等，用氫氧化鈉溶液萃取，與其他親脂性成分分離；還可以用色譜法，如吸附柱色譜法，用低極性有機(jī)溶劑將木脂素類洗脫下，制備供試液。

除去油脂類成分：先乙醚/石油醚提取再氯仿除去水溶性成分：上大孔樹(shù)脂，先水及低濃度乙醇洗去水溶性雜質(zhì)，再高濃度乙醇洗脫待測(cè)成分2021/5/778三.含量測(cè)定

含量測(cè)定包括總木脂素成分和單體木脂素成分的測(cè)定1.總木脂素成分含量測(cè)定可采用變色酸比色法、二階導(dǎo)數(shù)光譜法及柱色譜—比色法等。變色酸比色法－根據(jù)某些木脂素成分，其結(jié)構(gòu)中亞甲二氧基與變色酸/濃硫酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色進(jìn)行比色測(cè)定含量本方法要求供試液純度較高。2021/5/7792.單體木脂素成分的含量測(cè)定－色譜法單體木脂素成分由于母核類型不同，所含功能基不同，使得它們之間有較大差異，利用這些差異可選用適宜的方法對(duì)單體木脂素成分進(jìn)行分離和含量測(cè)定。分析方法有：高效液相色譜法薄層色譜法分光光度法2021/5/780高效液相色譜法（RP-HPLC）：固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠流動(dòng)相：乙腈-水或甲醇-水系統(tǒng)檢測(cè)器：大多用紫外檢測(cè)器（UVD）

薄層掃描法

一般吸附色譜法。以硅膠為吸附劑，低極性有機(jī)溶劑展開(kāi)，由于木脂素類均有紫外吸收，可直接測(cè)定吸收度。分光光度法需對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，如用化學(xué)方法、柱色譜法及薄層色譜法等分離技術(shù)，以排除共存雜質(zhì)的干擾。較少使用。2021/5/781四、常見(jiàn)木脂素成分的分析

P.166連翹苷

(Phillyrin)－HPLC,TLCS牛蒡苷

(Arctiin)－HPLC,TLCS厚樸酚

(Magnolol)－HPLC,GC,TLCS,UV五味子甲素

(Deoxyschizard)–HPLC,TLCS2021/5/782第七節(jié)其他類型成分分析

一.有機(jī)酸類成分分析

二.

環(huán)烯醚萜類成分分析

三.香豆素類成分分析

四.單萜及二萜類成分分析

五.多糖類成分分析

2021/5/783一.有機(jī)酸類成分分析1.概述

（1）分類：按結(jié)構(gòu)可分為三類，即脂肪族類、芳香族類和萜類。按羧基數(shù)目可分為單羧基酸、二羧基酸和三羧基酸。（2）性質(zhì)：有機(jī)酸具有一般羧酸的性質(zhì)8個(gè)碳以下低級(jí)脂肪酸及不飽和脂肪酸常溫時(shí)多為液體，脂肪二羧酸、三羧酸等則為固體化合物芳酸類大都為固體化合物。溶解性：分子量是小的脂肪酸易溶于水，芳酸類易溶于有機(jī)溶劑而難溶于水。有些有機(jī)酸具有揮發(fā)性，能隨水蒸氣一起蒸出。

2021/5/7842.供試液制備有機(jī)酸的提取分離可采用有機(jī)溶劑提取法、離子交換法和水蒸氣蒸餾法。（1）有機(jī)溶劑提取法：由于游離的有機(jī)酸（分子量小的例外）易溶于有機(jī)溶劑，而難溶于水，有機(jī)酸鹽則易溶于水而難溶于有機(jī)溶劑.

故一般可先酸化使有機(jī)酸游離，然后選用合適的有機(jī)溶劑提取。

或者：先用堿水提取，再調(diào)pH至酸性，用有機(jī)溶劑萃取

2021/5/785（2）離子交換法：將樣品溶液通過(guò)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，以除去堿性物質(zhì)，而中性、酸性物質(zhì)則通過(guò)樹(shù)脂流出，再將流出液通過(guò)強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，有機(jī)酸離子即被交換在樹(shù)脂上，糖和其他中性物質(zhì)可流出樹(shù)脂而被除去，將樹(shù)脂用水洗凈后，用稀酸或稀堿溶液即可將有機(jī)酸從柱上洗下。

（3）水蒸氣蒸餾法：某些揮發(fā)性的低級(jí)脂肪酸或芳香酸可用此法直接提取。

2021/5/7863.定性鑒別

-TLC可用吸附薄層或分配薄層，吸附薄層：常用的吸附劑有硅膠、聚酰胺等，采用極性較大的展開(kāi)劑。

為防有機(jī)酸展開(kāi)過(guò)程中發(fā)生離解，常在展開(kāi)劑中加入一定比例的甲酸或乙酸等以消除因解離而產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。常用的顯色劑有pH指示劑，如溴甲酚綠、溴甲酚紫、溴酚蘭，磷鉬酸試劑等。具有熒光的物質(zhì)如綠原酸、阿魏酸等，可不必顯色，在熒光燈下觀察熒光。

2021/5/7874.含量測(cè)定

（1）酸堿滴定法——適合于總有機(jī)酸類成分測(cè)定

中藥中有機(jī)酸類成分酸性弱，在水溶液中滴定突躍不明顯，可用非水溶液滴定法。滴定液顏色較深時(shí)，影響觀察滴定終點(diǎn)，采用電位法指示終點(diǎn)。

（2）高效液相色譜法——單體成分

芳香族酸類和其他具有紫外吸收的酸類，可用HPLC-UVD法進(jìn)行測(cè)定，如綠原酸、沒(méi)食子酸、桂皮酸、丹參素、阿魏酸等。

脂肪酸類、萜類等一些不具有紫外吸收的酸類物質(zhì)可用

HPLC-ELSD法進(jìn)行測(cè)定，如熊果酸、齊墩果酸等2021/5/788(3)薄層掃描法——單體成分脂肪酸類、萜類等一些不具有紫外吸收的酸類物質(zhì)可用薄層色譜分離，再選用合適的顯色劑，顯色后測(cè)定。脂肪酸類如蘋果酸、丁二酸、丙二酸、枸櫞酸、酒石酸可用溴酚蘭、溴甲酚綠等pH指示劑為顯色劑；萜類物質(zhì)如熊果酸、齊墩果酸可用硫酸乙醇、磷鉬酸試劑等為顯色劑。可產(chǎn)生熒光的化合物可用薄層分離后用熒光法測(cè)定，如阿魏酸、綠原酸等化合物。

2021/5/789（4）分光光度法－現(xiàn)較少用

采用單波長(zhǎng)法、雙波長(zhǎng)法、導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定有機(jī)酸的含量；也可加顯色劑顯色后再進(jìn)行測(cè)定（如齊墩果酸可用香草醛-冰醋酸顯色），或用薄層、柱層分離后再進(jìn)行測(cè)定。（5）其他定量方法－較少用沒(méi)有紫外吸收的化合物，可用超臨界流體色譜法，如用超臨界液體色譜法測(cè)定齊墩果酸的含量；也可用高效毛細(xì)管電泳法，如用高效毛細(xì)管電泳法（電導(dǎo)檢測(cè)器）測(cè)定檸檬酸、蘋果酸的含量；有些化合物可用衍生化法使生成具有揮發(fā)性的化學(xué)衍生物，用氣相色譜法測(cè)定，2021/5/7905.常見(jiàn)有機(jī)酸類成分分析

綠原酸(chlorogenicacid)

－HPLC，TLCS，UV

阿魏酸(ferulicacid)－HPLC，TLCS

齊墩果酸(oleanolicacid)－HPLC，TLCS

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