標(biāo)準(zhǔn)解讀

《GB/T 27639-2011 結(jié)核病病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》是一項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，旨在規(guī)范使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測(cè)。該標(biāo)準(zhǔn)適用于各類實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中對(duì)于疑似結(jié)核病患者的臨床樣本（如痰液）中是否存在結(jié)核分枝桿菌DNA的定性分析。

根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)流程主要包括樣品處理、核酸提取、引物和探針的設(shè)計(jì)與選擇、反應(yīng)體系建立及條件優(yōu)化、結(jié)果判讀等步驟。其中特別強(qiáng)調(diào)了實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免交叉污染；同時(shí)要求所有參與人員必須經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)并熟悉相關(guān)設(shè)備的操作規(guī)程。

在樣品處理階段，需按照特定的方法收集并保存待測(cè)樣本，確保其質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。接著通過有效的核酸提取技術(shù)獲得純凈度高且濃度適中的DNA模板用于擴(kuò)增反應(yīng)。引物與探針的選擇基于已知的結(jié)核分枝桿菌特異性序列設(shè)計(jì)而成，能夠保證較高的靈敏度與特異性。此外，在構(gòu)建PCR反應(yīng)體系時(shí)還需考慮各種因素的影響，比如鎂離子濃度、dNTPs比例等，以達(dá)到最佳擴(kuò)增效果。


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....

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  • 現(xiàn)行
  • 正在執(zhí)行有效
  • 2011-12-30 頒布
  • 2012-04-01 實(shí)施
?正版授權(quán)
GB/T 27639-2011結(jié)核病病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法_第1頁(yè)
GB/T 27639-2011結(jié)核病病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法_第2頁(yè)
GB/T 27639-2011結(jié)核病病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法_第3頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

ICS11220

B41.

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T27639—2011

結(jié)核病病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

Real-timePCRmethodforthedetectionoftuberculosispathogenicorganisms

2011-12-30發(fā)布2012-04-01實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

GB/T27639—2011

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照給出的規(guī)則起草

GB/T1.1—2009。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口

(SAC/TC181)。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位中華人民共和國(guó)廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局華中農(nóng)業(yè)大學(xué)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究

:、、

院北京盈九思科技發(fā)展有限公司

、。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人陳茹劉中勇楊國(guó)海郭愛珍曾碧健韓雪清高小博林祥梅吳曉薇

:、、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T27639—2011

結(jié)核病病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法的技術(shù)要

、、PCR

求和操作規(guī)范

。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于快速檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)物血樣奶樣痰液組織器官糞便等臨床樣品中結(jié)核分枝桿菌

、、、、、

復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌

、、。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文

。,

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于本文件

。,()。

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T6682—2008

實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB19489—2008

3縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件

。

值熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

Ct:。

脫氧核苷三磷酸

dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate,。

二甲基亞砜

DMSO:dimethylsulfoxide,。

乙二胺四乙酸

EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,。

磷酸鹽緩沖液

PBS:phosphatebuffersolution,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR:polymerasechainreaction,。

酶聚合酶

Taq:TaqDNA。

酶尿嘧啶糖基化酶

UDG:uracilDNAglycosylase,DNA。

4原理

本標(biāo)準(zhǔn)方法采用了探針實(shí)時(shí)熒光技術(shù)原理反應(yīng)體系中包括一對(duì)用于擴(kuò)增

TaqManPCR。DNA

的引物和一條能與產(chǎn)物特異雜交的熒光標(biāo)記探針探針的端標(biāo)記了被稱為報(bào)告基團(tuán)的熒光

,PCR。5’

素端標(biāo)記了淬滅基團(tuán)在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)酶的外切酶活性將端熒光基團(tuán)從探針上

,3’。PCR,Taq5’5’

切割下來(lái)使其與淬滅基團(tuán)分離從而儀器能檢測(cè)到端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)一分子擴(kuò)

,,5’,PCR

增產(chǎn)物的生成伴隨一分子熒光信號(hào)的產(chǎn)生隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)的增加儀器檢測(cè)到的熒光信號(hào)的累積

。,

反應(yīng)了擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化

。

本標(biāo)準(zhǔn)提供特異檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌共四套實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)

、PCR

方法見表其中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異的實(shí)時(shí)熒光方法分別以插入基因

(1)。,PCRIS6110、IS1081

序列為模板設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物與探針結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌特異的實(shí)時(shí)熒光方法分別以菌

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