化學(xué)發(fā)光免疫測定

發(fā)光(fāɡuānɡ)免疫分析法

LuminescenceImmunoassay精品資料一．概論免疫性是動(dòng)物在長期進(jìn)化過程中逐漸發(fā)展起來的防御感染和維護(hù)機(jī)體完整性的十分有效而靈巧的手段。免疫系統(tǒng)的特殊功能是識(shí)別“自我”和“非自我”的物質(zhì)，對(duì)自身的物質(zhì)不起反應(yīng)，而對(duì)外源的及體內(nèi)改變了的物質(zhì)則能起專一(zhuānyī)的免疫反應(yīng)，排除其對(duì)機(jī)體的危害。另一方面，免疫系統(tǒng)還擔(dān)負(fù)著維持機(jī)體免疫狀態(tài)的自身穩(wěn)定性，以清除體內(nèi)衰老和突變的細(xì)胞。精品資料1．抗體和抗原（Antigen,Antibody）免疫學(xué)的重要對(duì)象是抗原和抗體的反應(yīng)問題(wèntí)。抗原是一種外來物質(zhì)，當(dāng)其進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)能引起抗體的產(chǎn)生，并能和抗體反應(yīng)的物質(zhì)?？贵w(antibody.Ab)與抗原(antigen.Ag)的結(jié)合具有極高的專一性和親合性。不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但能和適當(dāng)抗體起反應(yīng)，即有免疫反應(yīng)性的簡單分子稱為半抗原。

精品資料（1）抗原蛋白質(zhì)，多糖(duōtánɡ)，核酸，合成多肽，低分子物質(zhì)（2）抗體抗體是一種蛋白質(zhì)（主要是γ-球蛋白質(zhì)）血清蛋白質(zhì)在自由電泳場中白蛋白α-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白抗體存在于β-球蛋白和γ-球蛋白內(nèi)這些蛋白質(zhì)稱為免疫球蛋白IgM.IgA.IgG.IgD和IgEγM.γA.γG.γD.γE精品資料2.放射性免疫分析（RIA）1959Berson和Yallow將免疫反應(yīng)與分析化學(xué)相結(jié)合創(chuàng)立了放射性免疫分析法。荷爾蒙的測定先將荷爾蒙注入天竺鼠體內(nèi)對(duì)抗此抗原的抗體(kàngtǐ)（Ab）Ag*+Ab===Ag*-Ab要測定一病人的血清標(biāo)本中荷爾蒙的濃度，Ag+Ag*-Ab===Ag-Ab+Ag*(+Ag*-Ab)測定Ag*，可計(jì)算標(biāo)本中所含有的荷爾蒙（Ag）濃度1977獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎(jiǎng)精品資料分析對(duì)象：測量含量很低的生物活性化合物：如蛋白質(zhì)（酶，接受體，抗體）激素（甾族化合物，甲狀腺激素，酞激素）藥物及微生物等。優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，靈敏度高缺點(diǎn)：①放射性同位素可能損害(sǔnhài)人們的身體健康，以致于實(shí)驗(yàn)室要有特殊防護(hù)技術(shù)②該法還需要用貴重的閃爍計(jì)數(shù)器和試劑③穩(wěn)定性-同位素的壽命相對(duì)較短

精品資料3酶免疫(miǎnyì)分析法用酶標(biāo)記抗原或抗體例：酶聯(lián)免疫法測定氯霉素微量反應(yīng)板——羊抗兔IgG抗體兔抗氯霉素抗體+氯霉素酶結(jié)合物+氯霉素樣品沒有結(jié)合的酶結(jié)合物被洗去，再向相應(yīng)孔中加入過氧化氫和鄰苯二胺，作用一定時(shí)間后，結(jié)合后的酶結(jié)合物將無色的鄰苯二胺轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物，加入終止液后顏色由藍(lán)變黃，用波長450nm（雙波長時(shí)最適參考波長≥600nm）酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中氯霉素含量成反比。酶不穩(wěn)定(wěndìng)、光度分析線性范圍窄

精品資料競爭(jìngzhēng)型酶聯(lián)免疫法測定氯霉素含量示意圖精品資料4.發(fā)光免疫分析法熒光免疫分析法化學(xué)發(fā)光免疫分析法以熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)物質(zhì)作為標(biāo)記物。優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)靈敏度高穩(wěn)定性好，可避免放射性污染標(biāo)記物不同，因而(yīnér)檢測方法也不同精品資料二．熒光(yíngguāng)免疫分析法FluonescenseImmuuoassay1．熒光(yíngguāng)探針（1）

一般要求a檢測最常遇到的樣品為血清，它有很高的熒光(yíngguāng)背景。

血清蛋白λem325-350nm(λex280nm)血清中NADH和膽紅素430-470nm(λex330-360nm)探針λem>500nm精品資料b.熒光探針的斯托克斯位移〉50nmc.熒光探針的摩爾吸光系數(shù)要大熒光產(chǎn)率應(yīng)盡可能高d.熒光探針要穩(wěn)定，且聯(lián)結(jié)于抗體或抗原時(shí)不應(yīng)損害(sǔnhài)它們的活性e.熒光探針的激發(fā)波長應(yīng)位于可見光區(qū)，因?yàn)檩^長波長處熒光雜質(zhì)較少λex應(yīng)位于vis區(qū)精品資料(2)有機(jī)探針

熒光黃常用的探針熒光產(chǎn)率高，有較好的光穩(wěn)定性和低的溫度系數(shù)。其缺點(diǎn)是斯托克斯位移較小。在堿性的條件下，熒光黃與免疫球蛋白IgG的自由氨基起反應(yīng)(fǎnyìng).

羅丹明類化合物廣泛用來標(biāo)記抗體和熒光黃相比，其熒光產(chǎn)率不如熒光黃，可是其發(fā)射波長較長，樣品背景干擾較少。此外，羅丹明類亦常作為能量轉(zhuǎn)移的接受體。精品資料(3)

金屬(jīnshǔ)螯合物某些稀土金屬(jīnshǔ)離子會(huì)與某些配位體生成會(huì)發(fā)強(qiáng)熒光的配合物。如：Eu(Ⅲ),Tb(Ⅲ),Nd(Ⅲ)與β-二酮衍生物對(duì)-氨基甲酰三氟丙酮聚氨羧酯鹽鄰菲羅啉

稀土金屬(jīnshǔ)離子配合物lifetime50~1000s熒光背景103~106倍

精品資料2．熒光免疫檢測法的類型（1）均質(zhì)檢測法均質(zhì)檢測法不需要分離步驟，方法簡便快速，但它常受到來自背景（血清）的干擾，該法系根據(jù)已標(biāo)記抗原聯(lián)接于抗體時(shí)發(fā)生已標(biāo)記抗原熒光性質(zhì)(xìngzhì)的改變。通常將均質(zhì)檢驗(yàn)法分為：

熒光增強(qiáng)法熒光猝滅法間接猝滅法熒光激發(fā)轉(zhuǎn)移水解法熒光偏振法精品資料a．熒光增強(qiáng)法本法基于當(dāng)標(biāo)記物的抗原(kàngyuán)聯(lián)接于抗體時(shí)原標(biāo)記的抗原(kàngyuán)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。b．熒光猝滅法當(dāng)被標(biāo)記的抗原(kàngyuán)聯(lián)接到抗體時(shí)熒光的量子產(chǎn)率下降，例如慶大霉素的測定，將限量的抗體加入一已被標(biāo)記和未標(biāo)記的慶大霉素混合物中，熒光猝滅程度與慶大霉素量相關(guān)。c.間接猝滅法

精品資料d.熒光激發(fā)轉(zhuǎn)移如熒光黃作為給予體，羅丹明作為接受體，熒光黃的熒光與羅丹明的吸收光譜重疊，后者可吸收前者的熒光。例：嗎啡的測定i)用熒光黃（F）標(biāo)記抗原(kàngyuán)羅丹明（R）標(biāo)記抗體Ag+AgF+AbR(Ag-AbR)+(AgF-AbR)Ag的存在減少了熒光的猝滅程度

精品資料ii)抗體既是給予(jǐyǔ)體又是接受體Ag+AbF+AbRAbF-Ag-AbRe.水解法精品資料2）非均質(zhì)檢測法非均質(zhì)檢測法在檢測之前，必須進(jìn)行分離。既游離的已標(biāo)記的抗原(kàngyuán)必須從聯(lián)接于抗體的抗原(kàngyuán)中分離出來，或者未聯(lián)接的已標(biāo)記的抗體從抗原(kàngyuán)聯(lián)接的部分分離出來。其分離可通過離心沉降，或固相聯(lián)接抗原(kàngyuán)（或抗體）來實(shí)現(xiàn)。固相型檢測法包括競爭性和非競爭性反應(yīng)的標(biāo)記抗原(kàngyuán)或抗體

抗原(kàngyuán)聯(lián)接于聚合物表面-----免疫吸附劑

精品資料

時(shí)間分辨熒光法消除樣品背景干擾(gānrǎo)的另一種方法是時(shí)間分辨熒光法。樣品背景的熒光壽命一般為10ns，而鑭系鰲合物的熒光壽命一般為10-100μs。且斯托克斯位移較大，很適用于時(shí)間分辨法進(jìn)行測定。精品資料精品資料時(shí)間(shíjiān)分辨熒光免疫原理圖

（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）精品資料精品資料熒光(yíngguāng)免疫分析法優(yōu)點(diǎn)：

消除放射性同位素的污染

穩(wěn)定性較好缺點(diǎn)：高的背景光，限制了靈敏度干擾測定精品資料三．化學(xué)發(fā)光免疫分析法這種分析方法既有發(fā)光檢測(jiǎncè)的高靈敏度，又有免疫分析法的特異性。1．主要發(fā)光體系

魯米諾，異魯米諾及其衍生物焦焙酚光澤精吖啶酯1，2-雙氧基化合物過氧化草酸酯

螢火蟲發(fā)光體系細(xì)菌發(fā)光體系精品資料2.發(fā)光標(biāo)記物（1）發(fā)光反應(yīng)中消耗掉的標(biāo)記物a．Luminol及其衍生物L(fēng)uminol偶聯(lián)于配體后，其發(fā)光效率較低Isoluminol及其衍生物被廣泛應(yīng)用

Luminol的氨基取代導(dǎo)致Ф降低(jiàngdī)Isoluminol的氨基取代導(dǎo)致Ф增加

此類標(biāo)記可用于各種分析物，但CL需催化劑，因此有較高的背景信號(hào)。精品資料精品資料b．吖啶酯類不需要催化劑

優(yōu)點(diǎn)：高量子產(chǎn)率，低背景信號(hào)和易于與蛋白質(zhì)連接，主要用于標(biāo)記半抗原和蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：光發(fā)射是瞬時(shí)的c．過氧化草酸酯優(yōu)點(diǎn)：靈活性缺點(diǎn)：過氧化草酸酯水溶性較差，極易水解(shuǐjiě)。二氧雜四元環(huán)酮延長的光發(fā)射、低背景、寬的線性范圍精品資料（2）不起發(fā)光反應(yīng)的標(biāo)記物這類標(biāo)記物在發(fā)光過程中不被消耗，反應(yīng)過程中起催化作用的物質(zhì)。a．過氧化物酶（peroxidase,POD）Luminol+H2O2—用POD標(biāo)記分析物b．蟲熒光素酶，細(xì)菌熒光素酶酶成本昂貴，不穩(wěn)定，熒光酶基因(jīyīn)的制造c．熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物熒光素，丹璜酰氯，熒光胺，羅丹明精品資料（3）酶標(biāo)記物GOD和G-6-PDH利用某些酶作為(zuòwéi)標(biāo)記物，然后通過標(biāo)記的酶催化生成的產(chǎn)物，再作用于發(fā)光物質(zhì)，以產(chǎn)生生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。葡萄糖

（4）固相法發(fā)光免疫分析它不需要離心處理，操作簡便，精確度高，所用固相支持物主要有聚苯乙烯制的管和球精品資料競爭法：（檢查小分子抗原多采用）啟動(dòng)發(fā)光(fāɡuānɡ)試劑Ag+Ag-L+AbAg-Ab+Ab-Ag-L—————h精品資料夾心(jiāxīn)法：（檢查大分子抗原多采用）

Sp-Ab+AgSp-Ab-AgSp-Ab-Ag+Ab-LSp-Ab-Ag-Ab—啟動(dòng)發(fā)光試劑———hv其中:L為發(fā)光標(biāo)記物或發(fā)光底物,Ag為抗原,Ab為抗體,Sp為固相。精品資料精品資料精品資料ACS180由德國拜耳公司生產(chǎn)，商品名為ACS180全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(xìtǒng)有ACS180Plus和ACS180sE等型號(hào),2000年又推出新—代的ADVIACentaur免疫測定系統(tǒng)(xìtǒng)吖啶酯可通過化學(xué)反應(yīng)直接標(biāo)記抗體或抗原當(dāng)在堿性介質(zhì)中氧化時(shí)，經(jīng)過一個(gè)二氧酮的中間體，產(chǎn)生一個(gè)電激發(fā)的10一甲基吖啶酮，當(dāng)它回復(fù)到基態(tài)時(shí)釋放出光子精品資料精品資料精品資料模塊化組合分析系統(tǒng)(xìtǒng)<E>精品資料Elesys(10102010E-170)瑞士羅氏公司(Roche)的ElecsysECLIA系統(tǒng)，綜合了各種先進(jìn)技術(shù)，具有獨(dú)特的優(yōu)越性，是目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用的唯一的電化學(xué)發(fā)光免疫測定儀器這三臺(tái)檢測系統(tǒng)均應(yīng)用了電化學(xué)發(fā)光免疫測定及有關(guān)先進(jìn)技術(shù)，其測試的靈敏度和特異性相同，有完善(wánshàn)的使用說明，試劑通用，操作也有相同之處。儀器設(shè)計(jì)上有一些差異，主要不同在于工作量的差別精品資料精品資料精品資料精品資料3化學(xué)生物(shēngwù)發(fā)光免疫分析法的特點(diǎn)（1）優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度寬的線性范圍分析速度快高選擇性高穩(wěn)定性花費(fèi)少所用試劑無毒消除放射性同位素的污染。

精品資料（2）缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性方面存在一定問題發(fā)光免疫測定是一種瞬時(shí)的化學(xué)反