第十四章、顯微攝影(2015.10.19)

第十四章

顯微攝影技術(shù)

(photomicrography)組織胚胎學(xué)教研室周莉

顯微攝影技術(shù)

什么是顯微攝影技術(shù)？是指利用顯微照相裝置把顯微鏡下觀察到的圖像拍攝下來制成照片，長期保存研究結(jié)果，以便進(jìn)一步研究和交流。2.為什么要學(xué)習(xí)顯微攝影技術(shù)？

一是要保存研究結(jié)果；二是要真實(shí)地記錄研究結(jié)果。第一節(jié)攝影基礎(chǔ)顯微攝影是攝影學(xué)的一個(gè)分支，其基本原理相同，方法也有相似之處。故首先學(xué)習(xí)攝影的基礎(chǔ)知識(shí)。一、照相機(jī)鏡頭和成像原理鏡頭是照相機(jī)的關(guān)鍵部件，最早的照相機(jī)沒有鏡頭。1839年由巴黎的達(dá)蓋爾(Daguerre)利用顯影的概念發(fā)明了攝影術(shù)。照相機(jī)鏡頭和成像原理鏡頭的透鏡片組鏡頭成像原理圖（一）鏡頭的焦距（focallength)

從鏡頭的中心點(diǎn)到形成清晰影像的膠片或數(shù)碼CCD之間的距離。以F等于某數(shù)來表示，如F=50意旨50毫米焦距的鏡頭。（二）鏡頭的有效孔徑

即鏡頭的最大光圈（光圈是安裝在鏡頭上，用于控制光線的孔徑光闌），是表示鏡頭最大進(jìn)光量的參數(shù)，其大小與鏡頭的最大直徑和焦距有關(guān)。

最大光孔直徑（25mm）1：2，F(xiàn)2

焦距（50mm）最大光孔直徑（35mm）1：1.4，F(xiàn)1.4焦距（50mm）(三）鏡頭的視角一般來說，相機(jī)的膠片和CCD的大小是固定的，因此視角大小有鏡頭的焦距長度所決定，焦距越短，視角越大，焦距越長，視角越小。焦距的長短決定視角的大?。ㄋ模┚吧钆c焦深概念：是指拍攝對(duì)象的最近清晰點(diǎn)至最遠(yuǎn)清晰點(diǎn)之間的范圍。

前景深：被攝物前的一段清晰范圍；

后景深：被攝物后的一段清晰范圍；景深：前景深加后景深。景深受三個(gè)因素影響：光圈的大小，鏡頭焦距的長短，物距遠(yuǎn)近。景深長景深短虛化背景（景深短）（五）鏡頭的種類根據(jù)相機(jī)鏡頭的焦距長短及其與膠片畫幅的對(duì)角線長度的關(guān)系，將鏡頭分為標(biāo)準(zhǔn)鏡頭、廣角鏡頭、遠(yuǎn)攝鏡頭和中焦鏡頭等。1.標(biāo)準(zhǔn)鏡頭焦距約等于拍攝膠片畫幅對(duì)角線的長度，換言之，覆蓋135膠片（24mm×36mm)大小的影像所需的焦距鏡頭，稱標(biāo)準(zhǔn)鏡頭，為50mm，視角43°。鏡頭焦距越長，產(chǎn)生覆蓋膠片的影像就越大。焦距焦點(diǎn)距離2.廣角鏡頭：焦距短于膠片對(duì)角線的鏡頭，其焦距短于標(biāo)準(zhǔn)鏡頭，視場(chǎng)角度大，135相機(jī)的廣角鏡頭焦距一般為17mm-35mm，視角越大，景深也隨之增大。3.遠(yuǎn)攝鏡頭又稱長焦距鏡頭，焦距長于底片對(duì)角線的鏡頭，焦距長于200mm以上，視角在8度以下。4.中焦距鏡頭又稱“肖像鏡頭”焦距在80-135mm,小于85mm的鏡頭拍攝，肖像容易變形，而大于135mm的鏡頭拍攝肖像容易產(chǎn)生面部扁平，只有用中焦距鏡頭拍攝，才逼真和自然。

照相機(jī)鏡頭種類與焦距焦距在攝影中的功能1.對(duì)被攝物的調(diào)焦，決定于照片的清晰度；2.焦距的長短決定視角的大??；3.景物影像的大??；4.景深的長短；5.影像變形的程度。二、感光膠片（Film)

是通過相機(jī)的光學(xué)鏡頭把拍攝的景物在感光乳膠上記錄下來，感光乳劑隨著光線的強(qiáng)弱發(fā)生不同變化而產(chǎn)生“潛影”，再通過沖洗，潛影就轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姷挠跋瘛８泄馊閯┑闹饕煞謺r(shí)鹵化銀和明膠。黑白膠片最后形成的影像由金屬顆粒構(gòu)成，彩色膠片形成的影像由染料構(gòu)成。

1.感光度（sensitivity)

是膠片的感光速度，即膠片對(duì)光線照射時(shí)的反應(yīng)能力。感光度高，鹵化銀顆粒較大，吸收光線的能力強(qiáng)，反之，感光度低，鹵化銀顆粒較小，吸收光線的能力弱，所以，感光度的高低取決于膠片乳劑的制備和加工工藝。在光線較弱的環(huán)境下拍攝，常使用高感光度膠片。但是，感光度高的膠片產(chǎn)生的影像顆粒較大，質(zhì)感欠細(xì)膩和反差??；而低感光度膠片產(chǎn)生的影像顆粒較細(xì)，反差較大，所形成的影像質(zhì)感細(xì)膩。感光度的表示法：美國的“ASA制”，德國的“DIN制”，中國的“GB制”，后兩者表示的感光度數(shù)值相同，國際標(biāo)準(zhǔn)感光度（1980）用ISO表示：ISO100/21°，200/24°，400/27°。三、反差照片中不同部分的明暗差別程度稱反差，明暗對(duì)比強(qiáng)烈，則反差大，反之，則反差小。被攝物各部分的亮度差和色彩飽和度直接影響反差的大小。

反差小反差大曝光不足與曝光過度的比較

曝光不足曝光過度四、曝光控制

欲得到理想的照片曝光是關(guān)鍵，影響曝光因素有三個(gè)：光圈、快門和膠片感光度。前兩者決定進(jìn)入光線的多少，后者決定于膠片對(duì)光線的反應(yīng)速度。（一）光圈（Aperture）由若干金屬薄片組成，安裝在鏡頭內(nèi)部，可均勻地自由開合，以調(diào)節(jié)鏡頭的相對(duì)口徑，控制進(jìn)光量。一般來說，相機(jī)采用光圈系數(shù)表示口徑的大小。光圈系數(shù)（f系數(shù)）：標(biāo)志鏡頭的相對(duì)口徑系數(shù)英國制：f2、f2.8、f4、f5.6、f8、f11、f16、f22、f32等。數(shù)字越大，光圈越小，可用“2n”計(jì)算任意兩檔光圈進(jìn)光量的倍率關(guān)系，n為兩檔之間相差的檔數(shù)，如f2與f8相差4檔，24=16即f2進(jìn)光量是f8的16倍。

調(diào)節(jié)景深，光圈小，景深長，光圈大，景深短；調(diào)節(jié)焦點(diǎn)深度；調(diào)節(jié)反差，光圈小，反差大，光圈大，反差?。?。最佳光圈：鏡頭的分辨率和影像反差均處于最佳狀態(tài)，一般來說，把鏡頭的最大光圈收縮三檔為該鏡頭的最佳光圈。最大光圈是f2，收縮三檔，最佳光圈是f5.6

2、2.8、4、5.6、8、11、16光圈的幾個(gè)其他作用

大光圈可虛化背景小光圈的應(yīng)用（二）快門

（Shutter）

快門：是光圈的開啟時(shí)間,用來控制膠片曝光時(shí)間長短的裝置?？扉T的開啟時(shí)間長短與曝光量的多少成正比。用某些數(shù)字的倒數(shù)秒來表示，如1/30秒、1/60秒、1/125秒等。

f系數(shù)與快門之間存在一種倒易率關(guān)系，即如果快門速度降低，光圈必須縮小，才能獲得等量的曝光。下面的組合會(huì)產(chǎn)生完全相同的膠片曝光量：f16與1/30;f11與1/60;f8與1/125;f5.6與1/250;f4與1/500。從曝光均勻這一意義來講，用小光圈慢速度，比用大光圈快速度為好。從快門本身性質(zhì)來講，也是慢速度比快速度好。理想的快門速度：1/60-1/100秒。如何選擇一組合適的光圈和快門速度組合？依據(jù)不同的需要：1.景深的需要（使用光圈優(yōu)先）；2.撲捉運(yùn)動(dòng)物體的影像，使其不動(dòng)或使其有動(dòng)感。

（使用快門優(yōu)先）機(jī)械快門與電子快門：

快速快門慢速快門-1慢速快門-2慢速快門-3五、色溫

(colortemperature)色溫:是指色質(zhì)，即白光的程度。所謂白光，就是日光、燈光、天空光等。攝影所用的光源有色溫，彩色膠片中的感光乳劑對(duì)色溫有一定要求,彩色膠片一般分兩類：即日光片與燈光片。日光片適合于5400K(±1200)的色溫下拍照，而燈光片適合于3200K(±700)下拍照。如何求得色溫平衡？如何利用色溫不平衡？利用低色溫拍照利用高色溫拍照B門曝光六、濾色鏡的應(yīng)用(filter)（一）原色光和補(bǔ)色光指光的三原色，即紅、綠、藍(lán)。

補(bǔ)色光：攝影學(xué)光的三原色中，兩種色等量相混得出一個(gè)新的顏色，稱為補(bǔ)色。紅加綠等于黃；藍(lán)加綠等于青；紅加藍(lán)等于品紅；同樣，有時(shí)將三原色與三補(bǔ)色相互對(duì)應(yīng)的顏色稱互補(bǔ)色，即：綠與品紅為互補(bǔ)色；黃與藍(lán)為互補(bǔ)色；紅與青為互補(bǔ)色。三原色和互補(bǔ)色三原色：紅、綠、藍(lán)三補(bǔ)色：黃、青、品紅互補(bǔ)色：綠與品紅，黃與藍(lán)，紅與青（二）濾色鏡的特性1.吸收補(bǔ)色；藍(lán)色濾色鏡吸收黃色2.限制補(bǔ)色鄰近色;藍(lán)色濾色鏡限制紅色3.通過相同色。(三)濾色鏡在攝影中的應(yīng)用1.校正顏色對(duì)比

2.調(diào)整反差：與被攝物顏色互補(bǔ)的濾色鏡可使反差加大。3.消除或突出某種顏色4.校正色溫的作用：如光的色溫與底片色溫不相符，可用濾色鏡校正。濾光鏡的特性（通過相同色）校正色溫（用日光片在燈光下拍照）中灰漸變鏡和偏振光鏡第二節(jié)顯微攝影基本方法一、顯微鏡的幾何光學(xué)成象原理照明光源聚光鏡聚焦物鏡目鏡（入射光）（聚焦到標(biāo)本上）（焦平面）

（聚焦）普通顯微鏡與特殊顯微鏡傳統(tǒng)顯微攝影與數(shù)碼顯微攝影

放大再放大一、物鏡與目鏡的選用

物鏡的分辨率就是顯微鏡的分辨率，目鏡與顯微鏡的分辨率無關(guān)；故物鏡是衡量一臺(tái)顯微鏡成像質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。

（一）物鏡的選用以分辨率為首選指標(biāo)，數(shù)值孔徑的大小決定物鏡的分辨率，數(shù)值孔徑越大，分辨率越高，但大于40倍的物鏡，其景深范圍較小，不能拍攝到標(biāo)本全層。

物鏡種類很多，根據(jù)物鏡像差校正程度可分為全復(fù)消色差物鏡、半復(fù)消色差物鏡和消色差物鏡。全復(fù)消色差物鏡可將可見光譜中的紅、綠、黃聚焦于一點(diǎn)改善球差和像差；平場(chǎng)物鏡可校正像場(chǎng)彎曲，不存在視野中心與邊緣不同時(shí)聚焦的現(xiàn)象。故平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡的成像質(zhì)量最好?？筛鶕?jù)實(shí)際需要選用合適的物鏡。（二）目鏡的選用

目鏡的作用是把物鏡映來的的影像進(jìn)一步放大，同時(shí)矯正物鏡成像中的像差和色差。

物鏡的標(biāo)識(shí)（三）聚光鏡（condenser）聚光鏡的其作用在于將光源發(fā)散的光，有效地產(chǎn)生與物鏡相適應(yīng)的光束，造成一個(gè)明亮而又均勻的視場(chǎng)。它同時(shí)也影響分辨率、對(duì)比度、景深和光亮度，而這些因素又直接影響顯微成像質(zhì)量。聚光鏡的種類：1．阿貝聚光鏡2．消色差聚光鏡：不適用于4倍以下的低倍物鏡，否則照明光源不能充滿整個(gè)視場(chǎng)。3．旋出式聚光鏡

二、光路合軸攝影前應(yīng)檢查照明光源與顯微鏡光軸是否在一條直線上，方法：注意整個(gè)視野的光亮度是否一致，如不一致，需光路合軸。方法如下：（1）聚光器升到最高，4倍物鏡，視場(chǎng)光闌收縮到最小，調(diào)節(jié)聚光器至視野中視場(chǎng)光闌邊緣清晰；（2）轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器兩個(gè)調(diào)中螺旋桿將收縮的視場(chǎng)光闌圖像調(diào)至視野中心。三、光闌的調(diào)節(jié)

顯微鏡有孔徑光闌和視場(chǎng)光闌兩種，物鏡的數(shù)值孔徑與聚光鏡的數(shù)值孔徑相等時(shí)，物鏡的分辨率最高。聚光鏡的數(shù)值孔徑受孔徑光闌的控制。（一）孔徑光闌的調(diào)節(jié)位于聚光鏡的透鏡組之間，顯微攝影的影像反差和景深可隨孔徑光闌的縮小而提高，當(dāng)孔徑光闌小于物鏡的數(shù)值孔徑時(shí)，影像的反差和景深提高，影像更加清晰。所以當(dāng)孔徑光闌調(diào)整至物鏡數(shù)值孔徑的60%-80%時(shí)能獲得良好的顯微圖像?？讖焦怅@與視場(chǎng)光闌（二）視場(chǎng)光闌的調(diào)節(jié)

在正置顯微鏡，視場(chǎng)光闌位于鏡座之中，用于控制照明光束的直徑，即控制照野，提高顯微圖象的清晰度。

視場(chǎng)光闌的調(diào)節(jié)方法：將視場(chǎng)光闌收縮到最小位置，在標(biāo)本平面中心處看到一個(gè)呈正多邊形的光斑，此為視場(chǎng)光闌的圖像。將其開到比取景框略大的位置為好。五、曝光補(bǔ)償顯微鏡攝影裝置均有自動(dòng)測(cè)光和自動(dòng)曝光裝置，只要正確輸入膠片的感光度一般都能獲得正確曝光。但是，當(dāng)背景過亮或背景過暗，標(biāo)本面積過小時(shí)，依據(jù)自動(dòng)曝光裝置將會(huì)曝光不足或曝光過度。在這兩種極端情況下，需使用曝光補(bǔ)償。方法：

-3-2-10123曝光補(bǔ)償?shù)膽?yīng)用閃光燈的應(yīng)用（近距離時(shí)）熒光顯微鏡曝光補(bǔ)償?shù)膽?yīng)用

曝光過度使用曝光補(bǔ)償減少曝光量后六、顯微攝影的基本步驟

（一）顯微鏡的使用環(huán)境

1.遠(yuǎn)離動(dòng)源；

2.室內(nèi)光線不能太亮；

3.防塵、防潮、防霉。（二）攝影前準(zhǔn)備

1．光路合軸調(diào)節(jié)

；

2．柯勒照明調(diào)節(jié)

使觀察的視野獲得均勻而又充分的照明；

3．物鏡與目鏡合理組合

4．色溫的設(shè)定：將中灰濾色鏡（ND）、色溫平衡濾色鏡（NCB）放入光路中；5．瞳距及屈光度的調(diào)節(jié)：使左右兩個(gè)視場(chǎng)合二為一；7．觀察時(shí)的調(diào)節(jié)（1）將欲觀察標(biāo)本置于載物臺(tái)上，使選用的物鏡進(jìn)入光路，并對(duì)標(biāo)本對(duì)焦；（2）調(diào)整聚光鏡，并按上一步驟對(duì)視場(chǎng)光闌進(jìn)行調(diào)節(jié)；（3）將孔徑光闌縮至物鏡數(shù)值孔徑的60%～80%。8．調(diào)焦和取景（一）倍數(shù)表示法（二）比例尺表示法（scalebar)Bar=20μm八、顯微照片放大倍數(shù)的計(jì)算第三節(jié)數(shù)碼顯微攝影技術(shù)

數(shù)碼顯微攝影是用數(shù)碼相機(jī)替代傳統(tǒng)的膠片相機(jī)進(jìn)行顯微鏡下攝影的一種方法。一、數(shù)碼攝影基礎(chǔ)

傳統(tǒng)攝影是靠膠片上銀鹽的光化學(xué)反應(yīng)來記錄通過光學(xué)鏡頭的影像，而數(shù)碼攝影是將通過光學(xué)鏡頭的影像信號(hào)轉(zhuǎn)化為可由電腦處理的數(shù)碼信息（即數(shù)字信息）。它記錄影像不使用膠片，而采用CCD等影像傳感器來接受影像信號(hào)。（一）影像傳感器1.CCD是光電耦合元件（ChargeCoupledDevice）的簡(jiǎn)稱，具有光電轉(zhuǎn)換功能。成像原理：CCD是由數(shù)百萬只微型光電二極管感光組件構(gòu)成，通常排列成小面積的長方形，在CCD上每一只光電二極管感受投射到它表面的光線強(qiáng)度，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，產(chǎn)生電荷。光強(qiáng)弱不同，產(chǎn)生的電荷也不同。所以，每只光電二極管感受不同的光線強(qiáng)度，產(chǎn)生不同的電荷。2.CMOSCMOS（ComplementMetalOxideSemiconductor）,意為“互補(bǔ)性氧化金屬半導(dǎo)體”。是計(jì)算機(jī)內(nèi)重要記憶芯片，也可加工成數(shù)碼相機(jī)的感光元件。CMOS的集成度高，可以把許多電路集成在單一芯片上，例如，信號(hào)處理、模/數(shù)轉(zhuǎn)換、放大電路、時(shí)鐘驅(qū)動(dòng)等，而這些在CCD的數(shù)碼相機(jī)上均為分離的芯片。因而，CMOS成本低，耗電少。CMOS的主要缺點(diǎn)，一是噪音較大，易在數(shù)碼影像上引起雜點(diǎn)；二是敏感性較低，影響“ISO感光度”的提高。（二）影像傳感器像素

CCD或CMOS上每一個(gè)光敏單元對(duì)應(yīng)圖像中的一個(gè)點(diǎn)，這個(gè)點(diǎn)即為像素（pixed),是形成影像的最小單位。像素的多少?zèng)Q定于數(shù)碼相機(jī)的分辨率，是表示相機(jī)檔次的主要依據(jù)之一。但并不是唯一標(biāo)準(zhǔn)。表示方法：①陳列表示法：即“橫、縱像素的乘積”，例如，像素640×480，像素1024×768；②總量表示法：如像素100萬，300萬等。

內(nèi)插值只是將CCD的像素總量通過某種軟件進(jìn)行一定程度的軟化模糊處理，再在影像相同部位的空隙進(jìn)行填充來增加像素。這種經(jīng)內(nèi)插處理后，CCD本身像素并沒有改變，也不能從根本上提高影像的最終質(zhì)量。例如，CCD本身像素300萬，經(jīng)“內(nèi)插”標(biāo)稱像素總量達(dá)到500萬。這種500萬的內(nèi)插值與本身具有500萬像素的CCD質(zhì)量不能等同。

（三）相當(dāng)感光度此概念并非完全指它對(duì)光線的敏感性能。拍攝時(shí)影像傳感器產(chǎn)生的信號(hào)在進(jìn)行模/數(shù)轉(zhuǎn)換前需要進(jìn)行放大，當(dāng)提高數(shù)碼相機(jī)感光度拍攝時(shí)，圖象傳感器輸出的信號(hào)并未改變，只是改變了信號(hào)的放大倍率，實(shí)際上并未影響到影像傳感器本身。使用方法與傳統(tǒng)相機(jī)相同，在熒光顯微鏡攝影時(shí)常用，一般調(diào)節(jié)到ISO200以上。當(dāng)ISO過大時(shí)，會(huì)引起過多的“噪聲”，表現(xiàn)為雜點(diǎn)增多。（四）白平衡

白平衡功能是一種針對(duì)不同光照環(huán)境的顏色糾正功能，是讓白色的物體在不同光照環(huán)境下依然呈現(xiàn)白色的功能。它的作用類似傳統(tǒng)相機(jī)彩色攝影中校正色溫濾光鏡，用以獲取準(zhǔn)確的色彩還原。數(shù)碼相機(jī)有自動(dòng)（2500-6500K)、自定義與手動(dòng)白平衡功能。（五）數(shù)碼圖片數(shù)碼圖片的主要指標(biāo)（1）圖片大?。簣D像尺