DNA中5-羥甲基胞嘧啶圖譜測定及在臨床中的應用

DNA中5-羥甲基胞嘧啶圖譜測定及在臨床中的應用技術(shù)參數(shù)名稱：5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測定和分析技術(shù)名稱：nano-hmC-Seal，來源于芝加哥大學何川教授實驗室DNA用量：1ng~1ug（具體情況會根據(jù)5hmC在該物種中的含量進行小范圍調(diào)整）測序策略：NextSeq500/HiseqX10，PE38/PE150數(shù)據(jù)量：平均1.5G/6G，讀段數(shù)量2千萬以上周期：少量樣本（<10）25個工作日給出基本解讀分析；批量樣品根據(jù)實驗要求協(xié)商數(shù)據(jù)循環(huán)周期。服務范圍各類物種或者其他來源DNA中的5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜繪制和對比分析；各類腫瘤臨床研究，包括腫瘤標記物的尋找、組織活檢、液體活檢、術(shù)后監(jiān)控和用藥指導的研究；專業(yè)人員輔助實驗設計，定制個性化的5-羥甲基胞嘧啶科研方案；技術(shù)背景簡介5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）是5-甲基胞嘧啶（5mC）的主動去甲基化過程中的重要中間產(chǎn)物，被稱為“第六種DNA堿基”。2009年兩篇science文章發(fā)現(xiàn)了TET酶可以將5mC氧化成5hmC并在生理上發(fā)揮著重要的作用，5hmC也迅速成為科研的熱點。在接下來的幾年中，科學家發(fā)現(xiàn)5hmC和5mC一樣，是一種重要的表觀遺傳修飾。5hmC的基因分布可以精準對應基因活性調(diào)控，比5mC更加動態(tài)靈敏地反應基因表達狀態(tài)。2012年時，《Cell》雜志就有文章報道羥甲基胞嘧啶與黑色素瘤之間的緊密關(guān)系(Lianetal.,2012)。隨后又有多篇有影響力的學術(shù)文章進一步驗證了羥甲基胞嘧啶作為細胞發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤以及心血管疾病等的標記物。同表觀遺傳修飾5mC一樣，結(jié)合高通量測序的方法繪制特定情形下5hmC在全基因組上的基因圖譜顯得尤為重要。通過了解DNA中羥甲基化胞嘧啶在基因組上的分布，可以對應分析基因組的調(diào)控信息。我們的DNA羥甲基化檢測技術(shù)原理來自于2011年美國芝加哥大學何川教授發(fā)表在NatureBiotechnology的專利技術(shù)(Songetal.,2011)。該技術(shù)是利用糖基轉(zhuǎn)移酶的作用將含有疊氮基團的葡萄糖特異性的共價標記到片段化DNA的5hmC上，然后再通過高效的點擊化學反應接上biotin進行可實現(xiàn)高效的富集并構(gòu)建DNA文庫；利用高通量測序并比對分析的方法即可以獲得5hmC在基因組上的分布情況。對于抗體富集的方法，該方法的富集效率更高，5hmC的基因圖譜更加精確。2016年，何川教授實驗室對該技術(shù)細節(jié)進行了優(yōu)化，其nano-hmC-Seal的技術(shù)可檢測低至1000個細胞基因組中的5hmC修飾分布情況(Hanetal.,2016)。他們利用該技術(shù)檢測白血病模式小鼠中造血干細胞的5hmC圖譜，發(fā)現(xiàn)5hmC分布在白血病樣品與野生型樣品中有顯著差異，并獲得了不同類型造血干細胞中的羥甲基化差異性區(qū)域的序列特征（如下圖所示）?；趎ano-hmC-Seal技術(shù)，我們實現(xiàn)了5hmC標記并富集等流程的標準化操作，具有極高的靈敏度，精準穩(wěn)定的檢測來源更為廣泛的DNA樣本：1），從DNA使用量上看，該技術(shù)可操作低至1ng的游離核酸，高至1ug的組織樣本DNA；2），結(jié)合高通量測序，該技術(shù)可以分析任意物種中含有5hmC修飾的DNA樣本，進而分析其生理調(diào)控機制。服務特色該技術(shù)檢測靈敏度極高，樣品收集方便，起始樣本量少；標準化流程操作，避免因操作造成的偏差；表觀遺傳新領域，全基因組比對，獲取全基因組的羥甲基化分布，信息量大；根據(jù)個性化科研方案提供專業(yè)的且具有特色的數(shù)據(jù)分析，滿足發(fā)表文章的要求。技術(shù)開發(fā)流程采集樣本-運輸質(zhì)檢-提取DNA-文庫構(gòu)建-5hmC富集擴增-質(zhì)控測序-數(shù)據(jù)解讀-數(shù)據(jù)報告并反饋數(shù)據(jù)分析基本解讀：測序數(shù)據(jù)比對至基因組，給出樣本在基因區(qū)域的羥甲基化含量分布深度解讀：在對照組與實驗組之間進行統(tǒng)計分析，找出羥甲基化含量分布的顯著差異，出具報告輔助臨床診斷與治療。樣本要求人：8ml外周血或者相關(guān)組織樣品，及其相關(guān)臨床資料（性別、年齡、基本診斷等，作為臨床分析用）；其他物種：組織樣品DNA或者較大量的血液。臨床應用舉例1、DNA的5-羥甲基胞嘧啶修飾在結(jié)直腸癌液體活檢中的研究應用。為了尋找5hmC作為結(jié)腸癌臨床診斷中的潛在價值，我們分析比較結(jié)直腸癌患者和健康志愿者的細胞游離DNA（cfDNA）中5hmC的含量分布并嘗試尋找腫瘤標記物。我們基于改進的nano-hmC-Seal技術(shù)對53名健康志愿者和38名結(jié)直腸癌患者的血漿樣品中cfDNA進行5hmC修飾分布的檢測。這些生物樣品收集后被分成兩批，在第一批樣品中分析尋找癌患和健康人之間具有顯著性差異的5hmC基因位點并進行回歸模型構(gòu)建，并在第二批樣品中進行效果驗證。最后我們也分析通過判定的分數(shù)對于癌癥病理分期和預后效果的相關(guān)性進行一定的研究。第一批樣品中有14例癌癥和18例正常對照，第二批樣品有24例癌癥和35例正常對照。在第一批樣品的cfDNA中，通過對比健康對照組和癌癥組樣品中5hmC的基因圖譜差異，我們分析出7,976個有顯著差異性的5hmC基因位點，將這些差異性位點中5hmC升高和降低最多的各前50個位點用來進行分層聚類分析，可以有效地把第二批樣品中的癌癥和健康個體分離開來（如圖A）。與傳統(tǒng)生物標記進行比較，包括癌胚抗原CEA，糖類抗原724，和糖類抗原125，cfDNA中基于5hmC分布的腫瘤標記物在腫瘤診斷上明顯有更高的靈敏性和特異性（5hmC診斷有92%的靈敏度，而傳統(tǒng)生物標記的綜合靈敏度只有45.7%）。這樣的結(jié)果已經(jīng)接近于金標準腸鏡的檢測效果。A.我們進一步利用這些5hmC差異性位點進行分析，建立回歸模型，對第二批樣品做癌癥分類，并生成受試者工作特征曲線（ROC）。在第二批樣品的病人分類中，這種預測算法達到了92%靈敏度和86%的特異性（曲線下面積AUC=0.96）（如圖B左）。B.最后，利用回歸模型對所有的癌癥術(shù)前樣品和兩例癌癥術(shù)后樣品進行分數(shù)判定，以0.5為閾值的情況下，我們結(jié)合判分和癌癥樣品的病理分期進行作圖（圖B右），發(fā)現(xiàn)隨著病理分期的發(fā)展（I~III期），該模型給出的結(jié)果基本上呈正相關(guān)趨勢，IV期樣本由于癌細胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，其腸癌細胞的特性已經(jīng)發(fā)生改變因而無法準確判分。意料之中的是經(jīng)過手術(shù)且腸鏡診斷未復發(fā)的患者樣品也同樣判定為健康狀態(tài)。這些結(jié)果說明通過血液中5hmC的腫瘤標記物篩查，我們可以高選擇性高靈敏性的分出腸癌患者和健康患者，并且對于癌癥患者的預后和復發(fā)監(jiān)控，該回歸模型能給出明確的指導。2、5-羥甲基胞嘧啶在結(jié)直腸癌組織樣品中的DNA修飾差異研究。為了進一步研究癌癥組織與健康組織的差異，我們獲取了配對的癌癥組織和癌旁組織并進行了5hmC的基因圖譜檢測。結(jié)果如圖C，由顯著性差異的位點做聚類分析形成的熱圖清晰的顯示了結(jié)直腸癌癌癥組織與癌旁組織中的基因表達調(diào)控的差異。這些結(jié)果對于后續(xù)研究中進一步揭示癌癥的發(fā)生、發(fā)展機制和癌癥治療提供了鋪墊。C.參考資料Han,D.,Lu,X.,Shih,A.H.,Nie,J.,You,Q.,Xu,M.M.,...He,C.(2016).AHighlySensitiveandRobustMethodforGenome-wide5hmCProfilingofRareCellPopulations.Mol.Cell,63(4),711-719.doi:10.1016/j.molcel.2016.06.028Lian,C.G.,Xu,Y.,Ceol,C.,Wu,F.,Larson,A.,Dresser,K.,...Shi,Y.G.(2012).Lossof5-hydroxymethylcytosineisanepigenetichallmarkofmelanoma.Cell,150(6),1135-1146.doi:10.1016/j.cell.2012.07.033Song,C.X.,Szulwach,K.E.,Fu,Y.,Dai,Q.,Yi,C.,Li,X.,...He,C.(2011).Selectivechemicallabelingrevealsthegenome-widedistributionof5-hydroxymethylcytosine.NatBiotechnol,29(1),68-72.doi:10.1038/nbt.1732附件：樣品送樣標準(1)血液樣品：使用cfDTM游離核酸采血管或者DNAstreck游離核酸采血管進行血樣收集，常溫保存運輸并且于采血后72小時內(nèi)送至我司進行樣品處理。（2）血漿樣品：常規(guī)采血管收集的血液樣品在4小時內(nèi)進行處理獲得血漿。血漿顏色為淡黃色，不存在溶血的情況。血漿獲取的具體處理方法見下：1）將采血管在4度使用1350g轉(zhuǎn)速離心12分鐘，分離上層血漿于2mL離心管中；2）