SDS-PAGE電泳技術(shù)的應(yīng)用

SDS電泳技術(shù)的應(yīng)用

姓名：崔光彩學(xué)號(hào)：PAGE合成原理濃縮膠與分離膠連續(xù)電泳系統(tǒng)和不連續(xù)電泳系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)原理分析計(jì)算相關(guān)函數(shù)：參考論文聚丙烯酰胺凝膠的合成原理聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)試劑N,N′-甲叉雙丙烯酰胺在有引發(fā)劑和增速劑的情況下聚合而成的。丙烯酰胺的單體形成長(zhǎng)鏈，由N,N′-甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團(tuán)和鏈末端的自由功能基團(tuán)反應(yīng)而交聯(lián)。1Copolymerizationofacrylamidewithmethylenebisacrylamide單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過硫酸銨(AP)的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠濃縮膠與分離膠a.濃縮膠濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子最快（先行離子），甘氨酸根離子最慢（隨后離子），蛋白質(zhì)居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)（高電位梯度區(qū)），而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。（濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、較弱的分子篩效應(yīng)）2b.分離膠又稱電泳膠，通常孔徑較小，通過選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好的分離。分離膠又可分為均一膠和梯度膠。（分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)）連續(xù)電泳系統(tǒng)和不連續(xù)電泳系統(tǒng)a.連續(xù)系統(tǒng)：電泳系統(tǒng)使用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)（樣品緩沖液、凝膠緩沖液、電極緩沖液），且PH值恒定，只是離子強(qiáng)度不同的區(qū)帶電泳。加樣時(shí)必須加成很小的一條帶，分辨率不高，但易配制。b.不連續(xù)系統(tǒng)：使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳。由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先縮成一窄帶，然后再在一定濃度(或一定濃度梯度)的分離膠上進(jìn)行分離。由于不同孔徑凝膠的分子篩作用，使不連續(xù)電泳的分辨率大大高于連續(xù)電泳。3實(shí)驗(yàn)原理：在電場(chǎng)的作用下，帶電粒子能在聚丙烯凝膠中遷移，其遷移速度與帶電粒子的大小、構(gòu)型和所帶的電荷有關(guān)。十二烷基磺酸鈉（SDS）能與蛋白質(zhì)的結(jié)合，改變蛋白質(zhì)原有的構(gòu)象，使其變成近似于雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒，其短軸長(zhǎng)度一樣，而長(zhǎng)軸與分子量大小成正比。在SDS中，SDS-復(fù)合物的遷移率不再受蛋白的電荷和形狀的影響，而只與蛋白質(zhì)的分子量正相關(guān)。4分析計(jì)算：在一定濃度的凝膠中，由于分子篩效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)分子量在15kD～200kD

的范圍內(nèi)，電泳遷移與分子量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系，用此法可根據(jù)已知分子量白質(zhì)的電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得分子量。同時(shí)也可根據(jù)不同分離級(jí)分的蛋白條帶的多少來判定分離純化產(chǎn)物的純度。5相關(guān)函數(shù)：1）分子量計(jì)算

logMW=K·bxMW:分子量

K、b：常數(shù)

X:遷移率62）遷移率計(jì)算

m=m:遷移率

d：譜帶移動(dòng)距離

l:凝膠有效長(zhǎng)度

v:電壓參考論文《藏北3種裸鯉同工酶的電泳分析及物種分化的探討》目的：對(duì)藏北高原3種裸鯉的乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和脂酶(EST)進(jìn)行電泳分析研究其物種分化7電泳結(jié)果電泳結(jié)果分析表明，色林錯(cuò)裸鯉(G．