農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化的機(jī)制及影響轉(zhuǎn)化效率的因素范文參考

PAGEPAGE5/5下載文檔可編輯二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化的機(jī)制及影響轉(zhuǎn)化效率的因素轉(zhuǎn)化機(jī)制：與植物基因轉(zhuǎn)化有關(guān)的農(nóng)桿菌有兩種類型：根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens ）和 發(fā)根農(nóng) 桿 菌（ Agrobacteriumrhizogenes 。根癌農(nóng)桿菌含有 Ti 質(zhì)粒。發(fā)根農(nóng)桿菌含有 Ri 質(zhì)粒。根癌農(nóng)桿菌的 Ti 質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌 Ri 質(zhì)粒都具有一段轉(zhuǎn)移 DNA(transfer又稱T-DNA在農(nóng)桿菌侵染植物時(shí)，T-DNA可以插入到植物基因組中，使其攜帶的基因在植物中得以表達(dá)。由于 T-DNA能夠進(jìn)行高頻率的轉(zhuǎn)移，而且Ti 質(zhì)粒和Ri 質(zhì)粒上可插入大到甚至 150kb的外源基因，因此粒和Ri 質(zhì)粒成為植物基因轉(zhuǎn)化中的理想載體系統(tǒng)。與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因與轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因主要包括農(nóng)桿菌染色體上的基因和 Ti 質(zhì)粒上以外Vir 區(qū)的基因。染色體基因包括 、、att 、、chvD以及。它們大多編碼一些膜相關(guān)蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)菌向植物受傷細(xì)胞趨化移動(dòng)和幫助細(xì)菌附著于植物受傷細(xì)胞上。 ChvD蛋白可能在低 pH和磷酸饑餓情況下提高 VirG蛋白的合成水平。ChvE與VirA蛋白共同對 virG起激活作用。原始的Ti質(zhì)粒根據(jù)其功能的不同，可分為4個(gè)區(qū)：（區(qū)：是在農(nóng)桿菌侵染細(xì)胞時(shí)，從 Ti 質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物基因組中的一段 其攜帶的基因與腫瘤的形成有關(guān)， 但與T-DN本身轉(zhuǎn)移與整合無關(guān)。 T-DNA上最重要的是兩端的 2個(gè)邊界(LB和它們是轉(zhuǎn)移所必需的。只要其存在， 可以將攜帶的任何基因轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中， T-DNA的右邊界在 的整合中對于靶 位點(diǎn)的識(shí)別具有重要作用 ，因此，尤以右邊界更為重要．）毒性區(qū)：位于 以外的 1個(gè)30~40kb 的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)段編碼的基因但對 的轉(zhuǎn)移和整合非常重要．這些基因也稱為 Ti 質(zhì)粒編碼毒基因(vir) 。）接合轉(zhuǎn)移區(qū)： 該區(qū)段存在有與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因 (tra) ，調(diào)控Ti 質(zhì)粒在農(nóng)桿菌間轉(zhuǎn)移。）復(fù)制起始區(qū)：該區(qū)段調(diào)控 Ti 質(zhì)粒的自我復(fù)制。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中除了Ti 質(zhì)粒上的基因參與外，還有農(nóng)桿菌染色體基因。染色體基因包 、att 、、chvD以及 。它們大多編碼一些膜相關(guān)蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)菌向植物受傷細(xì)胞趨化移動(dòng)和幫助細(xì)菌附著于植物受傷細(xì)胞上。延伸因子P對于農(nóng)桿菌的生長非常重要， 但非必需 高水平的糖結(jié)合蛋白一 ChvE可以擴(kuò)大VirA蛋白對酚類物質(zhì)的識(shí)別范圍。結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)體類似物蛋白Vir區(qū)基因的表達(dá)調(diào)控，chvD基因座中插入無啟動(dòng)子的lacZ，農(nóng)桿菌侵染力以及Vir區(qū)基因表達(dá)量大大下降，突變體中virG組成型表達(dá)侵染力則得以恢復(fù)，這一現(xiàn)象說明ChvD通過影響virG制毒性。Vir 基因的誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制在植物受到創(chuàng)傷后，創(chuàng)傷組織的細(xì)胞釋放出創(chuàng)傷信號(hào)——酚類化合物，如乙酰丁香酮。當(dāng)農(nóng)桿菌接受到此類信號(hào)時(shí)，其 vir 區(qū)基因可被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。另一類誘導(dǎo)化合物是組成植物細(xì)胞壁的一些特異單糖， As和單糖可協(xié)同誘導(dǎo)Ti 質(zhì)粒上vir 區(qū)基因的表達(dá)。Vir 區(qū)基因的活化首先是從 virA 基因始的。VirA 蛋白是一種結(jié)合在膜上的化學(xué)受體蛋白，可直接對植物產(chǎn)生的酚類化合物感應(yīng)，其感應(yīng)部位可能位于胞質(zhì)區(qū)域。 VirA 蛋白的胞質(zhì)區(qū)域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG 蛋白活化。VirG 蛋白是DNA結(jié)合活化蛋白，可以以二體或多體形式結(jié)合到 vir 啟動(dòng)子的特定區(qū)域，從而成為其它 vir 基因轉(zhuǎn)錄的激活因子， 打開VirBvirCvirDvirEvirH等幾個(gè)基因。ChvE可大大增強(qiáng) vir 基因被 As誘導(dǎo)的效果，ChvE可結(jié)一些單糖，也可直接與 VirA 周質(zhì)區(qū)相互作用，以加強(qiáng)As對Vir 基因的導(dǎo)。T-DNA復(fù)合物的形成T-DNA的加工與轉(zhuǎn)移是由 Vir 基因被誘導(dǎo)后產(chǎn)生的蛋白完成。 VirD基因編碼的兩個(gè)產(chǎn)物 VirD1 和VirD2 直接參與加工過程。 VirD1 蛋白是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶，可將超螺旋型 A變成松弛型 。VirD2 蛋白具有特異剪切單鏈DNA的內(nèi)切酶活性，它可以識(shí)別 T-DNA底鏈邊界重復(fù)序列上的特定位點(diǎn)，并在底鏈 24bp 重復(fù)序列和第四個(gè)堿基之間切割，將 T-DNA從Ti 質(zhì)粒上剪切下來，稱為 T-strand 或T-鏈。切開 T-DNA后，VirD2 蛋白與T-鏈的5，端共價(jià)結(jié)合，避免核酸外切酶降解 T-鏈。新的 T-DNA底鏈以此鏈為模板，從右端產(chǎn)生的 DNA缺口處以 5’-方向進(jìn)行合成。被取代的舊鏈游離出來，與許多 VirE2 蛋白分子結(jié)合組成 T-DNA復(fù)合體。此外，VirD2 為一個(gè)導(dǎo)向蛋白，可以指導(dǎo)整個(gè) T-DNA復(fù)合體（或叫 T-復(fù)合體）從農(nóng)桿菌進(jìn)入到植物細(xì)胞核。T-DNA復(fù)合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)農(nóng)桿菌的 T-DNA轉(zhuǎn)移通道由多達(dá) 12種蛋白組成，包括兩個(gè)主要部分：纖毛附屬絲（或纖毛）和膜結(jié)合復(fù)合體。該通道也可稱為 T-復(fù)合體運(yùn)輸器，由virB 編碼的 11 種蛋白和 VirD4 蛋白組成。VirB1 可在細(xì)菌膜上為 復(fù)合體運(yùn)輸器的裝備提供位點(diǎn)； VirB2 和VirB5 可被移動(dòng)到細(xì)胞表面形成纖毛；其余的 VirBVirD4 為T-復(fù)合體的運(yùn)輸提供能量。合成的 T-復(fù)合經(jīng)過 T-復(fù)合體運(yùn)輸器，以類似于細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的方式注射到植物細(xì)胞內(nèi)，并在 VirD2 和VirE2 的核定位信號(hào)（ 序列引導(dǎo)下，以 VirD2 為先向植物細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)。在人工構(gòu)建的質(zhì)粒中， vir 基因和 T-DNA可以放在同一個(gè)質(zhì)粒上，也可以放在不同的質(zhì)粒上。影響轉(zhuǎn)化效率的因素1、菌株染色體背景不同農(nóng)桿菌株的類型的 chv 基因決定了其對受體細(xì)胞的識(shí)別和附著能力差異。根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿型和琥珀堿型生長快、不結(jié)球，轉(zhuǎn)化易于操作，但共培養(yǎng)時(shí)菌體附著能力較差：章魚堿型則生長慢、易結(jié)球，轉(zhuǎn)化難于操作，但共培養(yǎng)時(shí)菌體附著后不易洗去。2、 共培養(yǎng)方式農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)介質(zhì)可以是細(xì)菌培養(yǎng)基或植物受體培養(yǎng)基。煙草等對農(nóng)桿菌侵染比較敏感的植物的共培養(yǎng)時(shí)間一般較短，液體細(xì)菌培養(yǎng)基介質(zhì)應(yīng)用較多。許多單子葉植物等不敏感植物受體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間一般較長，用細(xì)菌培養(yǎng)介質(zhì)容易造成農(nóng)桿菌過度繁殖，導(dǎo)致植物外植體呼吸作用抑制和細(xì)菌分泌物毒害，因此多采用液體植物培養(yǎng)基作為共培養(yǎng)介質(zhì)。3、侵染濃度和時(shí)間農(nóng)桿菌適宜的侵染濃度和時(shí)間因外植體對侵染的敏感性不同而有很大差農(nóng)桿菌附著不足。禾谷類作物一般侵染濃度較高，Hiei 用LBA4404(pTOK233)轉(zhuǎn)化水稻的最佳接種濃度為 Ishida 用LBA4404(pSB131)轉(zhuǎn)化玉米幼胚采用的侵染濃度為 但煙草、大白菜等對侵染敏感的雙子葉植物要求菌體濃度要低的多 ,一般為 OD600=。4、共培養(yǎng)條件共培養(yǎng)溫度農(nóng)桿菌在℃的范圍內(nèi)都可以生長，不同研究結(jié)果中vir區(qū)基因表達(dá)的適宜溫度有一定差異，但多數(shù)在[]。外植體生長溫度也一般在此范圍內(nèi)，所以通常選取外植體的最佳生長溫度為共培養(yǎng)溫度，通常在25℃左右。共培養(yǎng)值 研究人員普遍認(rèn)為酸性培養(yǎng)環(huán)境有利于農(nóng)桿菌的侵染因?yàn)橹参锛?xì)胞釋放的對農(nóng)桿菌有趨化作用的化學(xué)物質(zhì)（如酚類、糖類）雖然在不同酸堿度下比較穩(wěn)定，但在 pH=5.0~5.8時(shí)對vir 基因的誘導(dǎo)能力高。） 誘導(dǎo)物和抑制物 酚類是 vir 區(qū)基因表達(dá)的主要信號(hào)物質(zhì)。酚類物強(qiáng)的促進(jìn)效果與菌株類型、植物材料種類和共培養(yǎng)培養(yǎng)基的 pH值有關(guān)沒食子酸、二羥基苯甲酸、香草酚、兒茶酚、對羥基苯酚等多酚混合處理農(nóng)桿菌也有很高的作用，但不同酚類物質(zhì)是否有累加效應(yīng)在不同研究結(jié)果中不近相同。不同農(nóng)桿菌類型對酚類物質(zhì)的敏感性不同，根癌農(nóng)桿菌的章魚堿株系比胭脂堿系需要更高的酚類物質(zhì)誘導(dǎo)，發(fā)根農(nóng)桿菌的農(nóng)桿堿型比甘露堿型對酚類物質(zhì)刺激的敏感性更低。糖類等小分子,這些小分子一方面可作為化學(xué)源吸引農(nóng)桿菌的趨化運(yùn)動(dòng),另一方面可誘導(dǎo)或抑制農(nóng)桿菌vir農(nóng)桿菌染色體毒性蛋白 結(jié)合,激活virA 蛋白進(jìn)而誘導(dǎo) vir 基因高水平表達(dá)和擴(kuò)大農(nóng)桿菌的寄主范圍。特別在 AS濃度很低的情況下 ,它們可強(qiáng)烈誘導(dǎo) vir 基因的表達(dá),并且與 AS存在協(xié)同效應(yīng),可顯著提高 AS誘導(dǎo)效果糖類在不含酚類化合物的情況下效果較明顯 ,但是糖類和酚類化合物同時(shí)存在時(shí)卻沒有明顯的協(xié)同效應(yīng)。多胺也參與植物宿主和病原之間的相互作用。 Kumar等曾用多胺物質(zhì)對農(nóng)桿菌進(jìn)行活化后侵染煙草做 瞬時(shí)表達(dá)研究,結(jié)果表明農(nóng)桿菌的侵染力顯著提高。）共培養(yǎng)時(shí)激素的添加、有無光照共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加生長素、細(xì)胞分裂素對轉(zhuǎn)化更有利。而光照的有無要是植物種類而異。5、受體類型和生理狀態(tài)不同基因型對農(nóng)桿菌侵染敏感性有差異。目前用過的受體材料有葉盤、葉柄、根尖根段、莖尖莖段、幼穗、花藥、子葉（柄） 、胚或其部分結(jié)構(gòu)（軸、芽等，可以看出分生組織是較通用的受體。分生能力強(qiáng)的植物細(xì)胞對農(nóng)桿菌敏感，活躍的細(xì)胞分裂促進(jìn)了 T-DNA的整合。6、預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基外植體進(jìn)行共培養(yǎng)前 ,在含有外源激素的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間 ,使植組織代謝活躍,促進(jìn)細(xì)胞分裂,分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源 從而提外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化率。有人認(rèn)為 ,在預(yù)培養(yǎng)時(shí)降低鈣的含量會(huì)促進(jìn)農(nóng)桿菌的侵染。鈣在對致病微生物抵抗方面起到重要作用 ,而鈣的不足會(huì)引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變 ,這種改變使農(nóng)桿菌更容易附在愈傷上 ,增強(qiáng)農(nóng)桿菌對愈傷的感染能力。7、 接種方式比較常用的接種方式是將外植體置于侵染液中浸泡 ,時(shí)間長短視菌種和外PAGEPAGE6/5下載文檔可編輯植體種類而異。有的研究者在浸泡的基礎(chǔ)上結(jié)合了振蕩進(jìn)行接種，振蕩培養(yǎng)能打破細(xì)胞表面的氣泡,使農(nóng)桿菌與外植體的接觸面增大侵染。近年來,在提高遺傳轉(zhuǎn)化效率方面發(fā)展了一些新技術(shù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、負(fù)壓與農(nóng)桿菌介導(dǎo)結(jié)合法以及基因槍與農(nóng)桿菌介導(dǎo)結(jié)合法等,均可增強(qiáng)農(nóng)桿菌浸染 ,提高轉(zhuǎn)化效8、 感受態(tài)細(xì)胞保存條件有實(shí)驗(yàn)表明，農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞以新鮮制備時(shí)效果較好，農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞在4℃保存7d以內(nèi)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化可以得到部分轉(zhuǎn)化子，而用甘油保存置于-20℃和-58進(jìn)行優(yōu)化。另外，植物基因型、靶細(xì)胞生理狀態(tài)及對轉(zhuǎn)化植株的篩選程序、外植體處理、合適的再生篩選體系等因素也會(huì)對轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響。（1 總則1.1 為了加強(qiáng)公司的環(huán)境衛(wèi)生管理，創(chuàng)造一個(gè)整潔、文明、溫馨的購物、辦公環(huán)境，根據(jù)《公共場所衛(wèi)生管理?xiàng)l例》的要求，特制定本制度。1.2 集團(tuán)公司的衛(wèi)生管理部門設(shè)在企管部，并負(fù)責(zé)將集團(tuán)公司的衛(wèi)生區(qū)域詳細(xì)劃分到各部室，各分公司所轄區(qū)域衛(wèi)生由分公司客服部負(fù)責(zé)劃分，確保無遺漏。2 衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)2.1 室內(nèi)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)2.1.1 地面、墻面：無灰塵、無紙屑、無痰跡、無泡泡糖等粘合物、無積水，墻角無灰吊、無蜘蛛網(wǎng)。2.1.2 門、窗、玻璃、鏡子、柱子、電梯、樓梯、燈具等，做到明亮、無灰塵、無污跡、無粘合物，特別是玻璃，要求兩面明亮。2.1.3 柜臺(tái)、貨架：清潔干凈，貨架、柜臺(tái)底層及周圍無亂堆亂放現(xiàn)象、無灰塵、無粘合物，貨架頂部、背部和底部干凈，不存放雜物和私人物品。2.1.4 購物車（筐）、直接接觸食品的售貨工具（包括刀、叉等）：做到內(nèi)外潔凈，無污垢和粘合物等。購物車（筐）要求每天營業(yè)前簡單清理，周五全面清理消毒；售貨工具要求每天消毒，并做好記錄。2.1.5 商品及包裝：商品及外包裝清潔無灰塵（外包裝破損的或破舊的不得陳列）。2.1.6 收款臺(tái)、服務(wù)臺(tái)、辦公櫥、存包柜：保持清潔、無灰塵，臺(tái)面和側(cè)面無灰塵、無灰吊和蜘蛛網(wǎng)。桌面上不得亂貼、亂畫、亂堆放物品，用具擺放有序且干凈，除當(dāng)班的購物小票收款聯(lián)外，其它單據(jù)不得存放在桌面上。2.1.7 垃圾桶：桶內(nèi)外干凈，要求營業(yè)時(shí)間隨時(shí)清理，不得溢出，每天下班前徹底清理，不得留有垃圾過夜。2.1.8 窗簾：定期進(jìn)行清理，要求干凈、無污漬。2.1.9 吊飾：屋頂?shù)牡躏椧鬅o灰塵、無蜘蛛網(wǎng)，短期內(nèi)不適用的吊飾及時(shí)清理徹底。2.1.10 內(nèi)、外倉庫：半年徹底清理一次，無垃圾、無積塵、無蜘蛛網(wǎng)等。2.1.11 室內(nèi)其他附屬物及工作用具均以整潔為準(zhǔn)，要求無灰塵、無粘合物等污垢。2.2 室外衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)2.2.1 門前衛(wèi)生：地面每天班前清理，平時(shí)每一小時(shí)清理一次，每周四營業(yè)結(jié)束后有條件的用水沖洗地面（冬季可根據(jù)情況適當(dāng)清理），墻面干凈且無亂貼亂畫。2.2.2 院落衛(wèi)生：院內(nèi)地面衛(wèi)生全天保潔，果皮箱、消防器械、護(hù)欄及配電箱等設(shè)施每周清理干凈。垃圾池周邊衛(wèi)生清理徹底，不得有垃圾溢出。2.2.3 綠化區(qū)衛(wèi)生：做到無雜物、無紙屑、無塑料袋等垃圾。3 清理程序3.1 室內(nèi)和門前院落等區(qū)域衛(wèi)生：每天營業(yè)前提前10分鐘把所管轄區(qū)域內(nèi)衛(wèi)生清理完畢，營業(yè)期間隨時(shí)保潔。下班后5-10分鐘清理桌面及衛(wèi)生區(qū)域。3.2 綠化區(qū)衛(wèi)生：每周徹底清理一遍，隨時(shí)保持清潔無垃圾。4 管理考核二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化的機(jī)制及影響轉(zhuǎn)化效率的因素轉(zhuǎn)化機(jī)制：與植物基因轉(zhuǎn)化有關(guān)的農(nóng)桿菌有兩種類型：根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens ）和 發(fā)根農(nóng) 桿 菌（ Agrobacteriumrhizogenes 。根癌農(nóng)桿菌含有 Ti 質(zhì)粒。發(fā)根農(nóng)桿菌含有 Ri 質(zhì)粒。根癌農(nóng)桿菌的 Ti 質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌 Ri 質(zhì)粒都具有一段轉(zhuǎn)移 DNA(transfer又稱T-DNA在農(nóng)桿菌侵染植物時(shí)，T-DNA可以插入到植物基因組中，使其攜帶的基因在植物中得以表達(dá)。由于 T-DNA能夠進(jìn)行高頻率的轉(zhuǎn)移，而且Ti 質(zhì)粒和Ri 質(zhì)粒上可插入大到甚至 150kb的外源基因，因此粒和Ri 質(zhì)粒成為植物基因轉(zhuǎn)化中的理想載體系統(tǒng)。與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因與轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因主要包括農(nóng)桿菌染色體上的基因和 Ti 質(zhì)粒上以外Vir 區(qū)的基因。染色體基因包括 、、att 、、chvD以及。它們大多編碼一些膜相關(guān)蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)菌向植物受傷細(xì)胞趨化移動(dòng)和幫助細(xì)菌附著于植物受傷細(xì)胞上。 ChvD蛋白可能在低 pH和磷酸饑餓情況下提高 VirG蛋白的合成水平。ChvE與VirA蛋白共同對 virG起激活作用。原始的Ti質(zhì)粒根據(jù)其功能的不同，可分為4個(gè)區(qū)：（區(qū)：是在農(nóng)桿菌侵染細(xì)胞時(shí)，從 Ti 質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物基因組中的一段 其攜帶的基因與腫瘤的形成有關(guān)， 但與T-DN本身轉(zhuǎn)移與整合無關(guān)。 T-DNA上最重要的是兩端的 2個(gè)邊界(LB和它們是轉(zhuǎn)移所必需的。只要其存在， 可以將攜帶的任何基因轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中， T-DNA的右邊界在 的整合中對于靶 位點(diǎn)的識(shí)別具有重要作用 ，因此，尤以右邊界更為重要．）毒性區(qū)：位于 以外的 1個(gè)30~40kb 的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)段編碼的基因但對 的轉(zhuǎn)移和整合非常重要．這些基因也稱為 Ti 質(zhì)粒編碼毒基因(vir) 。）接合轉(zhuǎn)移區(qū)： 該區(qū)段存在有與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因 (tra) ，調(diào)控Ti 質(zhì)粒在農(nóng)桿菌間轉(zhuǎn)移。）復(fù)制起始區(qū)：該區(qū)段調(diào)控 Ti 質(zhì)粒的自我復(fù)制。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中除了Ti 質(zhì)粒上的基因參與外，還有農(nóng)桿菌染色體基因。染色體基因包 、att 、、chvD以及 。它們大多編碼一些膜相關(guān)蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)菌向植物受傷細(xì)胞趨化移動(dòng)和幫助細(xì)菌附著于植物受傷細(xì)胞上。延伸因子P對于農(nóng)桿菌的生長非常重要， 但非必需 高水平的糖結(jié)合蛋白一 ChvE可以擴(kuò)大VirA蛋白對酚類物質(zhì)的識(shí)別范圍。結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)體類似物蛋白Vir區(qū)基因的表達(dá)調(diào)控，chvD基因座中插入無啟動(dòng)子的lacZ，農(nóng)桿菌侵染力以及Vir區(qū)基因表達(dá)量大大下降，突變體中virG組成型表達(dá)侵染力則得以恢復(fù)，這一現(xiàn)象說明ChvD通過影響virG制毒性。Vir 基因的誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制在植物受到創(chuàng)傷后，創(chuàng)傷組織的細(xì)胞釋放出創(chuàng)傷信號(hào)——酚類化合物，如乙酰丁香酮。當(dāng)農(nóng)桿菌接受到此類信號(hào)時(shí)，其 vir 區(qū)基因可被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。另一類誘導(dǎo)化合物是組成植物細(xì)胞壁的一些特異單糖， As和單糖可協(xié)同誘導(dǎo)Ti 質(zhì)粒上vir 區(qū)基因的表達(dá)。Vir 區(qū)基因的活化首先是從 virA 基因始的。VirA 蛋白是一種結(jié)合在膜上的化學(xué)受體蛋白，可直接對植物產(chǎn)生的酚類化合物感應(yīng)，其感應(yīng)部位可能位于胞質(zhì)區(qū)域。 VirA 蛋白的胞質(zhì)區(qū)域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG 蛋白活化。VirG 蛋白是DNA結(jié)合活化蛋白，可以以二體或多體形式結(jié)合到 vir 啟動(dòng)子的特定區(qū)域，從而成為其它 vir 基因轉(zhuǎn)錄的激活因子， 打開VirBvirCvirDvirEvirH等幾個(gè)基因。ChvE可大大增強(qiáng) vir 基因被 As誘導(dǎo)的效果，ChvE可結(jié)一些單糖，也可直接與 VirA 周質(zhì)區(qū)相互作用，以加強(qiáng)As對Vir 基因的導(dǎo)。T-DNA復(fù)合物的形成T-DNA的加工與轉(zhuǎn)移是由 Vir 基因被誘導(dǎo)后產(chǎn)生的蛋白完成。 VirD基因編碼的兩個(gè)產(chǎn)物 VirD1 和VirD2 直接參與加工過程。 VirD1 蛋白是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶，可將超螺旋型 A變成松弛型 。VirD2 蛋白具有特異剪切單鏈DNA的內(nèi)切酶活性，它可以識(shí)別 T-DNA底鏈邊界重復(fù)序列上的特定位點(diǎn)，并在底鏈 24bp 重復(fù)序列和第四個(gè)堿基之間切割，將 T-DNA從Ti 質(zhì)粒上剪切下來，稱為 T-strand 或T-鏈。切開 T-DNA后，VirD2 蛋白與T-鏈的5，端共價(jià)結(jié)合，避免核酸外切酶降解 T-鏈。新的 T-DNA底鏈以此鏈為模板，從右端產(chǎn)生的 DNA缺口處以 5’-方向進(jìn)行合成。被取代的舊鏈游離出來，與許多 VirE2 蛋白分子結(jié)合組成 T-DNA復(fù)合體。此外，VirD2 為一個(gè)導(dǎo)向蛋白，可以指導(dǎo)整個(gè) T-DNA復(fù)合體（或叫 T-復(fù)合體）從農(nóng)桿菌進(jìn)入到植物細(xì)胞核。T-DNA復(fù)合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)農(nóng)桿菌的 T-DNA轉(zhuǎn)移通道由多達(dá) 12種蛋白組成，包括兩個(gè)主要部分：纖毛附屬絲（或纖毛）和膜結(jié)合復(fù)合體。該通道也可稱為 T-復(fù)合體運(yùn)輸器，由virB 編碼的 11 種蛋白和 VirD4 蛋白組成。VirB1 可在細(xì)菌膜上為 復(fù)合體運(yùn)輸器的裝備提供位點(diǎn)； VirB2 和VirB5 可被移動(dòng)到細(xì)胞表面形成纖毛；其余的 VirBVirD4 為T-復(fù)合體的運(yùn)輸提供能量。合成的 T-復(fù)合經(jīng)過 T-復(fù)合體運(yùn)輸器，以類似于細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的方式注射到植物細(xì)胞內(nèi)，并在 VirD2 和VirE2 的核定位信號(hào)（ 序列引導(dǎo)下，以 VirD2 為先向植物細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)。在人工構(gòu)建的質(zhì)粒中， vir 基因和 T-DNA可以放在同一個(gè)質(zhì)粒上，也可以放在不同的質(zhì)粒上。影響轉(zhuǎn)化效率的因素1、菌株染色體背景不同農(nóng)桿菌株的類型的 chv 基因決定了其對受體細(xì)胞的識(shí)別和附著能力差異。根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿型和琥珀堿型生長快、不結(jié)球，轉(zhuǎn)化易于操作，但共培養(yǎng)時(shí)菌體附著能力較差：章魚堿型則生長慢、易結(jié)球，轉(zhuǎn)化難于操作，但共培養(yǎng)時(shí)菌體附著后不易洗去。2、 共培養(yǎng)方式農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)介質(zhì)可以是細(xì)菌培養(yǎng)基或植物受體培養(yǎng)基。煙草等對農(nóng)桿菌侵染比較敏感的植物的共培養(yǎng)時(shí)間一般較短，液體細(xì)菌培養(yǎng)基介質(zhì)應(yīng)用較多。許多單子葉植物等不敏感植物受體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間一般較長，用細(xì)菌培養(yǎng)介質(zhì)容易造成農(nóng)桿菌過度繁殖，導(dǎo)致植物外植體呼吸作用抑制和細(xì)菌分泌物毒害，因此多采用液體植物培養(yǎng)基作為共培養(yǎng)介質(zhì)。3、侵染濃度和時(shí)間農(nóng)桿菌適宜的侵染濃度和時(shí)間因外植體對侵染的敏感性不同而有很大差農(nóng)桿菌附著不足。禾谷類作物一般侵染濃度較高，Hiei 用LBA4404(pTOK233)轉(zhuǎn)化水稻的最佳接種濃度為 Ishida 用LBA4404(pSB131)轉(zhuǎn)化玉米幼胚采用的侵染濃度為 但煙草、大白菜等對侵染敏感的雙子葉植物要求菌體濃度要低的多 ,一般為 OD600=。4、共培養(yǎng)條件共培養(yǎng)溫度農(nóng)桿菌在℃的范圍內(nèi)都可以生長，不同研究結(jié)果中vir區(qū)基因表達(dá)的適宜溫度有一定差異，但多數(shù)在[]。外植體生長溫度也一般在此范圍內(nèi)，所以通常選取外植體的最佳生長溫度為共培養(yǎng)溫度，通常在25℃左右。共培養(yǎng)值 研究人員普遍認(rèn)為酸性培養(yǎng)環(huán)境有利于農(nóng)桿菌的侵染因?yàn)橹参锛?xì)胞釋放的對農(nóng)桿菌有趨化作用的化學(xué)物質(zhì)（如酚類、糖類）雖然在不同酸堿度下比較穩(wěn)定，但在 pH=5.0~5.8時(shí)對vir 基因的誘導(dǎo)能力高。） 誘導(dǎo)物和抑制物 酚類是 vir 區(qū)基因表達(dá)的主要信號(hào)物質(zhì)。酚類物強(qiáng)的促進(jìn)效果與菌株類型、植物材料種類和共培養(yǎng)培養(yǎng)基的 pH值有關(guān)沒食子酸、二羥基苯甲酸、香草酚、兒茶酚、對羥基苯酚等多酚混合處理農(nóng)桿菌也有很高的作用，但不同酚類物質(zhì)是否有累加效應(yīng)在不同研究結(jié)果中不近相同。不同農(nóng)桿菌類型對酚類物質(zhì)的敏感性不同，根癌農(nóng)桿菌的章魚堿株系比胭脂堿系需要更高的酚類物質(zhì)誘導(dǎo)，發(fā)根農(nóng)桿菌的農(nóng)桿堿型比甘露堿型對酚類物質(zhì)刺激的敏感性更低。糖類等小分子,這些小分子一方面可作為化學(xué)源