第五章-熒光分析法-scf

本章學(xué)習(xí)目標(biāo)：1、掌握分子熒光分析法的基本原理和特點(diǎn)

2、掌握熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系以及影響熒光強(qiáng)度的因素

3

、熟悉熒光定量分析方法及熒光分光光度計(jì)

4、了解分子熒光分析法的應(yīng)用第05章熒光分析法1處于基態(tài)的分子吸收能量后，躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)分子以發(fā)射光的形式釋放能量，返回基態(tài)的過程，稱為分子發(fā)光。

一、什么是分子發(fā)光？

分子熒光分析法2

二、分子發(fā)光的分類(按激發(fā)的模式

)分子發(fā)光熱致發(fā)光光致發(fā)光場致發(fā)光化學(xué)發(fā)光熒光☆磷光分子熒光分析法3分子熒光分析法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高；選擇性好；試樣用量少；方法簡單。光致發(fā)光：物質(zhì)分子吸收電磁輻射能后，將從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子發(fā)射出光的現(xiàn)象，稱為光致發(fā)光。最常見形式是熒光和磷光。熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)的熒光光譜的特征及強(qiáng)度對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法，稱之為熒光分析法。4第一節(jié)分子熒光分析法的基本原理（重點(diǎn)）一、分子熒光的產(chǎn)生單重態(tài)（S）：s=0，M=1，分子所處的電子能態(tài)。三重態(tài)（T）：s=1，M=3，分子所處的電子能態(tài)。1.分子的電子能級和激發(fā)過程分子電子能級的多重性：總自旋量子數(shù)：E自旋量子數(shù)：s=?或-?

泡利不相容原理52.熒光的產(chǎn)生

在單重激發(fā)態(tài)中，兩個電子平行自旋，單重態(tài)分子具有抗磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命大約為10-8s，而三重態(tài)分子具有順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4

~1s以上（通常用S和T分別表示單重態(tài)和三重態(tài)）。電子能級的多重性：M=2s+1，s（總自旋量子數(shù)）6根據(jù)波茲曼分布，分子室溫基本處于電子能級的基態(tài)，激發(fā)時，基態(tài)電子只能躍遷到激發(fā)單重態(tài)，不能直接躍遷到激發(fā)三重態(tài)（根據(jù)自旋禁阻定律）。電子處于激發(fā)態(tài)（不穩(wěn)定狀態(tài)），可通過無輻射躍遷和輻射躍遷(發(fā)光)等方式失去能量，返回基態(tài)。2.熒光的產(chǎn)生能量傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光系間竄躍無輻射躍遷振動弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換7

在同一電子能級中，電子由高振動能級轉(zhuǎn)至低振動能級，而將多余的能量以無輻射形式放出的過程。（1）振動弛豫無輻射方式傳遞途徑振動弛豫時間:10-12秒數(shù)量級8

當(dāng)兩個電子激發(fā)態(tài)之間的能級非?？拷灾疗湔駝幽芗売兄丿B時，常發(fā)生電子由高能級以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低能級的過程。如右圖，處于高激發(fā)態(tài)（S2）的電子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)移到低激發(fā)態(tài)（S1）的振動能級。（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換9

激發(fā)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用而失去能量，并以熱能的形式釋放能量的過程。外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為“熄滅”或“猝滅”。（3）外轉(zhuǎn)換10

處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程。如圖，電子S1的振動能級同T1的振動能級重疊，則可能發(fā)生體系間跨越S1→T1

，分子由激發(fā)單重態(tài)跨越到激發(fā)三重態(tài)，熒光強(qiáng)度減弱甚至熄滅。（4）系間竄躍11

物質(zhì)分子吸收能量被激發(fā)后，從激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時發(fā)射出的光，稱為熒光。注意：無論電子開始被激發(fā)至哪一個激發(fā)單重態(tài)，經(jīng)過振動弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)換，均可回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，然后再以輻射形式發(fā)射光而返回至基態(tài)各振動能級上。

熒光的產(chǎn)生在10-7-10-9s內(nèi)完成。

（1）發(fā)射熒光輻射方式傳遞途徑12

電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，以系間竄躍方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)三重態(tài)最低振動能級返回至基態(tài)時發(fā)射的光，稱為磷光。由于（T1→S0）這個躍遷過程也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為10-4-10s。因此，這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時間。（2）發(fā)射磷光13

熒光和磷光產(chǎn)生示意圖S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫14二、激發(fā)光譜與熒光光譜激發(fā)光譜（excitationspectrum）：使不同激發(fā)波長的入射光激發(fā)熒光體，然后讓所產(chǎn)生的熒光通過固定發(fā)射波長的單色器而照到檢測器上，測定不同激發(fā)波長光照射下熒光強(qiáng)度的變化，以激發(fā)波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，可得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。注意：激發(fā)光譜與其吸收光譜極為相似，但激發(fā)光譜曲線是熒光強(qiáng)度與波長的關(guān)系曲線，吸收曲線則是吸光度與波長的關(guān)系曲線，兩者性質(zhì)是不同的。15二、激發(fā)光譜與熒光光譜16熒光光譜（fluorecencespectrum）：固定激發(fā)光波長（為最大激發(fā)波長）和強(qiáng)度，而讓熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光通過發(fā)射單色器分光掃描并檢測不同發(fā)射光波長下的熒光強(qiáng)度，以發(fā)射波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得到物質(zhì)的熒光光譜。熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長（ex）和最大發(fā)射波長（em）是鑒定物質(zhì)的根據(jù)；也是定量測定最為靈敏的條件。17B.發(fā)射光譜(熒光光譜)固定激發(fā)波長掃描發(fā)射波長C.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關(guān)系S04321S14321發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)：分子的激發(fā)光譜可能含有幾個激發(fā)帶，但發(fā)射光譜只含一個發(fā)射帶；即使分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)，由于經(jīng)過極快的內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫降到S1電子態(tài)的最低振動、轉(zhuǎn)動能級，然后以輻射形式釋放能量回到基態(tài)。ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)1→

41→

31→

21→11

→11

→21

→31

→4181.斯托克斯位移(Stokesshift):熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)光譜波長的現(xiàn)象。室溫下菲的乙醇溶液熒光光譜熒光光譜的特征（重點(diǎn)）192.熒光光譜與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，從而熒光發(fā)射光譜只有一個發(fā)射帶，而且熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。3.熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系激發(fā)光譜與熒光光譜成對稱鏡像關(guān)系。20nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0c0c1c2c3c4蒽的激發(fā)光譜（虛線）熒光光譜（實(shí)線）蒽的能級躍遷V=0V=1V=2V=3V=4V=0V=1V=2V=3V=4b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4?E4?E3?E2?E1?E4?E3?E2?E121（一）分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件：三、熒光強(qiáng)度與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光；②吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。22熒光效率（fluorescenceefficiency):指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的量子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的量子數(shù)之比，常用表示。2324

（重點(diǎn)）252627282930三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素1、溫度2、溶劑：極性、粘度3、酸度：熒光物質(zhì)自身最適宜的pH范圍4、熒光熄滅劑：主要四種類型5、散射光：瑞利光、拉曼光31五、影響熒光強(qiáng)度的外部因素溫度降低，熒光效率和熒光強(qiáng)度升高。1）溫度2）溶劑隨著溶劑的極性的增加，熒光物質(zhì)的π→π*躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長也發(fā)生紅移；溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度降低；溶劑應(yīng)達(dá)到足夠的純度。323）pH值具酸或堿性基團(tuán)的熒光物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變。熒光物質(zhì)都自身最適宜的pH范圍。NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+33熒光淬滅（熒光熄滅）：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光淬滅。熒光淬滅劑：能引起熒光熄滅的物質(zhì)。4)熒光淬滅碰撞淬滅M+hv→M*,M*+Q→

M+熱靜態(tài)淬滅M+Q→

MQ

非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)入三重態(tài)的淬滅三重態(tài)，氧的作用熒光物質(zhì)的自淬滅熒光物質(zhì)濃度較高導(dǎo)致熒光淬滅的四種原因：34熒光淬滅法:

熒光物質(zhì)加入某種淬滅劑后，其熒光強(qiáng)度的減少與熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，可用于測定熄滅劑的含量，這種方法稱為熒光淬滅法。355)散射光瑞利散射光(Rayleighscatteringlight)：光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，運(yùn)動方向改變；λ瑞利光＝λ入射光拉曼散射光(Ramanscatteringlight)：光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，發(fā)生能量交換，運(yùn)動方向改變；λ拉曼光≠λ入射光消除方法：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長36320360448激發(fā)

320nm硫酸奎寧350448激發(fā)

350nm硫酸奎寧320360激發(fā)

320nm0.1mol/L硫酸350400激發(fā)

350nm0.1mol/L硫酸a.強(qiáng)度b.強(qiáng)度硫酸奎寧在不同激發(fā)波長下的熒光（a）與拉曼光譜（b）372、定量方法

1、定量依據(jù)

第二節(jié)熒光定量分析方法38

優(yōu)點(diǎn)

1.靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；檢測下限：0.1～0.001g/mL2.選擇性強(qiáng)既可依據(jù)發(fā)射光譜特征，又可根據(jù)激發(fā)光譜特征；

3.試樣量少和方法簡單

缺點(diǎn)應(yīng)用范圍小391、定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If

正比于吸收的光強(qiáng)度

Ia和熒光量子產(chǎn)率Φ：由朗伯-比耳定律得：熒光強(qiáng)度If

：40對于稀溶液，當(dāng)2.303bC<0.05時：

If

----熒光強(qiáng)度I0

----入射光強(qiáng)度Φf----熒光量子產(chǎn)率b--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--物質(zhì)濃度412、定量方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法：FCsFxCx42直接比較法注意：樣品與標(biāo)樣溶液濃度接近，在線性范圍內(nèi)步驟：1.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液2.測IF3.求濃度43對于熒光法F=2.3kI0ECl

FI0，I0

增強(qiáng)，F(xiàn)增大；低濃度時，F(xiàn)C

只要檢測器靈敏，可檢測微弱信號。對于分光光度法A=-lgT=ECl

C極小時，A0，無吸收； 若C不變，改變?nèi)肷涔釯0強(qiáng)度，A無變化。 所以吸收光譜受一定限制，靈敏度小于熒光光譜。為什么熒光分析法比紫外可見法更靈敏？44

用于測量熒光的儀器由激發(fā)光源、樣品池、用于選擇激發(fā)光波長和熒光波長的單色器以及檢測器四部分組成。由光源發(fā)射的光經(jīng)第一單色器得到所需的激發(fā)光波長，通過樣品池后，一部分光能被熒光物質(zhì)所吸收，熒光物質(zhì)被激發(fā)后，發(fā)射熒光。

第三節(jié)熒光分光光度計(jì)45氙燈氙燈問題：熒光分光光度計(jì)與紫外-可見分光光度計(jì)有何異同點(diǎn)？46紫外-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光分光光度計(jì):光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器474849紫外-可見分光光度計(jì)

測量池(吸收池)熒光分光光度計(jì)樣品池I0ItI0ItIF,p50 在測量分子熒光強(qiáng)度時，要在與入射光成直角的方向上進(jìn)行測量，這是由于（）A.只有在入射光線成直角的方向上才有熒光B.熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度小C.熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度大D.熒光波長比透射光波長長E.熒光是向各個方向發(fā)射的，為了減小透射光的影響 熒光分光光度計(jì)常使用的光源是（）A.空心陰極燈B.氙燈C.氫燈D.硅碳棒BE51儀器的校正（1）靈敏度的校正 一定濃度的穩(wěn)定熒光物質(zhì)作對照品溶液調(diào)儀器 （如1ug/ml硫酸奎寧）（2）波長校正汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線（3）激發(fā)光譜和熒光光譜的校正光源強(qiáng)度、檢測器的感應(yīng)度52熒光分析法的應(yīng)用（1）無機(jī)化合物的分析采用有機(jī)試劑進(jìn)行熒光分析的元素已近70多種能夠與金屬離子形成熒光絡(luò)合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物。（分子剛性平面結(jié)構(gòu)增大）另一類絡(luò)合物是三元離子締合物。 例：羅丹明B為陽離子熒光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等陽離子首先與鹵素離子形成二元絡(luò)陰離子，再與羅丹明B締合形成熒光化合物。熒光猝滅法也是常采用的方法。53脂肪族有機(jī)化合物本身能發(fā)熒光的很少，需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光，可直接用熒光法測定。對具有致癌活性的多環(huán)芳烴，熒光分析法已成為最主要的測定方法。在生物化學(xué)分析、生理醫(yī)學(xué)研究和臨床、藥物分析領(lǐng)域，許多重要的分析對象，如維生素、氨基酸和蛋白質(zhì)、胺類、甾族化合物、酶和輔酶等，均可用熒光法分析。（2）有機(jī)化合物的分析54熒光分