蛋白質的復性

第五章蛋白質的復性蛋白質的復性為什么要進行蛋白質的復性？外源基因導入E.coli等宿主細胞并表達蛋白質產物（r-干擾素，白細胞介素-2，人生長激素等）時，相當多的產物形成了包涵體，而沒有蛋白質的活性。所以要進行蛋白質的復性。1.什么是包涵體？2.為什么選擇原核表達系統(tǒng)（特別是E.coli）？蛋白質復性蛋白質復性包含體的形成

包含體（inclusionbody,IB）是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌細胞中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與細胞質中的其他成分有明顯的區(qū)別。包涵體的形成比較復雜，有些機理還不清楚；主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。

(1)包含體的形成與細胞內蛋白質的生成速率有關，新生成的多肽濃度較高，無充足的時間進行折疊，從而形成非結晶、無定形的蛋白質的聚集體；

(2)包含體的形成還被認為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH值、離子強度、氧化還原電勢及蛋白質轉運系統(tǒng)的功能等因素有關。

(3)大腸桿菌的生長過程在受到某些因素的影響時，其本身蛋白質的表達也可出現(xiàn)異常，造成蛋白質的聚集從而形成包含體。(4)重組蛋白的氨基酸組成.一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關。蛋白質復性包含體的形成蛋白質的產量是折疊和凝聚競爭的平衡，蛋白質凝聚的成因是由于重組蛋白分子之間的疏水作用，而疏水作用也決定了凝聚物的濃度；

二硫鍵的形成則決定了凝聚物本身體積的大小。蛋白質在折疊過程中，本應于分子內部的疏水區(qū)之間相互作用、碰撞，形成不正確的的折疊而導致凝聚，從而形成包含體。疏水鍵的相互作用強度蛋白質復性包涵體形成的機制：

U←→I←→NU：指完全去折疊的狀態(tài)，I：指折疊中間體（也稱融球態(tài)moltenglobulestate）N：指天然的成熟的狀態(tài)蛋白質復性Mitraki和King提出了以下包涵體的形成模型：

IPf為可溶的、部分折疊的早期中間體IPm未可形成單體的中間體IPf*為形成包涵體的形式蛋白質復性包含體的形成的優(yōu)勢形成包含體對克隆基因的表達產物蛋白質具有保護作用，大腸桿菌可產生蛋白質水解酶，可降解不穩(wěn)定的多肽，許多可溶性的重組蛋白質對這些酶敏感，使得利用細菌作為表達宿主時受到限制，然而隔離在包含體內的蛋白質可免受蛋白酶的降解作用；此外對宿主菌有毒性的重組蛋白以無活性聚集體的形式存在也可以降低對宿主菌的毒害作用。優(yōu)勢:包含體可避免被水解酶水解蛋白質復性包含體的理化特性⑴大部分包含體不能滲透出細胞，需要人工進行細胞破碎來進行釋放產物。⑵大部分包含體在細胞內凝聚成沒有活性的顆粒固體（r-干擾素，白細胞介素-2，人生長激素）特點：包含體組成基本上由蛋白質構成，其中大部分（占50%以上）是基因工程產品，產物一級結構是正確的，但立體結構是錯誤的，沒有生物學活性。蛋白質復性

基因表達系統(tǒng)一般分為真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)。由于真核表達系統(tǒng)如酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等產生的重組蛋白價格高、產量低，而且操作復雜、產品周期長，而原核表達系統(tǒng)培養(yǎng)成本低、生長快、表達量高、基因操作方便，因此，目前它們仍是基因工程的主要表達系統(tǒng)，特別是大腸桿菌。大腸桿菌的重組菌

有多種可選擇的質粒；重組遺傳背景清楚，基因表達易于控制；蛋白表達量高（可達總蛋白50％）；但原核表達系統(tǒng)也有一個問題，很多外源蛋白在E.coli細胞內表達時往往以不溶的，無活性的包含體形式存在。若能解決包含體問題，原核表達系統(tǒng)就可得到更廣泛的應用。蛋白質復性現(xiàn)就包含體形成的預防、純化、復性和測定作一綜述。1.預防包含體形成的方法2.包含體的純化3.包含體的溶解4.包含體的復性蛋白質復性預防包含體形成的方法

由于包含體內的蛋白質是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具生物活性，因此要獲得具有生物活性的蛋白質必須將包含體溶解，釋放出其中的蛋白質，并進行純化、復性。近年來人們已開始著手尋找各種方法去防止包含體的形成。蛋白質復性預防包含體形成的方法1.形成分子伴侶

分子伴侶是什么

參與協(xié)助新生肽鏈體內折疊的一類蛋白質，包括：核質素，熱休克蛋白60家族（Hsp60），熱休克蛋白70家族（Hsp70），熱休克蛋白90家族（Hsp90）和其他種類的分子伴侶

分子伴侶對新生肽鏈折疊的促進作用

①使前體蛋白處于一種松散折疊的構象而具有跨膜、折疊或組裝能力；②在肽鏈折疊過程中通過與折疊中間體上暴露的疏水區(qū)域結合而防止肽鏈分子間發(fā)生反應，阻礙肽鏈進入錯誤折疊途徑

應用分子伴侶的策略

可采用表達外源基因的同時，共表達分子伴侶的策略。例如，GroES和GroEL可顯著提高D-核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶（rubisco）的折疊、組裝效率，從而提高可溶性重組蛋白的產量；也能提高可溶性乙酰輔酶A脫氫酶的產量和組裝效率；對可溶性β-葡萄糖苷酶的表達也有提高蛋白質復性預防包含體形成的方法

2.通過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達產物的可溶性.為了使外源蛋白在E.coli細胞中可溶性，人們在培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面進行了多方面的探索。（I）通過降低培養(yǎng)溫度可以使人干擾素2和干擾素γ的可溶性組分提高。這些蛋白在37℃下表達時以包含體形式存在，當將培養(yǎng)溫度降到23~30℃時,其可溶性組分可達30%~90%。蛋白質復性預防包含體形成的方法

2.通過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達產物的可溶性.為了使外源蛋白在E.coli細胞中可溶性，人們在培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面進行了多方面的探索。（II）利用豐富培養(yǎng)基,可使T4噬菌體的脫氧胞苷酸脫氨酶的基因進行可溶性表達，表達量占細胞可溶性蛋白總量的20%，而在最低培養(yǎng)基中，此酶以包含體形式表達。（III）改變培養(yǎng)基的滲透壓、降低pH值等方法也可以達到減少包含體的目的。通過優(yōu)化發(fā)酵條件改善基因表達產物的方法雖然可行，然而也需要對具體問題進行具體分析、實驗。蛋白質復性預防包含體形成的方法3．通過基因突變技術，在蛋白分子中產生氨基酸取代，來增加重組蛋白的可溶性。此方法的前提是氨基酸的取代不能使蛋白的活性受到影響。通過氨基酸取代，改變蛋白質表面荷電性質，減少蛋白分子之間聚集，從而防止包含體的形成。如上所述，多種因素影響外源基因的可溶性表達。對于如何獲得天然構象和活性的可溶蛋白質的技術方法，目前均無統(tǒng)一的模式，只能通過具體實驗來確定。蛋白質復性包含體的純化

含有包含體的大腸桿菌細胞膜的結構常發(fā)生改變，脆性增加，故可利用一些簡單的方法使宿主菌釋放出包含體。可用溶菌酶、勻漿或超聲波等酶法、物理學的方法使細胞裂解。由于包含體密度高，可用短時的低速離心（1000~12000g）將其與細胞碎片等物質分離。蛋白質復性

包含體的純化

若采用密度梯度離心技術則可得到純度較高的包含體。如果得到的包含體含有較多的雜質，可用含常用鹽和去污劑（TritonX-100）的溶液進行洗滌，使污染的膜蛋白等雜質溶解，得到含雜質較少的包含體。蛋白質復性

包含體的溶解包含體是不溶于水的，為了獲得可溶性的蛋白質，首先要使其溶解，通常用強的蛋白質變性劑。對于不同的蛋白質可采用不同的方案，需經實驗后確定。一般可用5~8mol/L尿素或5~8mol/L的鹽酸胍溶解包含體，使非共價聚集的蛋白質分子間分離；當包含體內蛋白質多肽鏈中含有半胱氨酸時,宿主菌破碎后,在空氣的氧化作用下,蛋白質分子內部和分子間及與雜蛋白分子間可形成二硫鍵,該鍵是一種很強的鍵,為使蛋白質充分溶解,也可用低pH值(pH7.2~7.05)加含巰基的試劑(0.1%~1%)巰基乙醇或二硫蘇糖醇和適量的SDS(1%SDS),使蛋白質完全還原,呈溶解狀態(tài),為蛋白質的復性作好準備.

蛋白質復性蛋白質復性的主要步驟：破碎細胞分離出包含體溶解包含體目標構建的構型復原。包含體顆粒內并不一定多是表達產物，也可能含有其他雜物，核酸，脂類，雜蛋白等.蛋白質復性主要蛋白質復性的基本步驟和聯(lián)合實驗如下：（1）機械破碎（高壓勻漿，高速珠磨法）離心法提取出包含體加變性劑溶解除變性劑復性。（2）機械破碎膜分離可溶性蛋白變性溶解包含體除變性劑復性。（3）化學破碎（加變性劑）離心除細胞碎片出除變性劑復性。蛋白質復性路線1的特點：

方法（1）：利用了包含體與細胞破碎片的密度差，用離心法將包含體與細胞碎片和可溶性性蛋白質分開，獲得包含體，再對包含體溶解后，復性，擺脫大量的雜蛋白，核酸，熱原，內毒素等雜質。優(yōu)點：分離步驟簡單；缺點：經幾次離心后，才能除去大部分細胞碎片，加工時間長。蛋白質復性蛋白質復性

路線2的特點：

方法（2）：應用膜分離技術，用微孔膜除去可溶性蛋白質，但載留細胞碎片和包含體。優(yōu)點：可進行封閉式操作，不污染環(huán)境，也不受環(huán)境污染，耗能少。缺點：膜的堵塞和濃度極化常導致可溶性蛋白質的滯留，這項技術問題較多。

蛋白質復性路線3的特點：方法（3）：所用試劑即可以破菌，又可以溶解包含體。將兩道工序合為一道，節(jié)省了設備和時間，比前兩者更適合實驗室操作。

缺點：混有雜質，不易分離。蛋白質復性包含體復性的方法

包含體蛋白質的復性是指使包含體內的變性蛋白質恢復其天然三維空間結構從而具有生物學活性的過程.一般分為以下幾種方法:

1.

通過變性-復性的方法獲得正確構象和生物活性的重組蛋白.這是一種較通用的方法.蛋白質復性包含體復性的方法將通過細胞破碎,離心分離,多步清洗得到的”純凈”包含體,在強變性劑(5~8mol/L尿素或5~8mol/L的鹽酸胍)中變性增溶,再將變性蛋白質稀釋到適當?shù)膹托跃彌_液中,或通過對復性緩沖液透洗\濃縮,最終得到重折疊的重組蛋白.在溶液中變性-復性方法的關鍵是優(yōu)化折疊液和操作步驟,特別是對分子內含多個二硫鍵的蛋白質更是如此.在此過程中,影響復性蛋白產率的因素有:蛋白質復性包含體復性的方法影響復性蛋白產率的因素：(1)復性蛋白的濃度,為防止蛋白質分子間發(fā)生聚集,復性蛋白的濃度要盡量稀,一般控制在25-75ug/mL為好.(2)復性緩沖液要保持適當?shù)难趸€原條件.一般GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比為1為好.(3)復性緩沖液的pH要通過實驗來確定最適值.(4)復性溶液中要加入適當?shù)膌abilizing試劑,如L精氨酸,可提高復性產率.

蛋白質復性包含體復性的方法影響復性蛋白產率的因素：(5)復性溫度也是一個影響因素,一般在低溫下(4-10℃)進行.(6)為防止聚集發(fā)生,復性時,可采取分步加入變性蛋白的操作方法.在溶液中變性-復性方法受各種因素的影響,且對不同蛋白質所需的最適條件可能又不相同,因此對于一個特定重組蛋白的復性要通過實驗找出最適條件.流加稀釋復性

復性液中蛋白質初始濃度=0.邊流加、邊復性。故變性蛋白質濃度始終保持在較低水平，有利于提高復性收率，且終濃度較高。蛋白質復性的影響因素濃度

增加蛋白質的濃度有利于聚集的進行溫度

蛋白質的復性一般在室溫下進行，溫度過高（＞40℃）蛋白質的聚集將十分嚴重

pH值

通常復性在弱堿性條件下（pH8）進行，但要注意避免與蛋白的pI值相近折疊促進劑

L-Arg,PEG,去污劑,尿素和鹽酸胍蛋白質復性

復性操作方法：2.稀釋和透析復性稀釋法：將溶液稀釋，導致變性劑的濃度降低，小分子折疊助劑濃度增大。蛋白質開始復性。透析法：利用透析或電滲析超濾除去變性劑，使蛋白質開始復性。缺點：透析時間長，易形成蛋白質沉淀。蛋白質復性復性操作方法：2.稀釋和透析復性有時包含體中蛋白質含有兩個以上的二硫鍵，其中有可能發(fā)生錯誤連接，在這種情況下用還原劑打斷S-S鍵，使其變成-SH，復性后，加入氧化劑使兩個-SH形成正確的雙硫鍵。還原劑：二硫蘇糖醇B-巰基乙醇還原型谷胱肝肽氧化劑：谷胱甘肽空氣（堿性條件下），半胱氨酸蛋白質復性

蛋白質復性存在問題：蛋白質復性是十分復雜過程，其中目標產品的復性率非常低，一般不超過20%，其原因在于當變性劑穩(wěn)定后，蛋白質分子可能重新聚合成二聚體，三聚體或多聚體，甚至形成沉淀物?，F(xiàn)有提高蛋白質復性收率有：反膠束法復性，單克隆抗體協(xié)助復性及保護復性等。蛋白質復性紅血球碳酐復性中鹽酸胍濃度與蛋白質濃度對復性的影響蛋白質復性紅血球碳酐復性中鹽酸胍濃度與蛋白質濃度對復性的影響圖中有復性區(qū)、多聚體區(qū)和絮凝沉淀區(qū)。降低鹽酸胍濃度或增加蛋白質濃度都易使系統(tǒng)進入多聚體區(qū)和絮凝區(qū)。要減少復性的損失，就必須使操作處于復性界限之上。蛋白質復性復性操作方法：3.色譜復性（1）凝膠過濾色譜為代表的非吸附型色譜。（2）吸附型色譜復性，其中常用的金屬螯合色譜復性，親合色譜復性，離子交換色譜復性。色譜復性法在色譜過程中實現(xiàn)復性，稱為色譜復性法。近年發(fā)展十分迅速。其優(yōu)點是：色譜固定相對變性蛋白質吸附能力低，甚至完全消除變性蛋白質在脫離變性劑的環(huán)境發(fā)生聚集，產生沉淀。提高復性質量和活性收率。在蛋白質復性的同時可使目的蛋白質與雜蛋白質分離，達到復性與純化同時進行的目的。便于回收變性劑，有利于降低廢水處理成本。適合蛋白質復性的色譜有：凝膠過濾色譜(GFC)、離子交換色譜(IEC)、疏水色譜(HIC)、親合色譜(AFC).凝膠過濾復性凝膠過濾色譜是以溶液中分子的流體力學體積大小進行混合物分離的技術。進行色譜柱的連續(xù)使用，提高使用效率。溶質分子之間及溶質與分離介質之間無相互作用，活性分子不易變性，活性收率高。凝膠過濾復性由于上述特點，凝膠過濾色譜近年開始用于蛋白質復性。在凝膠過濾復性時，先用復性緩沖液平衡凝膠變性蛋白質溶液上樣后進入柱頂，因有高濃度變性劑存在，變性蛋白質有一個隨機構象狀態(tài)和大的動力學水合半徑，不能進入介質內空隙，在柱上不能保留。在用復性緩沖液洗脫時，因變性蛋白質溶液逐步被稀釋（色譜峰擴散），變性劑和蛋白質濃度降低，蛋白質分子會自發(fā)地向熱力學穩(wěn)定的低能態(tài)，即蛋白質的天然狀態(tài)轉化，使蛋白質開始復性。凝膠過濾復性隨時間推移，當?shù)鞍踪|分子結構變得更加緊密時，蛋白質在兩相中的分配系數(shù)會逐漸增加。蛋白質進入介質顆粒內部空隙后，其擴散速度減緩，從而限制了蛋白質的聚集，減少了沉淀產生。蛋白質分子大，先從柱子上洗脫，變性劑分子小，最后流出色譜柱。達到復性目的。復性操作方法：

凝膠過濾色譜復性通過分子篩效應將變性蛋白質與變性劑加以分離,從而使變性蛋白質進入復性溶液進行復性.舉例:核糖核酸酶包含體的復性4.利用凝膠過濾層洗，對重組蛋白進行復性.一般的做法是將1-10mg的蛋白質溶入1-2mL的變性緩沖液中,使蛋白充分變性(一般在室溫下數(shù)小時或過夜),然后在superdex75HR10/30或sephacryIS系列柱上進行蛋白質分子重折疊,從凝膠過濾柱上洗脫下來的樣品經超濾濃縮回收.利用此法成功地使分子內有9個半胱氨酸,分子量為50000Da的重組人ETS-1蛋白有效地復性,其構象和天然構象相同.蛋白質復性包含體的復性4.利用凝膠過濾層洗，對重組蛋白進行復性.此方法的另一特點是,由多亞基組成的蛋白,變性的亞基可以在凝膠柱上締合,正確重折疊.對于在凝膠柱上進行重折疊的機理尚不十分清楚,一種可能的解釋是在凝膠過濾柱上所進行的重折疊或分子亞基之間的締合,是在不可逆條件下進行的,因而克服了在溶液中常規(guī)重折疊過程中所遇到的主要問題-------分子折疊和分子間聚集的動力學競爭.由于在層洗柱上重折疊成天然構象的蛋白質分子的不同流速特性,它們不斷地從平衡中被移走,因此有利于變性蛋白質分子的重折疊.蛋白質復性復性操作方法：

親合色譜復性利用抗原抗體,酶與底物相互作用幫助蛋白質復性也是很有效的一種手段。將抗原或抗體，酶或底物之一固定化在凝膠上，使復性在親和柱中進行。親合色譜復性是利用配體與目標蛋白質之間的特異親合作用，使變性蛋白質分子保留在柱的頂端與變性劑分離，而后在洗脫過程中進行復性。依使用的配體，用于復性的親合色譜有：抗體親合色譜、金屬親合色譜(IMAC)、脂質體親合色譜、分子伴侶親合色譜等。因配體與目標蛋白質間的作用特異性強，且不同配體與不同蛋白質之間的作用差別大，親合色譜作為蛋白質復性的機理比較復雜。親合色譜復性以金屬離子為配體的親合色譜復性法如以Ni為親合配體，可與末端標記有組氨酸的蛋白質分子有特異的親合作用，而這種作用又不受強變性劑的影響，可用于重組蛋白質的復性。親合色譜復性脂質體親合色譜復性脂質體作為配體用于蛋白質復性的原理可能是：局部變形的蛋白質分子結構類似于融球狀與具有天然蛋白質相似的二級結構，此時，蛋白質分子仍然具有強的疏水表面，可同脂質體的脂質雙層作用，以幫助蛋白質進行復性。比如碳酸酐脫氫酶的復性使用脂質體的柱子，活性收率為83%，不用為58%。親合色譜復性伴侶親合色譜復性分子伴侶是介導表達蛋白質建立天然構象的一類重要蛋白質，也是蛋白質體外折疊復性過程的輔助因子。在復性溶液中加入分子伴侶可提高蛋白質的復性效率，但溶液中引入了雜蛋白，給目的蛋白質分離純化帶來麻煩，且它價格昂貴，而無法應用。而將分子伴侶結合在適當?shù)慕橘|上構成分子伴侶親合色譜介質，用于目的蛋白質的復性可克服上述缺點。親合色譜復性分子伴侶親合色譜介導的蛋白質復性與它在溶液中的作用一樣。為變性蛋白質提供一個中空環(huán)狀的疏水腔，當變性蛋白質進入空腔后，可部分避免或完全消除變性蛋白質分子間的聚集作用，使蛋白質在疏水環(huán)境中進行“結合-釋放-再結合”的循環(huán)過程，直到恢復其天然的構象狀態(tài)。利用合成的復雜的固定相體系成功地使一些用稀釋法無法復性的蛋白質復性，因此，它又稱為“折疊色譜”。疏水色譜復性當變性蛋白質與變性劑、雜蛋白進入疏水色譜系統(tǒng)時，由于疏水固定相對變性劑的作用較弱，而對變性蛋白質的作用較強，變性劑首先與與變性蛋白質分離，并隨流動相一同流出色譜柱，為復性創(chuàng)造條件。而蛋白質特定的疏水氨基酸殘基與疏水固定相表面作用形成區(qū)域立體結構，接著形成折疊中間體，隨著流動相的不斷變化，變性蛋白質不斷在固定相表面進行吸附-解吸再吸附，在此過程中，變性蛋白質逐漸復性，形成與天然蛋白質結構相同的蛋白質，流出色譜柱。在此過程中，不同蛋白質與固定相的作用強弱不同，復性的目標蛋白質可與大部分雜蛋白進行分離。離子交換色譜復性變性蛋白質、變性劑及變性液中的其他組分與離子交換介質間的電荷作用，使它們吸附在離子交換固定相表面，由于這些組分與離子交換介質的吸附能力的差別，在洗脫過程中進行不斷地吸附-解吸-再吸附的過程，使變性蛋白質與變性劑逐漸分離，并在吸附-解吸的過程中進行復性過程。各種色譜復性方法的比較凝膠過濾色譜(SEC)復性法：復性分離過程中，變性蛋白質分子逐漸變小，柱負荷小，產物濃度低，復性分離時間長，效率較低。離子交換色譜(IEC)復性法：柱負荷大，分離效果尚好，最常用的變性劑鹽酸