酶工程酶的發(fā)酵生產(chǎn)

第二章酶的發(fā)酵生產(chǎn)第一頁，共五十頁。酶的發(fā)酵生產(chǎn)第一節(jié)酶生物合成的基本理論第二節(jié)酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物第三節(jié)發(fā)酵工藝條件及控制第四節(jié)酶發(fā)酵動力學(xué)第五節(jié)動植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)酶第二頁，共五十頁。第一節(jié)酶生物合成的基本理論一、RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄二、蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯三、酶生物合成的調(diào)節(jié)第三頁，共五十頁。一、RNA的生物合成—轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄速度表達式?第四頁，共五十頁。二、蛋白質(zhì)的生物合成—翻譯翻譯：以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA，酶和輔助因子的作用，合成多肽的過程。四個階段1、氨基酸活化生成氨酰－tRNA2、肽鏈合成的起始3、肽鏈的延伸4、肽鏈合成的終止思考:密碼子偏愛性與翻譯速率?第五頁，共五十頁。第二節(jié)酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物

（酶的生產(chǎn)菌種）一、產(chǎn)酶菌種的要求二、常用的產(chǎn)酶微生物三、利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點四、高純菌種的獲取第六頁，共五十頁。一、產(chǎn)酶菌種的要求1、發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高；2、容易培養(yǎng)和管理；3、產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，不易變異退化，不易被感染；4、有利于酶的分離和純化；5、安全性可靠，非致病菌。第七頁，共五十頁。二、常用的產(chǎn)酶微生物1、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)2、大腸桿菌(Escherichiacoli)3、黑曲霉(Aspergillusniger)4、米曲霉(Aspergillusoryzae)5、青霉(Penicillium)6、木霉(Trichoderma)7、根霉(Rhizopus)8、毛霉(Mucor)9、鏈霉菌(Streptomyces)10、啤酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)11、假絲酵母(Candida)第八頁，共五十頁。微生物發(fā)酵法微生物酶①微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全，幾乎所有的酶都能從微生物中得到②微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)簡便，并可以通過控制培養(yǎng)條件來提高酶的產(chǎn)量③微生物具有較強的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過適應(yīng)、誘導(dǎo)、誘變以及基因工程等方法培育出新的產(chǎn)酶高的菌株優(yōu)點商品酶的主要生產(chǎn)方法第九頁，共五十頁。微生物發(fā)酵法高產(chǎn)優(yōu)良菌株培養(yǎng)和繁殖代謝和積累分離和純化酶制劑酶的發(fā)酵技術(shù)第十頁，共五十頁。微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶微生物菌種保藏機構(gòu)自然界研究或生產(chǎn)機構(gòu)溫泉森林深?；鹕酵寥喇a(chǎn)酶微生物的來源第十一頁，共五十頁。國外菌種保藏機構(gòu)ATCC(AmericanTypeCultureCollection） 美國典型菌種保藏中心NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection) 美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH) 德國微生物菌種保藏中心NBRC(NITEBiologicalResourceCenter) 日本技術(shù)評價研究所生物資源中心第十二頁，共五十頁。ATCCATCC(AmericanTypeCultureCollection）美國典型菌種保藏中心

ATCC主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物、免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)、普通微生物學(xué)、分類學(xué)、食品科學(xué)等的研究。

該中心保藏有藻類111株，細菌和放線菌16865株，細胞和雜合細胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動物1800株，動物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。

第十三頁，共五十頁。NRRLAgriculturalResearchService(ARS)CultureCollection

原為NorthernRegionalResearchLaboratory

NRRL是由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心支持的政府性質(zhì)的菌種保藏中心。主要從事農(nóng)業(yè)、應(yīng)用微生物、基因工程、工業(yè)微生物、菌種保藏方法、環(huán)境保護、分子生物學(xué)、食品安全、普通微生物、分類學(xué)的研究。

該中心保藏有細菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放線菌9500株。

第十四頁，共五十頁。DSMZDSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)德國微生物菌種保藏中心

DSMZ成立于1969年，是德國的國家菌種保藏中心。該中心一直致力于細菌、真菌、質(zhì)粒、抗菌素、人體和動物細胞、植物病毒等的分類、鑒定和保藏工作。

該中心是歐洲規(guī)模最大的生物資源中心，保藏有細菌9400株，真菌2400株，酵母500株，質(zhì)粒300株，動物細胞500株，植物細胞500株，植物病毒600株，細菌病毒90株等。第十五頁，共五十頁。NBRCNBRC(NITEBiologicalResourceCenter)日本技術(shù)評價研究所生物資源中心

NBRC是由日本經(jīng)濟部、商業(yè)部、工業(yè)部支持的半政府性質(zhì)菌種保藏中心。原為IFO(

InstituteforFermentation,Osaka,大阪發(fā)酵研究所)。主要從事農(nóng)業(yè)、應(yīng)用微生物、菌種保藏方法、環(huán)境保護、工業(yè)微生物、普通微生物、分子生物學(xué)等的研究。

該中心保藏有細菌1446株，真菌568株，酵母164株。這些菌種主要來自本國的其它菌種保藏中心。

第十六頁，共五十頁。國內(nèi)菌種保藏機構(gòu)ACCC 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心CGMCC 普通微生物菌種保藏管理中心AS 中國科學(xué)院微生物研究所CICC 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心IFFI 輕工業(yè)部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所第十七頁，共五十頁。微生物發(fā)酵法微生物的篩選粗篩菌種分離含菌樣品采集產(chǎn)酶性能微生物優(yōu)良微生物誘變基因工程其它方法第十八頁，共五十頁。微生物發(fā)酵法酶的生產(chǎn)過程培養(yǎng)基發(fā)酵方法發(fā)酵控制通氣供氧分離純化精制第十九頁，共五十頁。微生物發(fā)酵法酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式固體發(fā)酵液體深層發(fā)酵第二十頁，共五十頁。固體發(fā)酵表面培養(yǎng)或曲式培養(yǎng)以麩皮、米糠等為基本原料，加入適量的無機鹽和水作為培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶微生物菌種培養(yǎng)的一種培養(yǎng)技術(shù)淺盤培養(yǎng)轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)多用通風(fēng)式厚層培養(yǎng)固體發(fā)酵技術(shù)原理微生物發(fā)酵法第二十一頁，共五十頁。微生物發(fā)酵法固體發(fā)酵法設(shè)備簡單，便于推廣，特別適合于霉菌的培養(yǎng)和產(chǎn)酶發(fā)酵條件不易控制、物料利用不完全、勞動強度大、容易染菌等優(yōu)點缺點不適于胞內(nèi)酶的生產(chǎn)第二十二頁，共五十頁。液體深層發(fā)酵浸沒式發(fā)酵利用液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐內(nèi)進行的一種攪拌通氣培養(yǎng)方式液體發(fā)酵技術(shù)原理酶制劑生產(chǎn)的主要培養(yǎng)方式原料的利用率和酶的產(chǎn)量都較高，培養(yǎng)條件容易控制微生物發(fā)酵法第二十三頁，共五十頁。常用的酶制劑-1第二十四頁，共五十頁。常用的酶制劑-2第二十五頁，共五十頁。酶的生物合成酶的生物合成受基因和代謝物的雙重控制基因決定形成酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)代謝物（酶反應(yīng)的底物、產(chǎn)物或類似物）控制和調(diào)節(jié)酶的合成誘變或基因工程來培育優(yōu)良品種工藝調(diào)控第二十六頁，共五十頁。生產(chǎn)工藝-工藝流程-胞外第二十七頁，共五十頁。生產(chǎn)工藝-工藝流程-胞內(nèi)第二十八頁，共五十頁。生產(chǎn)工藝——培養(yǎng)基生長因子

——酶生產(chǎn)時需要供給微生物生長所需的氨基酸、維生素、嘌呤堿和嘧啶堿等生長因子。一般通過加入玉米漿、酵母膏、麩皮、米糠，以及豆餅等來提供。例如：添加含有生長因子的大豆酒精提取物，可使米曲酶的蛋白酶產(chǎn)量提高1.9倍。產(chǎn)酶促進劑

——少量加入之后能顯著增加酶產(chǎn)量的物質(zhì)。一般都是酶的誘導(dǎo)物或表面活性劑。例如纖維素能誘導(dǎo)纖維素酶，吐溫80可提高多種酶的產(chǎn)量。表面活性劑提高酶產(chǎn)量的作用機制目前還未完全了解，使用時必須考慮其對微生物是否有毒性。生產(chǎn)上提高胞外酶的活力，一般都采用非離子表面活性劑。碳源、氮源、無機鹽第二十九頁，共五十頁。生產(chǎn)工藝——工藝控制pH值的影響及控制

——

酶生產(chǎn)的合適pH通常和酶反應(yīng)的最適pH值相接近。生成堿性蛋白酶的芽孢桿菌宜在堿性環(huán)境下培養(yǎng)；生產(chǎn)酸性蛋白酶的青霉和根霉應(yīng)在酸性環(huán)境下培養(yǎng)。溫度控制

——

為了有利于菌體生長和酶的合成，可進行變溫生產(chǎn)。例如枯草桿菌AS1.398進行中性蛋白酶生產(chǎn)時，培養(yǎng)溫度從31oC逐漸升溫至40oC，然后再降溫至31oC進行培養(yǎng)，產(chǎn)量提高66%。

重組E.coli一般先37?C培養(yǎng)，加誘導(dǎo)劑后28?C產(chǎn)酶。第三十頁，共五十頁。生產(chǎn)工藝——工藝控制生長期與產(chǎn)酶的關(guān)系

——

微生物生長期與產(chǎn)酶有一定的關(guān)系，因菌種而異常。如曲霉的蛋白酶當菌體生長進入對數(shù)生長期時大量分泌；芽孢桿菌的堿性蛋白酶在對數(shù)生長期末大量形成芽孢時才生成。通氣攪拌的影響

——

酶生產(chǎn)所用的菌種一般都是需氧微生物，培養(yǎng)時都需要通氣攪拌。一般，通氣量少對霉菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長有利，對酶生產(chǎn)不利。因此必須根據(jù)不同的需要控制不同時期的通氣量。第三十一頁，共五十頁。

生產(chǎn)工藝——提取發(fā)酵液預(yù)處理酶的沉淀或吸附（鹽析法、有機溶劑沉淀法或白土或活性氧化鋁吸附）干燥（收集沉淀進行干燥磨粉，加入適當?shù)姆€(wěn)定劑、填充劑等制成酶制劑；或在酶液中直接加入適當?shù)姆€(wěn)定劑、填充劑，直接進行噴霧干燥）酶的提?。旱谌?，共五十頁。

酶制劑產(chǎn)品液體酶固體酶第三十三頁，共五十頁。生產(chǎn)工藝—造粒酶粒是在大型連續(xù)運轉(zhuǎn)的水平混合機內(nèi)生產(chǎn)出來的。提取的酶與鹽、纖維素及其他成分混合形成0.5mm大小的粒狀物。然后用一種聚合體包裹，以防止酶塵在使用過程中可能引起的致敏危險。造粒對顧客及包含酶的最終產(chǎn)品來說，都是一種非常有效和安全的運輸固態(tài)酶的方式。用多聚體包裹酶以減少酶塵引起的致敏危險。第三十四頁，共五十頁。生產(chǎn)工藝—生產(chǎn)廢渣處理生產(chǎn)廢渣實際上是有益于環(huán)境的?？杀挥米霎?shù)剞r(nóng)田的肥料。確保所有的微生物均經(jīng)滅活之后才能從生產(chǎn)車間中運出。將含硅藻土、培養(yǎng)基和微生物的發(fā)酵液經(jīng)加熱及用碳酸鈣進行處理。處理后的發(fā)酵液廢渣最終為可持續(xù)性工業(yè)解決方案做出了貢獻。即使是生產(chǎn)廢渣也是有用的；它們可以用作肥料。將生產(chǎn)廢渣用做肥料第三十五頁，共五十頁。

生產(chǎn)工藝-中性蛋白酶工藝流程第三十六頁，共五十頁。提高酶產(chǎn)量的方法酶合成的調(diào)節(jié)機制：在正常情況下，酶產(chǎn)量受酶合成調(diào)節(jié)機制的控制，要提高酶產(chǎn)量必須打破這種調(diào)節(jié)控制。酶合成主要取決于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，原核生物中普遍公認的調(diào)節(jié)機制是操縱子理論。第三十七頁，共五十頁。打破酶合成調(diào)節(jié)限制的方法：1、通過條件控制提高酶產(chǎn)量：添加誘導(dǎo)物降低阻遏物濃度2、通過基因突變提高酶產(chǎn)量：使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型，使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?、其它提高酶產(chǎn)量的方法：添加表面活性劑添加產(chǎn)酶促進劑第三十八頁，共五十頁。第四節(jié)酶發(fā)酵動力學(xué)發(fā)酵動力學(xué)：主要研究在發(fā)酵過程中細胞生長速率，產(chǎn)物形成速率以及環(huán)境因素對速率的影響；在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中,研究酶發(fā)酵動力學(xué)對于了解酶生物合成模式；發(fā)酵條件的優(yōu)化控制,提高酶產(chǎn)量具有重要的理論指導(dǎo)意義。酶生物合成模式：根據(jù)酶的合成與細胞生長的關(guān)系，可以把酶生物合成模式分為4種類型：同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。第三十九頁，共五十頁。同步合成型：又稱生長偶聯(lián)型,是指酶合成與細胞生長同步進行，當細胞生長進入對數(shù)期時，酶也大量合成；當細胞進入穩(wěn)定期時,酶的合成也停止。延續(xù)合成型：酶的合成伴隨著細胞生長而開始，但在細胞生長進入穩(wěn)定期后,酶的合成仍將延續(xù)較長一段時間。中期合成型：酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入穩(wěn)定期后,酶的合成也終止。滯后合成型：只有當細胞生長進入穩(wěn)定期后才開始酶的合成并大量積累。第四十頁，共五十頁。濃度時間(h)細胞濃度酶濃度細胞濃度酶濃度酶濃度酶濃度細胞濃度細胞濃度A.同步合成型;B.延續(xù)合成型;C.中期合成型;D.滯后合成型ABCD酶生物合成模式第四十一頁，共五十頁。影響酶生物合成模式的因素主要是mRNA和培養(yǎng)基中存在的阻遏物：mRNA穩(wěn)定性高的，可以在細胞停止生長后繼續(xù)合成相應(yīng)的酶；mRNA穩(wěn)定性差的，隨著細胞生長停止而終止酶的合成；不受阻遏物阻遏的,可隨著細胞生長而開始酶的合成；受阻遏物阻遏的,要在細胞生長一段時間或進入穩(wěn)定期后解除阻遏,才能開始酶的合成。第四十二頁，共五十頁。在酶的工業(yè)生產(chǎn)中，為了提高酶產(chǎn)率和縮短發(fā)酵周期,最理想的酶合成模式是延續(xù)合成型；對于其它類型的酶,要在菌種選育和工藝條件上加以調(diào)節(jié)；對于同步合成型，盡量提高mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度;對于滯后合成型,盡量減少阻遏物；對于中期合成型，要從提高mRNA穩(wěn)定性和解除阻遏兩方面進行。第四十三頁，共五十頁。第五節(jié)動植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)酶

利用動植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)各種天然物質(zhì)，是生物工程的一個新領(lǐng)域，20世紀80年代以來，利用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的有用產(chǎn)物已達100多種，其中酶制劑有10多種。包括糖苷酶(胡蘿卜細胞，1981)，過氧化物酶(甜菜細胞，1983；大豆細胞，1989)等。呈現(xiàn)出良好的發(fā)展前景.第四十四頁，共五十頁。一、動植物細胞的特點:1、體積比微生物大；2、對剪切力敏感；3、生長和代謝速率低，生長倍增時間和發(fā)酵周期長；4、動物細胞營養(yǎng)要求復(fù)雜；5、發(fā)酵產(chǎn)物不同第四十五頁，共五十頁。二、植物細胞培養(yǎng)和發(fā)酵1、植物細胞發(fā)酵技術(shù)和特點：發(fā)酵特點（與直接提取分離相比較而言）：（1）提高產(chǎn)率；（2）縮短周期;（3）易于管理、減輕勞動強度；（4）提高質(zhì)量。第四十六頁，共五十頁。2、植物細胞發(fā)酵技術(shù)(I)高產(chǎn)細胞系的選擇：主要有以下幾個途徑：材料選擇，克隆選擇