第一節(jié)沙門氏菌檢驗(yàn)

第一節(jié)沙門氏菌檢驗(yàn)沙門氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各國(guó)的各類細(xì)菌性食物中毒中,沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。在英國(guó),以沙門氏菌占首位。美國(guó)則為第2位,僅次于金色葡萄球菌。日本則以副溶血弧菌和金色葡萄球菌為最多,沙門氏菌占第3位。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也是以沙門氏菌為首位。世界上最大的一起沙門氏菌食物中毒是1953年于瑞典由吃豬肉而引起的鼠傷寒沙門氏菌中毒,7717人中毒,90人死亡。沙門氏菌屬于腸桿菌科,至今已有2230種以上的血清型。概況沙門氏菌引起人的傷寒、副傷寒、感染性腹瀉、食物中毒和醫(yī)院內(nèi)感染，并引起動(dòng)物的沙門氏菌病，是重要的腸道致病菌。該菌屬在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)和公共衛(wèi)生上均十分重要：沙門氏菌的分類根據(jù)新近的沙門氏菌的分類方案，本屬菌現(xiàn)可分為兩個(gè)種：腸道沙門氏菌（S.enterica）邦戈?duì)柹抽T氏菌（S.bongori）腸道沙門氏菌又分為6個(gè)亞種：腸道亞種（enterica）薩拉姆亞種（salamae）亞利桑那亞種（arizonae）雙相亞利桑那沙門氏菌（diarizonae）豪頓沙門氏菌（houtenae）因迪卡沙門氏菌（indica）抗原結(jié)構(gòu)菌體(O)抗原─分群鞭毛(H)抗原─分型毒力(Vi)抗原─微莢膜成分O抗原是細(xì)胞壁表面的耐熱多糖抗原；根據(jù)O抗原（群因子）將沙門氏菌分為A、B、C1-C4、D1-D3、E1-E4、F、G1-G2、H……Z和O51-O63以及O65-O67計(jì)51個(gè)O群，包括58種O抗原。1、O抗原H抗原是本屬菌的蛋白質(zhì)性鞭毛抗原，計(jì)有63種；第一相（特異相）：小寫英文字母，特異性高第二相（非特異相）：阿拉伯?dāng)?shù)字，少數(shù)用英文字母，特異性低同一O群的沙門氏菌又根據(jù)它們的H抗原的不同再細(xì)分成許多不同的血清型。2、H抗原Vi抗原是微莢膜成分；相當(dāng)于K抗原，與毒力（virulence）有關(guān)，故稱為Vi抗原。新分離的菌株多有Vi抗原，在普通培養(yǎng)基上多次傳代后易丟失此抗原，這種變異稱為“V-W變異”。3、Vi抗原傷寒沙門氏菌丙型副傷寒沙門氏菌部分都柏林沙門氏菌須鑒定Vi抗原4、血清型以O(shè):H:Vi形式表示：用已知的沙門氏菌O和H單因子血清作玻板凝集試驗(yàn)便可確定一個(gè)沙門氏菌分離物的血清型或抗原式，對(duì)可能有Vi抗原的菌株還須用Vi抗血清鑒定之。舉例：1,4,[5],12:i:1,29,12,Vi:d:–目前本菌屬至少已有2500個(gè)血清型。對(duì)人和溫血?jiǎng)游镏虏〉难逍徒^大多數(shù)分屬于AF群，在疾病中經(jīng)常出現(xiàn)的不足50種。常用檢驗(yàn)用培養(yǎng)基DHL瓊脂成分蛋白胨20g牛肉膏3g乳糖

10g蔗糖

10g去氧膽酸鈉1g硫代硫酸鈉2.3g檸檬酸鈉1g檸檬酸鐵銨

1g中性紅0.03g瓊脂1820g蒸餾水1000mlpH7.3制法：將除中性紅和瓊脂以外的成分溶解于400ml蒸餾水中，校正pH，再將瓊脂于600ml蒸餾水中煮沸溶解，兩液合并，并加入0.5%的中性紅水溶液6ml，待冷至55℃，傾注平板。

sal.為無(wú)色半透明菌落，產(chǎn)H2S者為黑色菌落。SS瓊脂(沙門氏-志賀氏瓊脂)基礎(chǔ)培養(yǎng)基牛肉膏5g蛋白胨5g三號(hào)膽鹽3.5g瓊脂17g蒸餾水1000ml121℃,15min高壓滅菌完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基1000ml乳糖

10g檸檬酸鈉8.5g硫代硫酸鈉8.5g10%檸檬酸鐵溶液10ml1%中性紅溶液

2.5ml0.1%煌綠溶液

0.33ml加熱溶化基礎(chǔ)培養(yǎng)基,按比例加入上述除染料以外之各成分,充分混合均勻,矯正至pH7.0,加入中性紅和煌綠溶液,傾注平板.注1:制好的培養(yǎng)基宜當(dāng)日使用，或保存于冰箱內(nèi)于48h內(nèi)使用注2:煌綠溶液配好后應(yīng)在10天以內(nèi)使用注3:可以購(gòu)用SS瓊脂的干燥培養(yǎng)基

sal.為無(wú)色半透明菌落，產(chǎn)H2S者為中心帶黑色，乳糖陽(yáng)性者為粉紅色，中心帶黑色。亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）成分蛋白胨5g乳糖4g亞硒酸氫鈉

4g磷酸氫二鈉5.5g磷酸二氫鉀4.5gL-胱氨酸

0.01g蒸餾水1000ml1%L-胱氨酸–氫氧化鈉溶液的配制：稱取L-胱氨酸0.1g，加1mol/L氫氧化鈉1.5ml，使溶解，再加入蒸餾水8.5ml即成。制法將除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸以外的各成分溶解于900ml蒸餾水中，加熱煮沸，待冷備用。另將亞硒酸氫鈉溶解于100ml蒸餾水中，加熱煮沸，待冷，以無(wú)菌操作與上液混合。再加入1%L-胱氨酸-氫氧化鈉1ml。分裝于滅菌瓶中，每瓶100ml，pH應(yīng)為7.1氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）甲液胰蛋白胨5g氯化鈉8g磷酸二氫鉀1.6g蒸餾水1000ml乙液氯化鎂40g蒸餾水100ml丙液0.4%孔雀綠水溶液制法分別按上述成分配好后，121℃，15min滅菌備用。臨用前取甲液90ml、乙液9ml、丙液0.9ml，以無(wú)菌操作混合即可。四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）基礎(chǔ)培養(yǎng)基蛋白胨5g膽鹽

1g碳酸鈣10g硫代硫酸鈉30g蒸餾水1000ml碘溶液碘6g碘化鉀5g蒸餾水20ml制法將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各成分加入蒸餾水中，加熱溶解，分裝每瓶100ml。分裝時(shí)應(yīng)隨時(shí)振搖，使其中的碳酸鈣混勻。121℃，15min，滅菌。臨用時(shí)每100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入碘溶液2ml、0.1%煌綠溶液1ml。亞硫酸鉍瓊脂（BS）成分蛋白胨10g牛肉膏5g葡萄糖5g硫酸亞鐵0.3g磷酸氫二鈉4g煌綠0.025g檸檬酸鉍銨

2g亞硫酸鈉

6g瓊脂1820g蒸餾水1000mlpH7.5制法將前五種成分溶解于300ml蒸餾水中將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉另用50ml蒸餾水溶解將瓊脂于600ml蒸餾水中煮沸溶解，冷至80℃。將以上三液合并，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml，矯正pH，加0.5%煌綠水溶液5ml，搖勻，冷至55℃時(shí)，傾注平板注：此培養(yǎng)基不需高壓滅菌。制備過(guò)程中不宜過(guò)分加熱，以免降低其選擇性。應(yīng)在臨用前一天制備，貯存于室溫暗處。超過(guò)48h不宜使用。產(chǎn)H2S者為黑色有金屬光澤，不產(chǎn)H2S者為灰綠色的菌落。尿素瓊脂成分蛋白胨1g氯化鈉5g葡萄糖5g磷酸二氫鉀2g0.4%酚紅溶液3ml瓊脂20g蒸餾水1000ml20%尿素溶液100mlpH7.2制法將除尿素以外的成分配好，并高壓滅菌后，冷至55℃，加入經(jīng)除菌過(guò)濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2%，最終pH為7.2，分裝于滅菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆?。試?yàn)方法挑取瓊脂培養(yǎng)物接種，在37℃，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，尿素酶陽(yáng)性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基成分蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g蒸餾水1000ml1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1mlL-氨基酸或DL-氨基酸0.5g或1g/100mlpH6.8制法將除氨基酸以外的成分加熱溶解后，分裝每瓶100ml，加入各種氨基酸、賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。試驗(yàn)方法從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于37℃，培養(yǎng)18-24h。氨基酸脫羧酶陽(yáng)性者由于產(chǎn)堿，培養(yǎng)基應(yīng)呈紫色。陰性者無(wú)堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對(duì)照管應(yīng)為黃色。ONPG培養(yǎng)基成分鄰硝基酚--D-半乳糖苷（ONPG）60mg0.01mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5）10ml1%蛋白胨水（pH7.5）30ml制法將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，加入蛋白胨水，以過(guò)濾法除菌，分裝于試管內(nèi)，每管0.5ml。用橡皮塞塞緊。試驗(yàn)方法將細(xì)菌接種于37℃培養(yǎng)1-3h和24h觀察結(jié)果。如果-半乳糖苷酶產(chǎn)生，則于1-3h變黃色，如無(wú)此酶則24h不變色。氫化鉀（KCN）培養(yǎng)基成分蛋白胨10g氯化鈉5g磷酸二氫鉀0.225g磷酸氫二鈉5.64g蒸餾水1000ml0.5%氫化鉀溶液

20mlpH7.6制法將除氰化鉀以外的成分配好后分裝燒瓶，121℃，15min。每100ml培養(yǎng)基加入0.5%氰化鉀溶液2.0ml。試驗(yàn)方法37℃，培養(yǎng)1-2天。如有細(xì)菌生長(zhǎng)即為陽(yáng)性（不抑制），經(jīng)2天培養(yǎng)不生長(zhǎng)為陰性（抑制）。緩沖蛋白胨水（BP）成分蛋白胨10g氯化鈉5g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）

9g磷酸二氫鉀1.5g蒸餾水1000mlpH7.2制法按上述成分配好后，121℃，15min滅菌。臨用時(shí)無(wú)菌分裝每瓶225ml。注：本培養(yǎng)基供沙門氏菌前增菌用前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應(yīng)經(jīng)過(guò)前增菌。以無(wú)菌操作取25g（ml），加在裝有225ml緩沖蛋白胨水的500ml

廣口瓶?jī)?nèi)。固體食品可先磨碎或乳化，于37℃培養(yǎng)4h（干蛋品1824h）。移取10ml，轉(zhuǎn)種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)1824h。同時(shí)，另取10ml，轉(zhuǎn)種于100ml亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于37℃培養(yǎng)1824h。為何要用兩種不同的增菌液呢？亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）四硫磺酸酸鹽增菌液（TTB）+對(duì)豬霍亂和羊流產(chǎn)sal有毒性TTB適于傷寒沙門氏菌增菌；MM適于其它各種沙門氏菌；檢樣前增菌法：凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品25g+BP225ml直接增菌法：鮮肉、鮮乳或其它未經(jīng)加工的食品25g+滅菌生理鹽水25ml，做成檢樣勻液10ml+MM（或TTB）100ml10ml+SC100ml檢樣勻液25ml+MM（或TTB）100ml檢樣勻液25ml+SC100mlBSDHL（或SS、HE、WS）挑取可疑菌落TSI，靛基質(zhì)試驗(yàn)、尿素（pH7.2）、KCN、賴氨酸H2S+；靛基質(zhì)-；尿素-；KCN-；賴氨酸+；H2S+；靛基質(zhì)+；尿素-；KCN-；賴氨酸+；H2S-；靛基質(zhì)+；尿素-；KCN-；賴氨酸+/-；非如左述的各種反應(yīng)結(jié)果沙門氏菌血清學(xué)試驗(yàn)沙門氏菌血清學(xué)試驗(yàn)非沙門氏菌非沙門氏菌甘露醇+、山梨醇+ONPG+報(bào)告42℃18-24h37℃42℃37℃鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過(guò)前增菌。各取25g（25ml）加入滅菌生理鹽水225ml，按前法做成檢樣勻液；取25ml接種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)24h；另取25ml接種于100ml亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于37℃，培養(yǎng)1824h。分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)亞硫酸鉍瓊脂（BS）和一個(gè)DHL瓊脂平板（或SS瓊脂平板）。兩種增菌液可同時(shí)劃線接種于同一個(gè)平板上。于37℃分別培養(yǎng)1824h或4048h（BS）觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落特征。選擇性瓊脂平板沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙門氏菌Ⅲ（即亞利桑那菌）亞硫酸鉍瓊脂產(chǎn)硫化氫菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落黑色有金屬光澤DHL瓊脂平板無(wú)色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性的菌株與前相同；乳糖陽(yáng)性的菌株為粉紅色，中心帶黑色SS瓊脂無(wú)色半透明，產(chǎn)硫化氫菌株中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性的菌株與前相同；乳糖陽(yáng)性的菌株為粉紅色，中心帶黑色，但中心無(wú)黑色形成時(shí)與大腸桿菌不能區(qū)別。沙門氏菌屬各群在選擇性瓊脂平板上的菌落特征生化試驗(yàn)自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個(gè)可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂。在三糖鐵瓊脂上，只有斜面產(chǎn)酸并同時(shí)硫化氫（H2S）陰性的菌株可以排除，其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時(shí)也均有不是沙門氏菌的可能斜面底層產(chǎn)氣硫化氫可能的菌屬和種-++/-+沙門氏菌屬、費(fèi)勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌+++/-+沙門氏菌Ⅲ、費(fèi)勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌-++-沙門氏菌屬、大腸桿菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬-+--傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸桿菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬+++/--大腸桿菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、費(fèi)勞地氏檸檬酸桿菌注：+陽(yáng)性；-陰性；+/-多數(shù)陽(yáng)性，少數(shù)陰性。腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果在接種三糖鐵的同時(shí)，再接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀培養(yǎng)基（KCN）和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基各一管，于37℃培養(yǎng)18-24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h。腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號(hào)硫化氫靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定菌屬A1沙門氏菌屬A2沙門氏菌屬（少見）、緩慢愛德華氏菌B1沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬血清型分型鑒定抗原的準(zhǔn)備O抗原的鑒定用AF多價(jià)O血清做玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)用生理鹽水做對(duì)照，在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型。H抗原的鑒定Vi抗原的鑒定須強(qiáng)調(diào)的是，雖然對(duì)沙門氏菌有各種新的分類方案，但通常仍慣用簡(jiǎn)單的通用命名，即以該菌所致疾病或最初分離地名、或抗原式三種方式來(lái)命名。群別菌型抗原OHA甲型副傷寒沙門氏菌1,2,12a:-B乙型副傷寒沙