電泳技術(shù)課程講義

電泳技術(shù)

1937年瑞典化學家Tiselius利用電泳現(xiàn)象制造了界面電泳儀，用于蛋白質(zhì)的研究。

3.應(yīng)用

物質(zhì)性質(zhì)的研究、種類的鑒定、分離純化、純度的分析等。

1.概念

帶電粒子在電場中的移動現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。

2.發(fā)展史

1809年，俄國物理學家Reuss進行了世界上第一次電泳實驗。第一節(jié)電泳的基本原理及電泳類型一、原理

一種粒子，如果能解離或能吸附其它帶電粒子，在電場中便會向正極或負極移動。不同性質(zhì)的粒子由于所帶凈電荷的種類和數(shù)量不同，因而在電場中的遷移方向和速度不同，利用物質(zhì)的這種性質(zhì)可對物質(zhì)進行分離或鑒定。

等電點（isoelectricpointpI）:

兼有酸性基團（如-COOH）及堿性基團（如-NH2）的蛋白質(zhì)分子，在特定pH溶液中所帶正電荷恰好等于負電荷，即分子的凈電荷等于零，這時溶液的pH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點。此時蛋白質(zhì)在電場中不移動。

RCOO-

NH3+H+

OH-RCOOHNH3

+RCOO-NH2移向負極移向正極pH=pIpH>pIpH<pI

帶電粒子在電場中移動時所受力的作用：

電場力F1=Q·E1）

摩擦力F2=f·V2）相平衡時，則

QE=f·V=6πηrV3）

QEV=━━━━4）

6πηr

（—）

（+）F1F2

遷移率（mobility,

M）

帶電粒子在單位電場強度下的遷移速度，可描述帶電粒子在電場中移動速度，球形粒子的電泳遷移率和其半徑，所帶電荷及溶液粘度有關(guān)：

M=V/E=QE/6πηr/E=Q/6πηr粒子的遷移率的大小取決于粒子的性質(zhì)，粒子遷移率的差別決定其能否分離。

二、影響粒子電泳遷移的因素（一）電場強度粒子移動速度與電場強度成正比。

常壓電泳高壓電泳電壓100~500V500~1000V電場強度10~20V/cm20~100V/cm分離時間長，約需數(shù)小時到數(shù)天短，有時僅需數(shù)分鐘。（二）緩沖液電泳緩沖液的要求：使被分離的物質(zhì)穩(wěn)定，不與被分離物質(zhì)反應(yīng)。1.溶液的pH值溶液pH值決定帶電粒子解離的強度，也決定其所帶電荷數(shù)量。當分離某一蛋白質(zhì)混合物時，應(yīng)選擇一種pH值，其能夠擴大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量的差異，以利于各種蛋白質(zhì)的分離。2.離子強度對電泳的影響

在電泳液中的離子增加時會使電泳遷移率降低，原因是帶電的粒子會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，形成一個與運動粒子符號相反的離子氛（ionicatmosphere）,它使該粒子向相反的方向運動，從而降低了該粒子的遷移率。離子的這種阻礙效應(yīng)是與其濃度和價數(shù)相關(guān)的。電泳時，緩沖液的離子強度較低，泳動速度快，生熱少；離子強度高，泳動速度慢，生熱多，但區(qū)帶較窄。最適離子強度在0.02~0.2之間。（三）支持介質(zhì)

自由溶液區(qū)帶電泳的缺點：1.電泳引起的熱效應(yīng)能使液柱對流擾動，破壞正在分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。2.擴散作用使蛋白質(zhì)區(qū)帶加寬，且電泳結(jié)束后還在進行。支持介質(zhì)能減少擴散，固定蛋白質(zhì)在最終的位置上，提高分辨率

支持介質(zhì)選擇條件：

1.惰性材料，以不影響粒子電泳遷移率；

2.化學穩(wěn)定性好；3.重復性好；

4.電滲小等。其它因素如緩沖液的粘度、緩沖液與帶電質(zhì)點的相互作用以及電泳時的溫度變化，電壓不穩(wěn)等因素也都能影響電泳速度。

電滲作用（electro-osmosis）

電滲即一種液體相對于帶電支持物的移動現(xiàn)象，一般是支持介質(zhì)內(nèi)存在某些可解離的基團所致。電滲作用影響較大的有紙電泳、淀粉膠電泳、毛細管電泳等。AB—

—

—

—

—

+++++

+++++—

—

—

—

—

電滲示意圖（A、B為固體支持體）+—

分子篩作用:

支持介質(zhì)，如淀粉膠、瓊脂糖凝膠及聚丙烯酰胺凝膠具有分子篩作用。粒子在這種凝膠中電泳時，遷移率不僅與其帶電性質(zhì)有關(guān)，而且和它們的分子大小也有關(guān)?？筛鶕?jù)待分離物的大小，采用不同的交聯(lián)度以形成不同孔徑的凝膠。

支持介質(zhì)種類：

1.醋酸纖維素薄膜，硅膠，礬土，纖維素等

2.淀粉、瓊脂糖，聚丙烯酰胺凝膠。

聚丙烯酰胺凝膠是最常用的支持介質(zhì)，分辨率高。三、電泳的分類

按載體介質(zhì)劃分1.無支持介質(zhì)的自由溶液電泳2.有支持介質(zhì)的電泳(zone-electroph-oresis）包括紙電泳，醋酸纖維薄膜電泳，薄層電泳，非凝膠支持物電泳（淀粉、纖維素、玻璃粉、硅膠等）和凝膠支持物電泳（瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂等）。

U型管電泳按支持物柱狀電泳（圓盤電泳）形狀劃分板狀電泳垂直板（見圖）水平板毛細管電泳等速電泳按原理劃分等電聚焦電泳免疫電泳

分析型電泳按分離規(guī)模劃分制備型電泳單向電泳按電泳形式劃分雙向電泳電泳—層析結(jié)合

第二節(jié)聚丙烯酰胺凝膠電泳一、凝膠聚合原理

聚丙烯酰胺凝膠（PolyacrylamidegelPAG）是由丙烯酰胺單體（acrylamide,Acr）聚合成長鏈并通過交聯(lián)劑N、N′甲叉雙丙烯酰胺（N、N′PAG，methylenebisacr-ylamide,Bis）與長鏈末端游離的功能基在有催化劑和增速劑情況下反應(yīng)聚合而成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。

催化劑：過硫酸胺或核黃素

加速劑:

四甲基乙二氨（

TEMED）

過硫酸銨—TEMED系統(tǒng)：TEMED（N,N,N,N’-tetram-ethylenediamine,）

催化過硫酸銨形成自由基SO42-，使丙烯酰胺單體的單鍵打開，形成游離基丙烯酰胺，后者和Bis單體作用，聚合成凝膠。調(diào)整TEMED或過硫酸銨濃度可以調(diào)節(jié)聚合反應(yīng)速率。pH偏低的條件下，聚合反應(yīng)可能被延遲甚至阻止。

核黃素—TEMED系統(tǒng)：

需要光照來啟動聚合反應(yīng)。核黃素在光照下，部分分解并被還原成無色型核黃素，在有氧條件下，此無色型又被氧化成為帶有游離基的核黃素，后者使丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合成凝膠。為加速聚合，在合成過程還加入TEMED作為加速劑促進聚合作用。

過硫酸胺—TEMED系統(tǒng)：

催化化學聚合，形成的凝膠孔徑小，重復性好、性質(zhì)穩(wěn)定，常用于制備分離膠。

核黃素—TEMED系統(tǒng)：

催化光聚合，形成的凝膠孔徑大，且隨著時間延長而逐漸變小，不太穩(wěn)定，常用于制備酸性電泳濃縮膠。時間不受嚴格限制，通過光照可以調(diào)節(jié)聚合時間。

丙烯酰胺聚合過程的相關(guān)因素：（1）催化劑和增速劑的濃度：過量可引起電泳時燒膠和蛋白電泳帶畸變。（2）系統(tǒng)的pH：酸性pH延遲聚合反應(yīng)。堿性pH易聚合，但膠脆、硬，染色脫色時易破裂。（3）溫度影響：低溫聚合，膠脆、混濁，重復不好。25-35℃，凝膠透明有彈性。高溫凝膠聚合生熱使氣體溶解，使膠中產(chǎn)生氣泡。（4）分子氧：延遲聚合反應(yīng)。（5）凝膠系統(tǒng)中的不純物：金屬或其它雜質(zhì)延遲聚合反應(yīng)。

二、凝膠的機械性能及孔徑

凝膠的機械性能、彈性、透明度和粘著度取決于凝膠的總濃度。通常用T%表示丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的總濃度，即兩者在溶液中百分比濃度。

a：丙烯酰胺的量

b：甲叉雙丙烯酰胺的量

m：溶液總體積

凝膠的孔徑主要受總濃度T%的控制。通常T值越大，平均孔徑越小，凝膠的機械性能越強。在T值不變，而甲叉雙丙烯酰胺濃度為5%時，凝膠孔徑最小，C較大時，如C為20%，凝膠為乳白色。但丙烯酰胺濃度低于2%和N-N′-甲叉雙丙烯酰胺濃度低于0.5%時，凝膠不可能聚合。

丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例常用交聯(lián)度C%表示，即交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺所占百分比。

a:b比值<10凝膠脆、硬，呈乳白色>100，T為5%時，凝膠呈糊狀。

富有彈性且完全透明的凝膠，其重量比（a:b）在30左右。

Richards在1965年提出便于選擇T和C的經(jīng)驗公式：C=6.5~0.3T這個公式能用于計算T為5%~20%時的凝膠的組成。Bis的含量與不同凝膠濃度平均孔徑之間的關(guān)系總凝膠濃度（％）

平均孔徑（?）

Bis占總凝膠的百分數(shù)

6.58.010.012.015.0

1

5

15

25

2423191714

19161497282420———3630—

—

樣品分子量與相應(yīng)的凝膠濃度適用的凝膠濃度（％）

分子量范圍

20～3015～2010～155～102～5<1041～4×1044×104～1×1051～5×105>5×105

三、聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類

常用類型

圓柱型平板型水平方向垂直方向（一)垂直板凝膠電泳分類：有不連續(xù)和連續(xù)兩種優(yōu)點：1.表面積大，易于冷卻，便于控溫；2.電泳結(jié)束后，凝膠容易取出；3.能在同一凝膠相同實驗條件下，同時點加多個樣品，便于比較分析；4.便于用各種方法鑒定；5.平板電泳可做雙向電泳。

不連續(xù)垂直板凝膠電泳主要用于蛋白質(zhì)分離，連續(xù)垂直板凝膠電泳更多用于核酸研究。（二）水平板電泳分類：中空循環(huán)水浴式和半導體冷卻系統(tǒng)。優(yōu)點：1.分辨率高，易使凝膠冷卻，可加高電壓，且尺寸不受限制，可增加分離距離，提高分辨率；2.快速，全自動水平電泳：30分鐘，半自動：1小時左右；3.準確度高，靈敏度高；4.凝膠厚度、尺寸、分離距離任選；5.加樣數(shù)、位置任選，加樣方便，易于自動化；6.染色快，效果好，便于保存，多功能；7.薄膠，可省膠，加樣少；等電聚焦可直接測pH。

（三）圓柱型凝膠電泳：

常使被分離的物質(zhì)成圓盤形區(qū)帶而相互分離，故常稱凝膠圓盤狀電泳（discelectr-ophoresis）。

圓柱型凝膠電泳是以垂直方向進行的。凝膠柱(玻璃管)直徑約0.5cm的，常用做混合物的分離分析。凝膠柱是直徑不超過1cm的玻璃柱，常用作混合物的分離提純及制備。

柱膠的優(yōu)點

1）操作簡單，能確定蛋白質(zhì)組分分離時的pH和凝膠濃度。2）樣品容量大，配有自動切膠裝置，適用于標記有同位素的蛋白質(zhì)生物活性測定分析；3）用于雙向電泳技術(shù)四、連續(xù)凝膠電泳和不連續(xù)凝膠電泳連續(xù)凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳凝膠系統(tǒng)一層兩層，不同孔徑所用的緩沖液pH值相同不同電泳過程中形成的電勢梯度均勻不均勻操作簡單復雜，但分離效果好應(yīng)用主要用于核酸研究主要用于蛋白質(zhì)分離

（一）連續(xù)凝膠電泳和不連續(xù)凝膠電泳的區(qū)別

連續(xù)及不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的板狀凝膠

電極上貯液槽緩沖液濃縮膠分離膠下貯液槽緩沖液樣品池

1.樣品的濃縮效應(yīng)：

1）凝膠層的不連續(xù)性：凝膠孔徑2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性3）pH值不連續(xù)性：2.分子篩作用(molecularsievingeffect)：凝膠濃度網(wǎng)孔大小蛋白質(zhì)分離3.電荷效應(yīng)：所帶電荷移動速度

8.38.38.96.7（二）不連續(xù)系統(tǒng)凝膠電泳的分離原理蛋白質(zhì)不連續(xù)系統(tǒng)濃縮分離原理-------------------------------------------

-------------------------------------------

----------------------------------------------貯液槽緩沖液(Tris-G)pH8.3--樣品Tris-HClph6.7濃縮膠Tris-HClpH6.7分離膠Tris-HClpH8.9貯液槽緩沖液(Tris-G)pH8.3+++蛋白質(zhì)在甘氨酸和氯離子界面間濃縮蛋白質(zhì)在分離膠中分級分離

電泳開始時在濃縮的過程中在分離膠中分離時

濃縮膠和分離膠PH的不連續(xù)，是為了控制慢離子的解離速度，從而控制有效遷移率。

電泳液(PH8.3)中含甘氨酸離子；樣品及濃縮膠緩沖液（PH6.7）中含Cl-；分離膠緩沖液（PH8.9）也含Cl-。PH8.3時，甘氨酸-慢離子；鹽酸中的Cl-

稱為快離子。而PH6.7時，蛋白分子的有效遷移率介于兩者之間。電泳開始后，濃縮膠內(nèi)的Cl-快速向陽極移動，蛋白質(zhì)和甘氨酸離子移動慢，從而形成一個高電位差，并加速了蛋白質(zhì)和甘氨酸離子向陽極移動。一定時間后，這兩種離子與Cl-的速度相差不大，而形成一個穩(wěn)定的不斷向前移動的界面。（三）解離和非解離系統(tǒng)

根據(jù)研究目的不同，聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖溶液可分為非解離系統(tǒng)和解離系統(tǒng)。

解離系統(tǒng)：在緩沖體系中加入解離劑，破壞分子內(nèi)的非共價鍵，適用于測量亞基分子量。常用：SDS，巰基試劑、尿素等。

非解離緩沖系統(tǒng):不加解離劑，分離天然蛋白質(zhì)。能保存天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象、亞基及其生物活性。

十二烷基磺酸鈉（SDS）1.陰離子表面活性劑：它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約1:2比例結(jié)合。破壞蛋白質(zhì)分子之間的氫鍵和疏水作用，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)，變成只含有一級結(jié)構(gòu)的肽，并保持蛋白的溶解性。其分離作用只受多肽分子的大小影響，蛋白質(zhì)在電場中的泳動距離只與分子量有關(guān)。2.SDS掩蓋蛋白質(zhì)本身所帶電荷，使蛋白質(zhì)能夠根據(jù)本身分子長度的大小帶有相應(yīng)的負電荷。每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負電荷，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，因此在進行電泳時，SDS-蛋白復合物在PAGE中的遷移速率只取決于蛋白的分子量大小。3.作用濃度8×10-4mol/L，1克蛋白質(zhì)幾乎能恒定地與1.4克SDS結(jié)合。4.以SDS作解離劑，天然細胞的胞溶物至少有90%可以進入凝膠。

尿素

1.通過破壞氫鍵起作用。2.作用濃度較高（8mol/L）。3.分離作用受分子大小和電荷雙重因素的影響，不能精確測定分子量。4.高達50%的復雜蛋白混合物不能進入凝膠。

聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點：

1.是目前分辨能力最高的電泳支持體；2.化學穩(wěn)定性好，純度高，溶解度小，無電離基團，隨pH值和溫度變化較少，無吸咐及電滲現(xiàn)象；3.通過改變交聯(lián)度調(diào)節(jié)孔徑大小，能精細地分離各種蛋白質(zhì)組分。

缺點:1.聚合容易受各種因素干擾;2.對神經(jīng)系統(tǒng)及皮膚有毒。五、聚丙烯酰胺凝膠電泳的用途

1.適用于少量樣品的分離鑒定;2.較多樣品的分離制備;3.測定蛋白質(zhì)或核酸的分子量、核酸的序列分析等。第三節(jié)常用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)

配液：丙烯酰胺溶液、過硫酸銨，TEMED，SDS等制膠：清洗玻璃板，組裝灌膠裝置，膠液混合、灌膠樣品處理：上樣樣品除鹽、上樣、Marker處理電泳：摸索適宜的電泳條件，保證實驗結(jié)果可重復性

染色，檢測，結(jié)果分析，可進一步做轉(zhuǎn)移或雜交

一、非解離不連續(xù)系統(tǒng)凝膠電泳（一）配液:

1.丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺單體固體狀態(tài)在室溫至少穩(wěn)定一年。長期貯存時丙烯酰胺單體可水解產(chǎn)生丙烯酸和氨。溶液在自然光和射線及超聲波引發(fā)下會發(fā)生聚合，應(yīng)裝入深色瓶中于4℃貯存。為了保證實驗結(jié)果及重復性，每次只應(yīng)制備供用1~2個月的丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺貯備液。2.TEMED

應(yīng)密封置于冰箱中貯存，使用的量應(yīng)使凝膠能在30～60分鐘內(nèi)聚合完成。3.過硫酸銨

應(yīng)在使用前配置。配置好的溶液應(yīng)在冰箱中存放，使用期不超過1星期。存放1星期后的過硫酸銨，可能仍會起作用，但不適用來作精細的分析工作。

（二）樣品制備

1.選擇合適的樣品緩沖液（1）選擇合適的pH和離子強度，保證樣品的溶解性、穩(wěn)定性和生物活性，通常使用與凝膠緩沖系統(tǒng)相同的pH。（2）為了觀察電泳前沿，在樣品緩沖液中應(yīng)加標志染料，堿性電泳一般用溴酚藍，酸性電泳則用甲基綠。（3）加入增加密度的甘油或蔗糖.2.樣品處理（參考）a.蛋白樣品制備、測定蛋白濃度；b.稀樣品濃縮，過柱除鹽；c.如溶解不佳，可加助溶劑，如用尿素和非離子去污劑NP-40等；d.按測定好的蛋白濃度，將蛋白樣品與一定比例的上樣緩沖液混合，于100℃沸水中煮沸5min，讓蛋白充分變性；e.離心去雜質(zhì)，避免電泳拖尾。

3.樣品濃度

取決于樣品的組成、分析目的和檢測方法，對未知樣品可作一個0.1~20mg/ml蛋白的稀釋系列，以尋找最佳加樣濃度。如用考瑪斯亮藍染色，可用1~2mg/ml的樣品，對高純度樣品0.5~2mg/ml蛋白為最佳。銀染色所用的樣品濃度可比考瑪斯亮藍染色低20~100倍。電泳后欲進行轉(zhuǎn)移，應(yīng)有足夠的樣品量。

注意:制備天然蛋白質(zhì)樣品在低溫（1~4℃）下進行，以防失活和減小蛋白酶對樣品的水解。短期保存:貯于4℃含甘油的樣品緩沖液中。若蛋白質(zhì)樣品在上述條件下穩(wěn)定，可冰凍長期保存。

4.蛋白標準的準備測定分子量時須準備蛋白標準樣品。選擇合適分子量范圍的市售蛋白標準，溶解在樣品緩沖液中，分裝，-20℃保存。

note：不要錯用蛋白標準。電泳的三部曲制膠電泳檢測

垂直板式電泳槽（三）制膠

電泳用玻璃板需在清洗液中侵泡過夜，然后用蒸餾水清洗，再用乙醇浸洗并干燥。組裝灌膠裝置。取出凝膠溶液平衡至室溫（23～25℃）；確定適宜的分離膠濃度后，按下表各組分（TEMED除外）配膠；用抽真空泵將混合液體脫氣5分鐘，加入TEMED，并溫和地混勻溶液；將膠液緩慢加入制膠裝置。試劑濃縮膠（T=5%）分離膠（T=15%）

雙蒸水膠儲（母）液分離膠緩沖液濃縮膠緩沖液

10%SDS10%過流酸銨

TEMEED5.5ml1.3ml——1.0ml0.08ml0.08ml0.15ml2.4ml5ml2.5ml——0.1ml0.05ml0.01mlSDS不連續(xù)電泳用凝膠配方（范例）（四）加樣和電泳

加樣：用微量注射器或微量移液器。

note:上樣時要保證每個泳道內(nèi)的總蛋白量相等，這樣才能比較不同樣品中目的蛋白含量的差異。注意事項：1.加樣器的頂端應(yīng)保持在凝膠表面以上1~2mm處，使加樣時的樣品與貯液槽緩沖液的混合減至最低程度。2.樣品加成細窄帶，以保證分辨率。3.凝膠中的空白樣品槽以等體積空白樣品緩沖液注滿，以防臨近帶擴散。4.陽極電泳樣品加在陰極側(cè)，陰極電泳樣品加在陽極側(cè)。

電泳：

1.加電泳緩沖液于電泳槽的下槽中。要從凝膠底部除氣泡，否則會妨礙凝膠和貯液槽緩沖液之間電路接觸。2.對于SDS或其它緩沖系統(tǒng)中帶負電荷的蛋白質(zhì)電泳，電源的正極與下槽相連，負極與上槽相連（若帶正電荷的蛋白質(zhì)電泳，則貯液槽的極性應(yīng)顛倒）。3.電泳：恒壓，恒流，恒功率。（五）凝膠的染色—分離區(qū)帶的檢出

1.蛋白質(zhì)的染色1)黑10B（amidoblack10B）2)考馬斯亮藍R-250（CoomassiebrilliantblueR-250）

3)考馬斯亮藍G-2504)固綠（fastgreen）5)普施安亮藍RS（ProcionbrillantblueRS）蛋白質(zhì)的一般染色方法固定和染色?？赏瑫r進行。因為，染料的溶劑一般就是固定劑。常用的幾種染色方法簡述如下：1）黑10B（amidoblack10B）用7％的醋酸配制0.5％～0.1％的染料溶液，浸染2～6小時，染色后用水洗。用7％的醋酸配制1％的染料溶液，96℃保溫染色10分鐘，可以改善對弱區(qū)帶的分辨率。2）考馬斯亮藍R-250a.先用12.5％三氯醋酸固定數(shù)小時，出現(xiàn)白色沉淀條紋后，在三氯醋酸中滴加少量1％考馬斯亮藍R-250溶液，過夜，用此法染色底色很淺，通常染色后不需要脫色。b.或用0.25％考馬斯亮藍R-250的甲醇-醋酸混合液（454ml50％的甲醇＋46ml冰醋酸）染色2～10小時。c.或先用20％磺基水楊酸固定18小時，然后用0.25％考馬斯亮藍R-250的無重金屬離子的水溶液染色0.5～2小時?；蛴?.25％考馬斯亮藍R-250的9％醋酸和45％甲醇混合液染色0.5～2小時。3）考馬斯亮藍G-250先在5％三氯醋酸中固定30分鐘，水洗幾次，然后用1％該染料的7％醋酸溶液，染色10分鐘。或用0.1％該染料的甲醇：水：醋酸（10：10：1v/v）混合液，染色30分鐘。

4）固綠（fastgreen）

用1％固綠的7％醋酸溶液，染色2小時。最好在10℃以下進行。5）普施安亮藍RS（ProcionbrillantblueRS）

先在20％磺基水楊酸固定0.5～2小時，然后用1％該染料的10％醋酸和50％甲醇混合液染色1～2小時。6）0.1％考馬斯亮藍R-250

溶劑使水：甲醇：冰醋酸（5：5：2），使用前用濾紙過濾去除不溶物。柱狀凝膠條室溫染色至少4小時。1.5mm厚的平板凝膠，室溫染色4～6小時。7）硫酸銅-考馬斯亮藍混合染色液

10g硫酸銅定溶于800ml蒸餾水中，再加入200ml醋酸作為染色貯備液A。3g考馬斯亮藍G-250溶于900ml甲醇中，再加蒸餾水至1000ml作為染色貯備液B。使用前等體積攪拌混合A和B。染色30分鐘至數(shù)小時視不同樣品而異。（2）含金屬蛋白質(zhì)的染色取醋酸鈉（三水合物）16g溶于100ml17％的醋酸中此溶液用1％EDTA-Na2溶液飽和，過濾，濾液再用聯(lián)苯胺鹽酸鹽飽和。再過濾，取濾液（貯存液10ml加入3％H2O20.1ml，然后將凝膠條浸入此混合溶液中），于20℃染色30～40分鐘。（3）脂蛋白的染色取50g蘇丹黑B（SudanblackB）溶于20ml丙酮中，然后加入15ml醋酸和80ml水的混合液，攪拌30分鐘后，離心。取上清液染色過夜。此染料僅在2天內(nèi)穩(wěn)定。（4）糖蛋白的染色所有操作應(yīng)在4℃下進行。將凝膠浸入含有2.5g過碘酸鈉、86ml水、10ml冰醋酸、2.5ml濃鹽酸和1g三氯醋酸和90ml水的混合液，洗滌8小時，其間更換幾次洗滌液。然后，取出凝膠再用Schiff試劑染色16小時。再在1gKHSO4和20ml濃鹽酸及980ml水的混合液中浸洗2次，2小時。也可再用0.5％氨基黑10B的5％醋酸溶液在20℃復染2小時。（5）核酸的染色1)RNA的染色

在0.5％焦寧

Y（pyronineY）(用醋酸：甲醇：水=1：1.8v/v為溶劑)和1％乙酸鑭混合液中，染色16小時。

或先在1mol/L醋酸中固定10～15分鐘，然后用2％次甲基藍的1mol/L醋酸溶液染色2～4小時?；蛴?.05％甲苯胺藍

O（toluiclineblueO）的15％醋酸溶液染色1～2小時?；蛴娩寤义V熒光染料染色。方法是：用電泳緩沖液作溶劑，配制溴化乙錠（ethidiumbromide）的濃度為1μg/ml，浸染20～30分鐘，然后在紫外分析燈（253nm）下觀察熒光。2)DNA的染色

0.25％甲基綠溶于0.2mol/LpH4.1的醋酸緩沖液中，用氯仿抽提至無紫色。然后，將凝膠浸入其中，室溫染色1小時。或用2％焦寧Y-1％乙酸鑭-15％醋酸混合溶液，染色過夜?；蛴娩寤义V染色，方法同RNA。藍染色：考馬斯亮藍（

R-250）方法：可先固定，再進行染色和脫色。或同時進行固定和染色，再脫色。時間：固定和染色的時間取決于凝膠的厚度，孔徑及有否支持膜。加速染色和脫色：加溫、攪拌染色液和脫色液。

銀染色的原理是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。

在銀染過程中，首先要將蛋白質(zhì)固定,以阻滯它們在凝膠中的擴散。去除干擾染色過程的物質(zhì)，如去污劑，還原試劑和緩沖液的成份（如甘氨酸）。

銀染色：

銀染色的顯色方法：

化學顯色（chemicaldevelopment）雙胺銀染法（diaminesilverstains）;雙胺化學顯色銀染法（nondiaminesilverstains）。

光顯色（photodevelopment）

光還原銀離子成金屬銀，使用單一染色溶液可完成。

2.脫色

擴散脫色法：將凝膠轉(zhuǎn)移至脫色液中脫色。

電泳儀脫色:由于考馬斯藍是陰離子型染料，所以可用脫色儀用7％醋酸充滿，脫色15－30分鐘內(nèi)完成。

（六）電泳后的凝膠干燥目前有兩種方法：>1.0mm厚度凝膠：凝膠干燥儀<1.0mm厚度凝膠：自然干燥法二、濃度梯度凝膠電泳（gradientgel）

是指分離膠部分由一定的濃度梯度組成，梯度膠適合于復雜樣品的分析。（一）基本原理在同一凝膠柱（或板）中，從上到下形成不同濃度凝膠；凝膠孔徑大小相應(yīng)成梯度。（二）凝膠濃度梯度分類階梯式連續(xù)濃度梯度直線性連續(xù)濃度梯度指數(shù)的連續(xù)濃度梯度（三）濃度梯度凝膠電泳的優(yōu)缺點優(yōu)點：1.具有濃縮樣品組分的作用，稀樣品分次加樣。2.能提供更清晰的蛋白質(zhì)譜帶，用于鑒定蛋白質(zhì)的純度。3.可以在一個凝膠片上同時測量分子量范圍相當大的蛋白質(zhì)，如：膠濃度4－30％梯度膠可以分辨的分子量為50,000-2,000,000。4.可以直接測定天然狀態(tài)蛋白質(zhì)的分子量，不需解離為亞基。這一方法可與SDS凝膠電泳測定分子量的方法相互補充。

缺點：主要適宜于測定球蛋白的分子量，對纖維蛋白（線形）將產(chǎn)生較大的誤差。（四）梯度凝膠電泳法測定蛋白的分子量1.儀器的準備1）垂直板型電泳槽；2）梯度混合器。2.5-20％梯度膠的制備多采用SDS-不連續(xù)緩沖系統(tǒng)。注意事項:（1）兩種濃度膠液，高濃度的丙烯酰胺混合液有15％（重量／體積）蔗糖，穩(wěn)定密度梯度。（2）聚合催化劑的數(shù)量適當減少，以防早凝.三、蛋白分子量的測定1.標準曲線的制作

以凝膠片的前沿或遷移距離最大的標準蛋白質(zhì)為參考點，計算每種標準蛋白質(zhì)的相對遷移率（Mr）

2.蛋白質(zhì)的MW與電泳遷移率(m)間的關(guān)系

MW=K(10-bm)lgMW=lgK-bm=k1-bm

未知樣品分子量的測定：

測量出未知蛋白質(zhì)的相對遷移率，利用標準曲線便可計算出分子量。標準蛋白質(zhì)在SDS凝膠上的分離示意圖加樣孔電泳方向染料前沿染料遷移距離樣品遷移距離123451.細胞色素C2.胰凝乳蛋白酶原3.胃蛋白酶4.卵清蛋白5.牛血清白蛋白6.測試樣品lgMWmlgMW=k1-bm6m6lgMW6四、Westernblot（蛋白印跡）

將經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到固相支持物上（如NC膜、PVDF膜），用特異性一抗與膜上的蛋白結(jié)合，再用酶標二抗（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶）與特異性一抗作用，最后以發(fā)色底物顯色。（一）轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)）

按蛋白分子量大小確定合適的電壓或電流以及轉(zhuǎn)膜時間：1.分子量較小的蛋白（30-50kDa），轉(zhuǎn)膜條件為50V，2h；2.分子量較大的蛋白（>100kDa），轉(zhuǎn)膜時100V，2h，在冷環(huán)境下完成。（二）封閉封閉的作用：PVDF膜在活化后是帶電的，因而在轉(zhuǎn)膜時會吸附蛋白。為阻止PVDF膜與抗體（蛋白）的非特異性結(jié)合。用脫脂奶粉或BSA將PVDF膜上無蛋白的部分空隙填滿，以免孵育抗體的時候一抗二抗與之結(jié)合，產(chǎn)生非特異條帶或者是背景雜亂。5%脫脂奶粉或5%BSA，室溫2h/4℃過夜。（三）抗體孵育膜浸泡在一抗工作液里，4℃孵育過夜（室溫2-3h）。2.膜浸泡在二抗工作液里，37℃或室溫孵育1-2h。（四）顯色辣根過氧化物酶標記二抗：DAB顯色，或ECL發(fā)光成像；2.堿性磷酸酶標記二抗：CIP/NBT顯色。DAB顯色ECL發(fā)光成像BCIP/NBT顯色第四節(jié)等電聚焦電泳（Iso-electricfocusing,IEF）

一、概述依據(jù)蛋白質(zhì)具有兩性解離及等電點（PI）的特征，利用具有pH梯度的電泳介質(zhì)來分離pI不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)，主要特點是靈敏度及分辨率高，其分辨率較不連續(xù)性PAGE更高，可達0.02pI，特別適合于分離分子量相同而電荷量不同的兩性大分子；重復性好，適用于大批量純度檢測和真實性鑒定以及遺傳多樣性等群體生物學領(lǐng)域的研究。二、基本原理

將蛋白質(zhì)放在由兩性電解質(zhì)形成的pH梯度中，可以依不同蛋白質(zhì)的等電點不同，達到分離的目的。

RCOO-

NH3

+H+OH-RCOOHNH3

+RCOO-NH2移向負極移向正極pH=pIpH>pIpH<pI

在沒有電場時，載體兩性電解質(zhì)溶液的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值(如pH3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液，其pH約為6.5左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷，只是在溶液中的正電荷和負電荷數(shù)目相等，凈電荷為零。引入電場時，載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽極移動，最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移。（一）電場下載體兩性電解質(zhì)的變化

+–--------------------------––––+++++---------+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++---------------------------------------

----------–––––---

++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++—+—載體兩性電解質(zhì)在電場中形成pH梯度的模式圖+：常為磷酸、硫酸、醋酸等-：常為氫氧化鈉、氫氧化銨等(1)靠近陽極端的載體兩性電解質(zhì)，電負性最強，具有較強的緩沖氫離子的能力，使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI，一直向陰極順延；(2)靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì)，電正性最強，具有較強的緩沖氫氧根離子的能力，使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI，一直向陽極順延。利用兩性電解質(zhì)載體形在電泳系統(tǒng)中建立一個由陽極至陰極，pH由低到高，即環(huán)境由酸到堿的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度。處于這個系統(tǒng)的各種蛋白質(zhì)分子將根據(jù)各自的pI值與所處位點的pH值的差別帶上正電或負電。當其處在低于其本身等電點的環(huán)境中則帶正電荷，向負極移動；若其處在高于其本身等電點的環(huán)境中，則帶負電向正極移動。當泳動到其自身特有的等電點時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零。具有不同等電點的蛋白質(zhì)最后聚焦在各自等電點位置，形成一個個清晰的區(qū)帶，分辨率極高。電泳管介質(zhì)中穩(wěn)定的pH梯度蛋白質(zhì)在pH梯度中的形成示意圖電泳行為

-------pHpHbpI0pHapHpH--------------pHbpHbpInpI1pHapHa+++---pI2+-------pH增加pH=pI-+pI1pI4pI3pI2pI5a:分子在負極端b:分子在正極端C:各蛋白質(zhì)組分聚焦成分散的區(qū)帶acb（二）兩性電解質(zhì)載體

pH梯度制作利用的兩性電解質(zhì)是一種多羥基、多氨基的小分子脂肪族化合物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場作用下，自然形成穩(wěn)定的pH梯度。能建立pH梯度兩性電解質(zhì)，常稱為載體，商品名稱因生產(chǎn)公司不同而異。如:LKB-ampholine、PhamaciaPharmalyte、Bio-Rad-Lyte等。①各組的PI彼此十分接近，并在其等電點附近有良好的緩沖能力，保證pH梯度的穩(wěn)定；②各成分的導電能力彼此接近，使電泳介質(zhì)中電位降分布均勻，以免聚焦時，局部過熱而影響分離或影響樣品性質(zhì)；③分子量低，能與樣品分離；④化學性能穩(wěn)定，與被分離物質(zhì)不起化學反應(yīng)，也無變性作用；⑤在280nm處紫外吸收值低，不干擾樣品的測定。

理想的兩性電解質(zhì)載體需要具備以下特點：

兩性電解質(zhì)的選擇：

根據(jù)蛋白質(zhì)的PI而定。如知道某種蛋白質(zhì)的PI值，即應(yīng)選擇包括此PI在內(nèi)的小范圍的兩性電解質(zhì)，如不清楚測定或分離的蛋白質(zhì)的pI值，則可采用pH值較廣的（pH3-10）的兩性電解質(zhì)，待了解PI后，再選用窄范圍的兩性電解質(zhì)，以便獲得較高的分辨率。（三）支持介質(zhì)

即凝膠物質(zhì)，以形成穩(wěn)定pH梯度，減少對流后擴散的影響。有PAG、葡聚糖或瓊脂糖凝膠。聚丙烯酰胺凝膠（采用5％凝膠）彈性好。濃度高時有分子篩作用，不適用于大分子物質(zhì)的分離。分子量超過1.0×105的蛋白分子采用低濃度（2％－3％）聚丙烯酰胺，再根據(jù)需要加入0.5％－1％的瓊脂糖，才能保持較好的機械強度。三、IEF分類1.載體兩性電解質(zhì)pH梯度(carrierampholytepHgradient)等電聚焦：即在電場中通過兩性緩沖離子建立pH梯度。2.固相pH梯度(immobilizedpHgradients,IPG)等電聚焦：是利用一系列具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物滴定時，在滴定終點附近形成pH梯度，并參與丙烯酰胺的共價聚合形成固定的、不隨環(huán)境電場條件變化的pH梯度，分辨率可達0.001pH。3.載體兩性電解質(zhì)/固相pH梯度混合技術(shù)：即在固相pH梯度凝膠中加入載體兩性電解質(zhì)作為添加劑，被稱為“雜交等電聚焦”。固相pH梯度等電聚焦與載體兩性電解質(zhì)等電聚焦的區(qū)別：前者不是兩性分子，在凝膠聚合時便形成pH梯度；后者是兩性分子，在電場中兩性分子遷移到自己的等電點而形成pH梯度。

1.配膠膠液組成為載體兩性電解質(zhì)、凝膠貯液、蒸餾水、混合樣品、染色物質(zhì)等；2.灌膠注意不要產(chǎn)生氣泡，冷卻2h后可接入電泳池；3.加電極液4.電泳5.樣品收集檢測四、簡單操作步驟（一）常用電泳儀（二）凝膠的制備等電聚焦電泳可采用兩種方式：柱狀：垂直式。板狀：水平板電泳。五、電泳（聚焦）聚焦：陽性溶液采用稀酸，如2％硼酸溶液或0.1MH3PO4；陰性溶液采用稀堿，如0.5％（V／V）乙醇胺溶液或0.1MNaOH。提高分辨力：高電壓，配有相應(yīng)的冷卻系統(tǒng)。樣品低鹽：濃度<5-10M，如果樣品在低鹽濃度下溶解度不好，可適當加入非離子型的去污劑增溶。上樣：柱狀電泳可直接在頂部上樣，或混入膠液中一起制膠，板狀聚焦可將樣品滴在濾紙片上放在凝膠表面。六、染色、脫色

染色：兩性電解質(zhì)可和蛋白質(zhì)染料結(jié)合，聚焦后不能直接染色，要先固定，即把膠浸在5％的三氯醋酸溶液中，同時去除兩性電解質(zhì)。再用考馬斯亮藍染色。

脫色：用7％－10％的醋酸脫色。七、pH梯度的測定和PI的確定方法1：將聚焦后的凝膠順pH的方向切成若干等份（如0.5cm為一段），各小段凝膠分別浸泡在雙蒸水(1ml)中過夜，測定pH?；蛑苯佑帽砻嫖㈦姌O在膠面上讀出不同位置的pH值。方法2：標準曲線法

加入等電聚焦mark作為標準，以膠的長度為橫坐標，pH值為縱坐標，繪制膠內(nèi)的pH梯度線性曲線。從蛋白質(zhì)染色位置上結(jié)合標準曲線判定PI值。

八、等電聚焦中注意的幾點1.選擇合適的pH梯度。2.IEF如在寬pH范圍內(nèi)進行，為了克服在中性區(qū)域形成純水區(qū)帶，可適當添加中性載體兩性電解質(zhì)。3.為防止電泳過程中pH梯度的衰變，應(yīng)在電流降低達最小而恒定時盡快結(jié)束IEF。4.為防止蛋白質(zhì)沉淀，可在樣品中添加脲，TritonX-100或其他非離子表面活性劑。5.IEF樣品應(yīng)除鹽。6.所用試劑要求高純度。九、IEF的優(yōu)點1）分辨率高，可分辨相差0.01pI單位的蛋白組份。2）樣品體積和加樣位置不受嚴格限制，樣品可混入膠中或放在任何位置。3）蛋白質(zhì)分離快速，一般可在2小時完成。電泳結(jié)束即可測定蛋白質(zhì)pI。4）載體兩性電解質(zhì)分子量小，不易與蛋白質(zhì)反應(yīng)和使之變性，因此只需硫酸銨沉淀，通過透析和分子篩、電泳等方法很易與蛋白質(zhì)分開。5）IEF分離獲得的蛋白質(zhì)基本上可保持原有的生物活性。

十、IEF的缺點：1.許多蛋白質(zhì)在pI附近會產(chǎn)生沉淀2.高電壓，產(chǎn)熱高，樣品中除鹽，造成蛋白質(zhì)溶解差；3.兩性電解質(zhì)可與蛋白質(zhì)間有靜電作用而緊密結(jié)合，形成的復合物可能導致它與抗體反應(yīng)降低或使酶活性降低?？赏ㄟ^高離子濃度（0.1mol/L或更大到0.5mol/L）、pH7左右的揮發(fā)性緩沖液破壞它們的靜電作用。十一、等電聚焦電泳的應(yīng)用

IEF是一種簡便、快速、高效的分離分析方法，特別適用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶類和抗體等的分離分析。能夠滿足組分定量、雜質(zhì)檢出、質(zhì)量控制、臨床診斷等方面的要求。目前在同功酶的鑒定及蛋白質(zhì)的微量分析(10~50μg)上應(yīng)用尤為廣泛。隨著生命科學的發(fā)展，特別是人類基因組計劃(HGP)全面完成之后，所謂“后基因組”時代的來臨，對復雜生命體系的準確表征和分析就顯得日益緊迫，其中蛋白質(zhì)組研究是一個極其重要的部分。歷史：

1975年O’Farrell首先建立

雙相凝膠電泳實質(zhì)：

第一相(向)：等電聚焦電泳，蛋白質(zhì)根據(jù)電荷分離。第二相(向)：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小分離第五節(jié)雙相凝膠電泳（IEF／SDS)

(一)雙相電泳特點：

避免了兩種或兩種以上的多肽，特別是復雜的蛋白質(zhì)混合物在同一蛋白區(qū)帶共同遷移的現(xiàn)象。多肽的共同遷移不僅掩蓋了蛋白質(zhì)真實的復雜性，也掩蓋了各區(qū)帶中某些組成數(shù)量上的變化。雙相電泳的兩相根據(jù)不同原理進行分離，除能改善分離外，若分離條件理想，還可獲得與多肽基本參數(shù)有關(guān)的更多資料。

（二）雙向電泳意義1.當前分子生物學研究領(lǐng)域中常用的技術(shù)。對于生物大分子蛋白質(zhì)的分離和分析極為精確而有效。唯一的可用于對大量蛋白質(zhì)混合物進行同時平行定量的技術(shù)。廣泛應(yīng)用于真核和原核生物許多類型的細胞蛋白質(zhì)研究。2.短時高效。IEF可在2－4小時完成，垂直板電泳可在35－45分鐘內(nèi)完成。雙向電泳可在一天內(nèi)完成。3.分離復雜的蛋白混合物，高分辨率，常規(guī)至少可分離2000個蛋白，<1ng4.電泳根據(jù)等電點和分子量反映蛋白表達差異，鑒定蛋白亞型，發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾的蛋白（如磷酸化、糖基化）。5.結(jié)合同位素標記蛋白質(zhì)技術(shù)可分辨出細胞中1000多個多肽，并可探測到細胞總蛋白0.001％或更少的量。6.結(jié)合質(zhì)譜或Edman蛋白測序，對蛋白進