第14章維生素類藥物的分析

第十四章維生素類藥物的分析Chapter14

AnalysisofVitamins基本要求1、掌握維生素A、B1、C、E的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及與分析方法間的關(guān)系，它們的專屬鑒別反應(yīng)、主要的含量測(cè)定方法與原理。2、掌握維生素A、B1、C、E的有關(guān)物質(zhì)、檢查方法與原理。3、了解維生素D的性質(zhì)和分析特點(diǎn)。

維持人類機(jī)體正常代謝功能所必須的一類活性物質(zhì)，主要用于機(jī)體的能量轉(zhuǎn)移和代謝調(diào)節(jié)，體內(nèi)不能合成，須從食物中攝取。

通俗來(lái)講，即維持生命的物質(zhì)，是維持人體生命活動(dòng)必須的一類有機(jī)物質(zhì)，也是保持人體健康的重要活性物質(zhì)。維生素在體內(nèi)的含量很少，但不可或缺。維生素醇從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來(lái)講，維生素類均屬于有機(jī)化合物，但并非同一類化合物。酯酸胺酚醛各具有不同的理化性質(zhì)和生理作用維生素按溶解度分生物法微生物法化學(xué)法物理化學(xué)法維生素類藥物的分析方法都是依據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與生物特性來(lái)進(jìn)行分析-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:第一節(jié)維生素A結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）環(huán)己烯+共軛多烯側(cè)鏈；（2）天然VA側(cè)鏈為全反式；（3）天然來(lái)源主要是魚肝油，為醋酸酯，棕櫚酸酯等,目前多由人工合成。

一、性質(zhì)properties1.溶解性：

不溶于水，溶于乙醚，氯仿，環(huán)己烷或石油醚、植物油等。Solubility:insolubleinwater；solubleinether,chloroform,cyclohexaneorpetroleumether，vegetableoil

etc.

2.

不穩(wěn)定性△或金屬離子instability:light--catalysedcrackingreactionredoxreaction(oxidizedbyoxygeninair,orotheroxidizingagents)▲?。h(huán)氧化物

epoxides▲

ⅱ．維生素A醛aldehyde▲

ⅲ．維生素A酸acid具有共軛多烯側(cè)鏈—紫外吸收，最大吸收波長(zhǎng)在325~328nm，可用于鑒別和含量測(cè)定。3.紫外吸收ultravioletabsorptionconjugatedpolyenemaximumabsorptionwavelength：325~328nm4.與三氯化銻發(fā)生呈色反應(yīng)reactionwithSbCl3(Carr-Pricereaction)CHCl3二、鑒別試驗(yàn)Identification（一）三氯化銻反應(yīng)（Carr-Price反應(yīng)）無(wú)水、無(wú)醇藍(lán)色紫色insaturatedchloroformsolution,water,alcohol-free（二）UV法326nm348nm367nm389nmVitA去水VitA（VitA3）↓（三）

TLC（BP、USP）確認(rèn)醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯?！篤A和其標(biāo)準(zhǔn)品用氯仿溶解（USP34）展開劑：環(huán)己烷—乙醚（80：20）板：硅膠顯色：磷鉬酸Rf：VA醇0.1VA醋酸酯0.45VA棕櫚酸酯0.7維生素A的測(cè)定CHP收載三種HPLC法UV三氯化銻法三、含量測(cè)定Assay立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物合成中間體（一）UV法三、含量測(cè)定Assay維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸t(yī)hree-pointcorrectionprocedure（三點(diǎn)校正法）three-wavelengthcorrectionprocedure

1.原理：（1）雜質(zhì)的吸收在310~340nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長(zhǎng)的增大吸收度減小；（2）物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。Supposition：I.theirrelevantabsorption:islinearbetween310~340nmwavelenghs(atthethreewavelenghsselected)II.thetotalabsorbanceofthemixtureisthesumoftheindividualabsorbanceofcomponentsAt=AVA+Ai2.波長(zhǎng)的選擇：（1）1—VitA的max（328nm）（2）2、3—分別在1的兩側(cè)第一法等波長(zhǎng)差法—VitA醋酸酯=12nm第二法等吸收比法—VitA醇1=325nm,2=310nm,3=334nm（1）基本步驟:第一步

A的選擇選擇依據(jù)：所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除測(cè)定法第二步求注意：

C為混合樣品的濃度

換算因子由純品計(jì)算而得：第三步求效價(jià)第四步求標(biāo)示量％

方法：（2）測(cè)定法第一法直接測(cè)定法適用于純度高的維生素A醋酸酯?。畲笪詹ㄩL(zhǎng)確認(rèn)

max在326~329nm，第一法測(cè)定。max不在326~329nm，第二法測(cè)定。ⅱ．計(jì)算吸收度比及比值差均不超過±0.02，用A328直接計(jì)算。有一個(gè)以上超過±0.02，計(jì)算A328（校正），先判斷再計(jì)算。ⅲ．計(jì)算校正吸收度03%－15%－3%第二法第二法

VitAD膠丸中VitA的含量測(cè)定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項(xiàng)下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物0.1287g至10ml燒杯中，加環(huán)己烷溶解并定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為328nm，并在下列波長(zhǎng)處測(cè)得吸收度為A300：0.374A316：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344求本品中維生素A占標(biāo)示量的百分含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637A328(校正)–A328(實(shí)測(cè))A328(實(shí)測(cè))×100％E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.870.637–0.6630.663×100％=-3.92％=供試品中維生素A效價(jià)=E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）標(biāo)示量%=VA效價(jià)(IU/g)×每丸內(nèi)容物平均裝量(g/丸)標(biāo)示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%第二法（等吸收比法）[皂化法、6/7A法]第一法無(wú)法消除雜質(zhì)干擾時(shí)用此法水溶性脂溶性

方法：?。畲笪詹ㄩL(zhǎng)確認(rèn)

max在323~327nm，計(jì)算A300/A325。max不在323~327nm，取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定。ⅱ．計(jì)算吸收度比值A(chǔ)300/A325＞0.73，取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定≯0.73，計(jì)算A325（校正）后，再判斷計(jì)算ⅲ．計(jì)算校正吸收度03%－3%儀器與色譜條件

HPLC,紫外檢測(cè)器色譜柱：硅膠

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇（997:3）檢測(cè)波長(zhǎng)：325nm（二）HPLC法測(cè)定法

外標(biāo)法適用范圍

維生素A醋酸酯原料及其制劑中維生素A的含量（三）三氯化銻比色法λmax618nm～620nm缺點(diǎn)呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性藍(lán)色+3SbClVitASbCl3colorimetricmethod:第二節(jié)維生素E一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)***名稱R1R2相對(duì)活性α-生育酚CH3CH31.0β-生育酚CH3H0.5γ-生育酚HCH30.2δ-生育酚

HH0.1苯并二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈dl－α－生育酚醋酸酯1.溶解性黃色液體，無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚植物油中易溶2.水解性3.氧化性：遇光、空氣氧化4.UV：無(wú)水乙醇液284nm，E為41.0~45.0[O]△游離生育酚-+orOHHVitE醌型化合物（一）硝酸反應(yīng)nitricacidreaction(redoxreaction)二、鑒別75℃15′HNO3VitE乙醇橙紅色I(xiàn)dentification生育酚HNO3（橙紅色）生育紅對(duì)-生育醌（二）三氯化鐵－聯(lián)吡啶反應(yīng)血紅色=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%無(wú)水乙醇中（三）UV法（四）其他方法TLC、GC、HPLC、IR三、雜質(zhì)檢查Test（一）酸度acidity

目的：檢查制備過程中引入的游離醋酸。方法：乙醇乙醚為溶劑，酚酞為指示劑，以NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定，體積控制，不得過0.5ml。（二）游離生育酚Testoffreetocopherol

利用生育酚的強(qiáng)還原性，規(guī)定所消耗的硫酸鈰液（0.01mol/L）不得超過1.0ml。CH.P

取本品0.10g，加無(wú)水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過1.0ml。p-tocopherquinonefreetocopherol（M生育酚=430.8）滴定度的計(jì)算限量的計(jì)算（三）有關(guān)物質(zhì)方法：GC—主成分自身對(duì)照法限量：α-生育酚（1.0%）其他單個(gè)雜質(zhì)峰（1.5%）各雜質(zhì)峰總和（2.5%）（四）殘留溶劑天然型維生素E檢查正己烷。四、含量測(cè)定（一）GC法（ChP法定方法）

內(nèi)標(biāo)法(正三十二烷為內(nèi)標(biāo))維生素E原料及其制劑均采用本法測(cè)定（二）其他方法

HPLC法（JP15）鈰量法比色法熒光法1．中國(guó)藥典（2010年版）采用以下何法測(cè)定維生素E含量A.酸堿滴定法B.氧化還原法C.紫外分光光度法D.氣相色譜法E.非水滴定法2．維生素A的鑒別試驗(yàn)為A.三氯化鐵反應(yīng)B.硫酸銻反應(yīng)C.2,6-二氯靛酚反應(yīng)D.三氯化銻反應(yīng)E.間二硝基苯的堿性乙醇液反應(yīng)3．中國(guó)藥典（2010年版）規(guī)定維生素A的測(cè)定采用紫外分光光度法（三點(diǎn)校正法），此法又分為A．等波長(zhǎng)差法B．等吸收度法C．6/7A法D．差示分光法E．雙波長(zhǎng)法4．維生素E的鑒別試驗(yàn)有A．硫色素反應(yīng)B．硝酸氧化呈色反應(yīng)C．硫酸-乙醇呈色反應(yīng)D．堿性水解后加三氯化鐵乙醇液與2,2-聯(lián)吡啶乙醇液呈色反應(yīng)E．Marquis反應(yīng)

維生素A與

反應(yīng)即顯藍(lán)色，漸變成紫紅色；反應(yīng)需在

條件下進(jìn)行。

維生素E在酸性或堿性溶液中加熱可水解生成游離

，當(dāng)有氧或其他氧化劑存在時(shí)，則進(jìn)一步被氧化成醌型化合物，尤其在堿性下更易發(fā)生。第三節(jié)維生素B1HClCl-一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1、溶解性2、硫色素反應(yīng)3、UV(246nm，E為406~436)4、與生物堿沉淀試劑反應(yīng)5、氯化物特性VitaminB1

Thiaminehydrochloride一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

干燥品在空氣中迅速吸收4%的水分。在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶，水溶液呈酸性溶解性噻唑環(huán)在堿性介質(zhì)中可開環(huán)，再與嘧啶環(huán)上的氨基環(huán)合，經(jīng)鐵氰化鉀等氧化劑氧化成具有熒光的硫色素，后者溶于正丁醇中呈藍(lán)色熒光。硫色素反應(yīng)

嘧啶環(huán)、噻唑環(huán)具有紫外吸收特性，246nm，吸收系數(shù)為406~436（12.5μg/ml鹽酸溶液）。紫外吸收特性分子中具有兩個(gè)雜環(huán)，可與某些生物堿沉淀試劑如碘化鉀、三硝基苯酚、碘溶液、硅鎢酸反應(yīng)生成恒定的沉淀。生物堿沉淀試劑反應(yīng)維生素B1為鹽酸鹽，可呈氯化物的鑒別反應(yīng)。氯化物特性

硫色素?zé)晒夥磻?yīng)

沉淀反應(yīng)

氯化物反應(yīng)硫元素反應(yīng)紅外分光光度法其他二、鑒別試驗(yàn)

Identification（一）硫色素反應(yīng)thiochromereaction（ChP）方法：取本品約5mg，加NaOHT.S.2.5ml溶解后，加鐵氰化鉀T.S.0.5ml與正丁醇5ml，強(qiáng)力振搖2min，放置使分層，上層顯強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光；加酸使呈酸性，熒光即消失；再加堿使呈堿性，熒光又重現(xiàn)。VitB1H+H+H+H+（二）沉淀反應(yīng)Precipitationreaction

（三）其他反應(yīng)PbSNaSVitB1Pb(NO3)2NaOHS:Cl:

非水溶液滴定法(ChP2010，原料藥)

紫外分光光度法(ChP2010

，片劑注射劑)

硫色素?zé)晒夥?USP34-NF29)三、含量測(cè)定（一）非水溶液滴定法Non-aqueoustitration

醋酸汞試液

指示劑：喹那啶紅－亞甲藍(lán)（紫紅→天藍(lán)）2005版醋酐為溶劑

指示終點(diǎn)：電位法2010版（二）UV法246nm266nm233nm1.直接測(cè)定法2.差示分光光度法WEA%cmD10011××%100標(biāo)示量平均片重××片劑、注射劑=421（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=A=ECL規(guī)格g/片g/100mlgChP維生素B1片的含量測(cè)定：

取維生素B1片20片，精密稱定，其總重量為2.3695g，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉0.3608mg，置100ml量瓶中，加鹽酸溶液（9→1000）約70ml，振搖15min使維生素B1溶解，加鹽酸溶液（9→1000）稀釋至刻度，搖勻。用干燥濾紙濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加鹽酸溶液(9→1000)稀釋至刻度，搖勻。照分光光度法（附錄ⅣA），在246nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A為0.615，已知維生素B1的吸收系數(shù)（E）為421，維生素B1標(biāo)示量=10mg/片，計(jì)算維生素B1的標(biāo)示百分含量。(P360)（每ml）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=規(guī)格g/mlml%VEA%cm100110011××標(biāo)示量稀釋倍數(shù)×維生素B1注射劑的含量測(cè)定：精密量取維生素B1注射液1ml（約相當(dāng)于維生素B150mg），置200ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取5ml，置100ml量瓶中，加鹽酸溶液(9→1000)稀釋至刻度，搖勻。照分光光度法（附錄ⅣA），在246nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A為0.518，按C12H17ClN4OS·HCl的吸收系數(shù)（E）為421計(jì)算標(biāo)示百分含量。（標(biāo)示量為2ml:100mg）VitB1鐵氰化鉀NaOH硫色素異丁醇熒光λex-365nmλem-435nm+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇對(duì)照液+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇供試液SdAb（三）硫色素?zé)晒夥ǖ谖骞?jié)維生素CL－抗壞血酸L-Ascorbicacid一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1、溶解性2、酸性acidicbehavior3、還原性reducingaction4、旋光性5、水解性hydrolysis6、糖類的性質(zhì)7、UV1、易溶于水在乙醇中略溶、在氯仿或乙醚中不溶2、水溶液呈酸性溶解性▲C3-OH，pKa=4.17(共軛效應(yīng))▲C2-OH，pKa=11.57(鄰位羰基)一元酸，能與NaHCO3作用生成鈉鹽。烯二醇結(jié)構(gòu)dienolgroup還原性烯二醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)烯二醇結(jié)構(gòu)有活性有活性無(wú)活性L-二酮古洛糖酸D(-)-異抗壞血酸L(+)-異抗壞血酸L(+)-抗壞血酸D(-)-抗壞血酸旋光性水解性△糖類的顯色反應(yīng)50℃結(jié)構(gòu)與糖類相似具糖的性質(zhì)UV特征

氧化還原反應(yīng)

糖類反應(yīng)

紫外光譜薄層色譜其他二、鑒別試驗(yàn)

Identification612345（一）與氧化劑的反應(yīng)oxidationreaction去氫抗壞血酸[O]VitCAgNO3反應(yīng)2，6-二氯靛酚其他氧化劑1.與AgNO3反應(yīng)silvernitratereaction(ChP2010)2.與2,6-二氯靛酚反應(yīng)2,6-dichloroindophenolreaction

氧化型玫瑰紅色藍(lán)色OHˉ還原型無(wú)色3.其他氧化劑的反應(yīng)：亞甲藍(lán)、高錳酸鉀、溴水試劑褪色

堿性酒石酸銅（斐林試劑）磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍(lán)（二）糖類的反應(yīng)藍(lán)色Furfural(dehyde)reaction50℃三氯化醋酸orHCl藍(lán)色戊糖糠醛（三）TLC(ChP2010)

供試品溶液：VC泡騰片，水溶解后過濾

對(duì)照品溶液：VC1mg/ml

硅膠GF254

流動(dòng)相：乙酸乙酯-乙醇-水（5:4:1）紫外燈（254nm）下視檢

供試品所顯主斑點(diǎn)的位置和顏色應(yīng)與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同。（四）UV(BP2010)0.01mol/LHCl三、雜質(zhì)檢查1.溶液的澄清度與顏色：有色雜質(zhì)分光光度法—比較法2.鐵、銅離子：原子吸收分光光度法，標(biāo)準(zhǔn)添加對(duì)照法3.草酸的檢查：與鈣反應(yīng)，對(duì)照法

碘量法

二氯靛酚滴定法

高效液相色譜法紫外分光光度法其他612345四、含量測(cè)定

Assay

1、原理：在酸性溶液中，以淀粉為指示劑，用碘液直接滴定。（一）碘量法(

Iodimetry)ChP2010H+

取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6。2、方法3、討論（1）新沸冷H2O：減少水中溶解的O2（2）酸性環(huán)境：減慢VitC被O2氧化速度（3）立即滴定：減少O2的干擾（4）附加劑干擾的排除片劑——滑石粉——過濾注射劑——抗氧劑——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5

OaS3aSO+H2NHON225HCHOOHH2CSO3Na（二）2，6-二氯靛酚鈉滴定法

(2,6-dichloroindophenoltitration)原理1、去氫抗壞血酸＋酚亞胺VitC＋2,6—二氯靛酚自身指示終點(diǎn)法終點(diǎn)由無(wú)色到玫瑰紅色方法2、終點(diǎn)：溶液顯玫瑰紅色，并持續(xù)5秒不褪色。討論3、（1）酸性環(huán)境：穩(wěn)定VitC（2）快速滴定2min內(nèi)：防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）2,6—二氯靛酚滴定液不穩(wěn)定，儲(chǔ)備液不宜超過一周。（4）專屬性較碘量法高，多用于制劑的含量測(cè)定。如：USP32、JP15

維生素A1、掌握維生素A的三點(diǎn)校正紫外分光光度法；2、熟悉維生素A的三氯化銻反應(yīng)及其比色法；維生素B13、掌握維生素B1的硫色素反應(yīng)；了解維生素B1的硫色素?zé)晒夥?、熟悉維生素B1的非水滴定法及片劑與注射劑的紫外分光光度法的測(cè)定原理、含量％、標(biāo)示量％的計(jì)算方法；維生素C6、掌握維生素C的碘量法；7、熟悉維生素C的鑒別試驗(yàn)方法和2，6—二氯靛酚滴定法原理；8、了解維生素C的雜質(zhì)檢查項(xiàng)目；維生素E9、熟悉維生素E的鑒別試驗(yàn)方法、雜質(zhì)游離生育酚檢查原理與限度％計(jì)算法；小節(jié)1.維生素B1的鑒別方法是：A.三氯化鐵反應(yīng)B.硫色素反應(yīng)C.柯柏反應(yīng)D.與堿性酒石酸銅試液反應(yīng)E.雙縮脲反應(yīng)練習(xí)與思考[A型題]2.下列藥物的堿性溶液，加入鐵氰化鉀后，再加正丁醇，顯藍(lán)色熒光的是：A.維生素AB.維生素B1

C.維生素CD.維生素DE.維生素E3．既具有酸性又具有還原性的藥物是：A.維生素AB.咖啡因C.苯巴比妥D.氯丙嗪E.維生素C4．在三氯醋酸或鹽酸存在下，經(jīng)水解、脫羧、失水后，加入吡咯即產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物的藥物應(yīng)是A.氯氮卓B.維生素AC.普魯卡因D.鹽酸嗎啡E.維生素C5：測(cè)定維生素C注射液的含量時(shí)，在操作過程中要加入丙酮，這是為了A.保持維生素C的穩(wěn)定B.增加維生素C的溶解度C.使反應(yīng)完全D.加快反應(yīng)速度E.消除注射液中抗氧劑的干擾[B