項目四發(fā)酵工業(yè)的無菌操作

項目四

發(fā)酵工業(yè)的無菌操作發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略發(fā)酵工業(yè)無菌操作的基本概念發(fā)酵工業(yè)的無菌操作技術(shù)發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌空氣除菌一、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略什么是染菌？即“雜菌污染”，是指在發(fā)酵培養(yǎng)中侵入了除菌種外，有礙生產(chǎn)的其他微生物。（一）污染的危害雜菌大量消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，使生產(chǎn)菌的生產(chǎn)能力下降雜菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，增加了發(fā)酵液中雜質(zhì)類型或改變了發(fā)酵液理化性質(zhì)，從而導(dǎo)致增加了下游產(chǎn)物分離純化的難度，造成產(chǎn)物收率降低或產(chǎn)品質(zhì)量下降。（降低發(fā)酵產(chǎn)率、提取得率、產(chǎn)品質(zhì)量）雜菌代謝會改變培養(yǎng)體系的pH，使發(fā)酵過程異常。雜菌的代謝可能會降解產(chǎn)物，使產(chǎn)物得率降低。若細菌的培養(yǎng)過程中被噬菌體污染，細菌細胞會破裂，造成發(fā)酵失敗。1.染菌對不同發(fā)酵過程的影響A．細菌谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大。肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌，營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴重抑制菌生長和合成代謝產(chǎn)物。（1）染菌對不同菌種發(fā)酵的影響B(tài).霉菌

PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞，發(fā)酵一無所獲。

檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。

C.酵母菌:易污染細菌以及野生酵母菌

D.疫苗：無論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。

2023/2/3（2）染菌種類對發(fā)酵的影響2023/2/3青霉素：怕染細短產(chǎn)氣桿菌鏈霉素：怕染細短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌四環(huán)素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌檸檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續(xù)污染2.染菌發(fā)生的不同時期對發(fā)酵的影響種子培養(yǎng)期發(fā)酵前期發(fā)酵中期發(fā)酵后期（1）種子培養(yǎng)期染菌菌體濃度低、培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，較易染菌，應(yīng)嚴格控制。若將污染的種子帶入發(fā)酵罐，則損失更大，因此一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)立即滅菌丟棄，并對種子罐、管道等進行仔細檢查和徹底滅菌。

采用備用菌種或以無污染的適當(dāng)菌齡的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液作為種子，接入新鮮培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。2.染菌發(fā)生的不同時期對發(fā)酵的影響（2）發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期易染菌，且危害很大，需特別注意防止一旦發(fā)現(xiàn)染菌，如原料營養(yǎng)還比較豐富，則進行重新滅菌、接種發(fā)酵；如已消耗較多營養(yǎng)物質(zhì)，則放掉部分料液、補充新鮮培養(yǎng)基，重新滅菌、接種發(fā)酵。2.染菌發(fā)生的不同時期對發(fā)酵的影響（3）發(fā)酵中期染菌中期染菌會造成發(fā)酵異常，產(chǎn)物產(chǎn)量下降，應(yīng)盡力做到早發(fā)現(xiàn)、快處理。可通過加入一部分發(fā)酵旺盛的培養(yǎng)料，調(diào)節(jié)通風(fēng)、溫度、pH等措施挽救，如發(fā)酵單位到達一定水平則可提前放罐。2.染菌發(fā)生的不同時期對發(fā)酵的影響（4）發(fā)酵后期染菌后期染菌對抗生素、檸檬酸發(fā)酵影響不大，但對氨基酸、核苷酸等破壞較大。發(fā)酵后期如染菌量不多，可繼續(xù)發(fā)酵。如染菌嚴重，破壞性較大，可提前放罐。2.染菌發(fā)生的不同時期對發(fā)酵的影響3.染菌程度對發(fā)酵的影響發(fā)酵罐中的雜菌數(shù)量越多，即染菌程度越大，則對發(fā)酵的危害越大。如生產(chǎn)菌大量繁殖后，發(fā)酵物中含少量雜菌，如每升發(fā)酵液中有1-2個雜菌，一般對發(fā)酵沒有什么影響。4.染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響對過濾的影響染菌后特別是污染細菌后，發(fā)酵液一般發(fā)粘，導(dǎo)致過濾困難?？刹扇〖訜?、添加助濾劑等措施，或加絮凝劑使蛋白質(zhì)沉淀，有利于過濾。4.染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響對提煉與產(chǎn)品質(zhì)量的影響染菌發(fā)酵液中含有較多水溶性蛋白和其它雜質(zhì)。增加提煉難度，增加產(chǎn)物提取成本，降低產(chǎn)物純度。4.染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響二、雜菌污染的防治某藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析1.污染雜菌的檢測檢查雜菌的方法，要求準確可靠和快速，這樣才能在短時間內(nèi)獲得效果，主要方法有：

顯微鏡檢查平板劃線檢查肉湯培養(yǎng)檢查發(fā)酵過程異常觀察前3種檢查法未發(fā)現(xiàn)染菌，還不能肯定未被染菌；原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度較大的染菌情況（>1個/ml）發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象菌體生長差；pH值過高或過低；溶解氧水平異常；泡沫過多；菌體濃度過高或過低；CO2排放異常溶解氧水平異常變化顯示染菌發(fā)酵時間溶氧濃度正常發(fā)酵污染噬菌體發(fā)酵時間溶氧濃度正常發(fā)酵污染好氣性雜菌污染嫌氣性雜菌CO2異常顯示染菌工藝一定，尾氣中CO2量變化有一定規(guī)律污染雜菌，糖耗加快，尾氣中CO2量增加污染噬菌體，糖耗減慢，尾氣中CO2量減少2.污染噬菌體的檢測噬菌體是什么？噬菌體是病毒的一種，是一種極微小的生物，體積是細菌的1/1000左右，它可以通過細菌過濾器，只有在電子顯微鏡下才能看到。26消除潛在的污染隱患-1涉及菌體相關(guān)的操作要盡可能在生物安全柜中進行；在菌體培養(yǎng)過程中，盡量不要打開瓶口。如果實在需要打開瓶口的話，必需在無菌的環(huán)境下操作。生物安全柜和超凈臺應(yīng)注意清潔和消毒；每年更換HEPA過濾膜。27使用膠頭、移液器、電動移液器吸取溶液后，不能水平放置，以防液體進入。一旦液體進入要及時更換濾膜，并做好消毒措施。消除潛在的污染隱患-228消除潛在的污染隱患-3普通大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及劃線后平板建議用石蠟?zāi)ね耆芊夂笈囵B(yǎng)和放置。29消除潛在的污染隱患-4菌液培養(yǎng)時將蓋擰緊30消除潛在的污染隱患-5菌體相關(guān)垃圾處理：生物安全柜或處理菌體的超凈臺應(yīng)配備密封垃圾桶，以防止污染源外泄；帶有菌體的垃圾要做到當(dāng)日滅菌；如果當(dāng)日不能滅菌，應(yīng)使用垃圾袋密封后放置。31消除潛在的污染隱患-6分光光度計周圍：菌體相關(guān)的廢液建議收集到專門密閉容器，每日滅菌；盛放過菌液的比色皿應(yīng)注意清洗，清洗液同上處理。32消除潛在的污染隱患-7高壓滅菌后的槍頭，務(wù)必烘干使用33消除潛在的污染隱患-8玻璃器皿特別是菌體培養(yǎng)用器具使用前用鋁箔包裹后，在180℃干熱滅菌。34消除潛在的污染隱患-9培養(yǎng)裝置應(yīng)經(jīng)常清洗消毒；水浴搖床中的水要經(jīng)常更換，長時間不用要將水排空，擦拭干凈放置。35消除潛在的污染隱患-10在培養(yǎng)時最好使用無菌的棉塞（不要使用鋁箔覆蓋培養(yǎng)瓶）；不要使用潮濕或臟的瓶塞。滅菌時培養(yǎng)時36消除潛在的污染隱患-11接觸菌體頻率高，空隙多容易隱匿菌體的器具要經(jīng)常清洗消毒。StandsCentrifuge&it’srotor37消除潛在的污染隱患-12臟的移液器反復(fù)使用的電擊槽與噬菌體污染的培養(yǎng)液接觸過的電極或buffer3.污染原因的分析染菌原因分析就是總結(jié)染菌的教訓(xùn)，防范于未然。主要染菌原因：①

種子帶菌②無菌空氣帶菌③設(shè)備滲漏

④滅菌不徹底⑤操作失誤⑥技術(shù)管理不善（1）染菌的時間分析種子培養(yǎng)階段：種子，滅菌，操作；發(fā)酵前期：種子，滅菌，操作；發(fā)酵后期：空氣，補料，設(shè)備滲漏，泡沫（2）染菌的雜菌種類分析：污染耐熱芽孢桿菌：培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底；污染不耐熱雜菌：種子帶菌、空氣除菌不徹底、設(shè)備滲漏或操作問題；污染淺綠色菌落雜菌：冷卻盤管滲漏引起；污染霉菌：無菌室滅菌不徹底，或操作問題；污染酵母菌：糖液滅菌不徹底。（3）染菌的規(guī)模分析大批量發(fā)酵罐染菌：種子、空氣；

前期：種子帶菌，滅菌問題；

中后期：空氣帶菌；部分發(fā)酵罐染菌：個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備滲漏（1）種子帶菌及其防止原因

：菌種培養(yǎng)或保藏過程染菌、培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底、菌種移接過程污染措施：嚴格控制無菌室污染，嚴格無菌操作；種子保存管的棉花塞應(yīng)有一定的緊密度，且有一定的長度；培養(yǎng)和保存溫度不宜有太大變化；菌種培養(yǎng)基或器具進行嚴格的滅菌處理；每一級種子培養(yǎng)物均應(yīng)經(jīng)嚴格檢查，確保未受污染后才能使用4.雜菌污染途徑及預(yù)防（2）空氣帶菌及其防止空氣的凈化工藝和設(shè)備的設(shè)計過濾介質(zhì)的選用和裝填過濾介質(zhì)的滅菌和管理等（3）培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底染菌及防止

原料含較多菌未充分排除罐內(nèi)空氣滅菌溫度、時間未控制好設(shè)備、管道存在死角原料性狀：淀粉質(zhì)原料，升溫過快或混合不均勻，易結(jié)塊，團塊中包埋的活菌不易殺滅；可升溫前攪拌和加淀粉酶。實罐滅菌時未充分排除罐內(nèi)空氣：造成假壓，升溫時，應(yīng)打開排氣等閥門放氣。連續(xù)滅菌時，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)基未達到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底。D.設(shè)備和管道存在“死角”

死角：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達或不能充分到達預(yù)定應(yīng)該到達的局部滅菌部位，從而不能達到徹底滅菌的要求。常見的設(shè)備、管道“死角”發(fā)酵罐的“死角”：不銹鋼襯里破裂造成死角，發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢。2023/2/3法蘭連接不當(dāng)造成的“死角”2023/2/3滅菌時蒸汽不易通達的“死角”及其消除方法（4）設(shè)備滲漏染菌及防止原因發(fā)酵罐、補糖罐、冷卻盤管、管道閥門等，因加工制作不良或遭受腐蝕等原因而形成微小漏孔后發(fā)生滲漏染菌。措施選用優(yōu)質(zhì)材料、科學(xué)合理加工、經(jīng)常檢查。（5）操作失誤染菌及防止淀粉原料采用實罐滅菌，大顆粒應(yīng)先篩去，再攪拌均勻，加入一定量淀粉酶液化或糖化后滅菌。在滅菌升溫時，要打開排氣閥門，排盡罐內(nèi)冷空氣。嚴防泡沫升頂，可添加消泡劑防止泡沫的大量產(chǎn)生。嚴格控制滅菌溫度，避免蒸汽壓力的波動過大。發(fā)酵過程越來越多采用自動控制，控制儀器如用化學(xué)試劑滅菌，一定要徹底。（6）噬菌體污染及其防治

染噬菌體對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程如受噬菌體侵染，一般發(fā)生溶菌，隨之出現(xiàn)發(fā)酵遲緩或停止，而且往往會反復(fù)連續(xù)感染，使生產(chǎn)無法進行，甚至使種子全部喪失，對發(fā)酵威脅很大。

噬菌體污染根本原因生產(chǎn)中把活菌體排放到環(huán)境中，造成了自然界中相應(yīng)噬菌體大量增殖。這些噬菌體隨風(fēng)沙塵土和空氣流動到處傳播，有可能潛入生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，尤其是通過空氣系統(tǒng)進入種子室、種子罐、發(fā)酵罐。噬菌體的防治嚴禁活菌體排放，切斷噬菌體的“根源”；凈化生產(chǎn)環(huán)境，消滅污染源；保證純種培養(yǎng)，嚴防種子本身帶噬菌體，特別是溶源性噬菌體；輪換使用菌種或使用抗性菌株。2、染菌的處理染菌后處理染菌后必須對所有相關(guān)原料、儀器設(shè)備、管道等進行徹底滅菌。盡量查明染菌原因，以免重復(fù)污染。3.污染原因分析主要原因：①

種子帶菌②無菌空氣帶菌③設(shè)備滲漏④滅菌不徹底⑤操作失誤⑥技術(shù)管理不善從污染時間看：早期污染可能與①②④⑤→接種操作不當(dāng)有關(guān)；后期污染可能與③⑤及中間補料有關(guān)。從雜菌種類看：耐熱芽孢桿菌：與④有關(guān)球菌、無芽孢桿菌：與①②③⑤有關(guān)淺綠色菌落的雜菌：與水有關(guān)，即冷卻盤管滲漏霉菌：與④⑤有關(guān)，即無菌室滅菌不徹底或操作問題酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時間較長

2023/2/3從染菌幅度看：各個發(fā)酵罐或多數(shù)發(fā)酵罐染菌，且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問題，若個別罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問題。2023/2/31）從污染雜菌的種類分析污染耐熱芽孢桿菌：培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底；污染不耐熱雜菌：種子帶菌、空氣除菌不徹底、設(shè)備滲漏或操作問題；污染淺綠色菌落雜菌：冷卻盤管滲漏引起；污染霉菌：無菌室滅菌不徹底，或操作問題；污染酵母菌：糖液滅菌不徹底。2）從污染時間分析發(fā)酵前期染菌：種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、操作不當(dāng)或空氣帶菌；發(fā)酵后期染菌：中間補料污染、設(shè)備滲漏或操作問題。3）從染菌程度分析多個罐染菌：種子帶菌、空氣系統(tǒng)問題；個別罐染菌：設(shè)備問題、操作不當(dāng)。采取哪些措施能夠保持無菌發(fā)酵？物料、培養(yǎng)基、中間補料要滅菌；發(fā)酵設(shè)備及輔助設(shè)備（空氣過濾裝置、各種發(fā)酵罐進出口連接裝置）和管道要滅菌；好氣發(fā)酵通入的空氣要除菌；種子無污染；接種無菌操作過關(guān)；為了保持發(fā)酵的長期無菌狀態(tài)，需維持正壓。2023/2/3三、發(fā)酵工業(yè)的無菌操作技術(shù)加熱滅菌法1輻射滅菌法2化學(xué)藥品滅菌法3過濾除菌法4二、發(fā)酵工業(yè)無菌操作的基本概念滅菌：用物理或化學(xué)的方法殺死物料或設(shè)備中所有的微生物。消毒：用物理或化學(xué)的方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的微生物。

防腐:用物理或化學(xué)方法殺死或抑制微生物的生長和繁殖

。

二、發(fā)酵工業(yè)無菌操作的基本概念消毒與滅菌的區(qū)別消毒概念來自于衛(wèi)生工作，僅僅是殺滅生物體或非生物體表面的微生物，而滅菌則是殺滅所有的生命體。因此，消毒一般只能殺死營養(yǎng)細胞，不能殺死細胞芽孢及真菌孢子，適合于發(fā)酵車間的環(huán)境和設(shè)備、器具的無菌處理。滅菌則適合培養(yǎng)基等物料的無菌處理。（一）加熱滅菌法1.干熱空氣滅菌法在干燥環(huán)境（干熱空氣）進行滅菌的技術(shù)。滅菌溫度/°C170160150140121滅菌時間/min60120150180過夜表1干熱空氣滅菌需要的溫度和時間適用于玻璃、陶瓷、金屬等制品。2.濕熱滅菌法濕熱滅菌法是指用飽和水蒸氣、沸水或流通蒸汽進行滅菌的方法，以高溫高壓水蒸氣為介質(zhì)，由于蒸汽潛熱大，穿透力強，容易使蛋白質(zhì)變性或凝固，最終導(dǎo)致微生物的死亡，所以該法的滅菌效率比干熱滅菌法高，是藥物制劑生產(chǎn)過程中最常用的滅菌方法。濕熱滅菌法的類型煮沸滅菌法巴氏消毒法間歇滅菌法高壓蒸氣法（1）煮沸滅菌法營養(yǎng)細胞——水中煮沸15~20min；芽孢——水中煮沸1~2h。適用于一般食品及器材的滅菌。（2）巴氏消毒法亦稱低溫消毒法，冷殺菌法，是一種利用較低的溫度既可殺死病菌又能保持物品中營養(yǎng)物質(zhì)風(fēng)味不變的消毒法。70℃，保持15~30min，殺死病原菌和部分微生物營養(yǎng)體。巴氏殺菌機（3）間歇滅菌法利用反復(fù)多次的流通蒸汽加熱，殺滅所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽滅菌法，但要重復(fù)3次以上，每次間歇是將要滅菌的物體放到37℃孵箱過夜，目的是使芽胞發(fā)育成繁殖體。若被滅菌物不耐100℃高溫，可將溫度降至75℃～80℃，加熱延長為30～60分鐘，并增加次數(shù)。適用于不耐高熱的含糖或牛奶的培養(yǎng)基。4.高壓蒸汽法適用行業(yè)：發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測、微生物實驗室等。適用范圍：培養(yǎng)基、發(fā)酵罐以及附屬設(shè)備和管道、玻璃器皿、工作服等的滅菌。方法：

121℃，103.42kPa，15~20min

生產(chǎn)中使用高壓蒸汽滅菌鍋的型號很多：手提式壓力滅菌器立式壓力滅菌器臥式蒸氣高壓滅菌鍋注意事項滅菌包不宜過大過緊，滅菌器內(nèi)物品的放置總量不應(yīng)超過滅菌器柜室容積的85%。各包之間留有空隙，以便于蒸汽流通、滲入包裹中央，排氣時蒸汽迅速排出，保持物品干燥。盛裝物品的容器應(yīng)有孔，若無孔，應(yīng)將容器蓋打開。布類物品放在金屬、搪瓷類物品之上。滅菌鍋密閉前，應(yīng)將冷空氣充分排空。隨時觀察壓力及溫度情況。注意安全操作，每次滅菌前，應(yīng)檢查滅菌器是否處于良好的工作狀態(tài)。滅菌完畢后減壓不要過猛，壓力表回歸“0”位后才可打開蓋或門。3.火焰滅菌法采用火焰直接灼燒滅菌。適用范圍：接種針、試管口、三角瓶口等。（二）射線滅菌射線滅菌是利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來殺死微生物。常用的射線是紫外線和電離輻射。1.紫外線（ultraviolet，UV）：波長136nm～390nm的紫外線（包括日光中的紫外線）具有殺菌作用，以260nm左右的最強，與嘌呤和嘧啶的吸收光譜高峰一致。紫外線可使DNA鏈上相鄰的兩個胸腺嘧啶共價結(jié)合而形成二聚體，阻礙DNA正常轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致微生物的變異或死亡。紫外線穿透力較弱，普通玻璃、紙張、塵埃、水蒸汽等均能阻檔紫外線，一般用于手術(shù)室、病房、實驗室的空氣消毒。紫外線可損傷皮膚和角膜，應(yīng)注意防護。2023/2/32023/2/32.電離輻射：包括γ射線、X射線和加速電子等，對各種微生物均有致死作用，細菌繁殖體對射線比芽胞要敏感。其機制是直接或者通過產(chǎn)生游離基，破壞DNA分子的共價鍵。輻射源常用同位素鈷60，用于一次性醫(yī)用塑料制品批量滅菌。2023/2/3（三）化學(xué)藥品滅菌法常用試劑有過氧化氫、過氧乙酸、環(huán)氧乙烷、鹵素、甲醛、高錳酸鉀、季銨鹽（如新潔爾滅）、臭氧等。些物質(zhì)易與微生物細胞中的一些成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，如使蛋白質(zhì)變性、酶類失活、破壞細胞膜通透性而殺滅微生物。2023/2/3由于化學(xué)試劑也會與培養(yǎng)基中的一些成分作用，而且加入培養(yǎng)基后不易去除，它不能用于培養(yǎng)基的滅菌，但染菌后的培養(yǎng)基可用化學(xué)藥劑處理。常見的化學(xué)滅菌劑（見表4-4）

2023/2/3來蘇爾（Lysol）為甲酚、植物油、氫氧化鈉的皂化液（含甲酚50%）。無色或黃色液體。使用方法和范圍：1~2%溶液用于手消毒（也可用于處理染菌桌面），3~5%溶液用于器械物品消毒，5~10%溶液用于環(huán)境、排泄物的消毒。對一般致病菌包括抗酸菌殺菌效果確實，對芽孢則需高濃度長時間才有殺菌作用。2023/2/3新潔爾滅，別名為苯扎溴銨，為溴化二甲基芐基烴銨的混合物。創(chuàng)面消毒用0.01%溶液，皮膚及粘膜消毒用0.1%溶液，手術(shù)前洗手用0.05%～0.1%溶液浸泡5分鐘；手術(shù)器械消毒用0.1%溶液(內(nèi)加0.5%亞硝酸鈉以防生銹)煮沸15分鐘,再浸泡30分鐘。2023/2/3（四）過濾除菌過濾除菌法是利用過濾方法阻截微生物以達到除菌的目的。

適用于熱敏性物質(zhì)和空氣的除菌。是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。

2023/2/3四、發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌工業(yè)上對培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門、流加物料等都采用蒸汽滅菌。（一）濕熱滅菌濕熱滅菌是指利用飽和蒸汽滅菌的方法。原理：借助蒸汽釋放的熱能，尤其是飽和蒸汽冷凝時瞬間內(nèi)釋放的大量潛熱，可使微生物菌體細胞溫度迅速升高，促使蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵（尤其是氫鍵）受到破壞二引起不可逆變性，造成微生物死亡。適用范圍：培養(yǎng)基、設(shè)備、管路及閥門的滅菌。優(yōu)點：滅菌效果可靠、徹底；蒸汽來源容易，本身無毒，操作方便、費用低，易管理等。缺點：對營養(yǎng)成分的破壞較強。葡萄糖滅菌溫度過高會產(chǎn)生糠醛，培養(yǎng)基顏色變深，糠醛對菌體生長不利。如果培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度很低，就不用單獨滅菌，如果葡萄糖很高，培養(yǎng)條件又很嚴格，就單獨滅菌。量少的話過濾，量多的話，實驗室一般115度滅菌15min足夠了，工廠一般115度20~30min。影響滅菌的因素：滅菌時間；滅菌溫度；其他因素（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基的物理狀態(tài)、pH值、攪拌、泡沫等）發(fā)酵工業(yè)上最常用的滅菌條件：121°C，30min。相關(guān)概念：致死溫度：殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。致死時間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需要的時間稱為致死時間。一般認為滅菌徹底與否的是以能否殺死芽孢細菌為標準。（二）分批滅菌定義：培養(yǎng)基的分批發(fā)酵是指將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他貯存容器中，通入蒸汽，將培養(yǎng)基及所用設(shè)備一起滅菌的操作過程，也稱為間歇滅菌或?qū)嵐逌缇▽嵪?。適用范圍：中小型發(fā)酵罐優(yōu)點：設(shè)備要求簡單，無需另外設(shè)置加熱冷卻裝置；操作要求低，適合手動操作；適合于小規(guī)模生產(chǎn)；適合于固體物質(zhì)含量大的培養(yǎng)基滅菌。缺點：升溫降溫較慢，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)損失較多，滅菌后培養(yǎng)基質(zhì)量會下降；滅菌過程需反復(fù)進行加熱和冷卻，能耗較高；間歇式操作，發(fā)酵罐利用率較低；不適合于大規(guī)模生產(chǎn)的培養(yǎng)基滅菌。豐原生化操作步驟配料罐空氣分過濾器滅菌；配制培養(yǎng)基，準備滅菌；通入蒸汽，升溫；滅菌：121°C，0.1MPa，保溫30min左右；保溫結(jié)束，降溫。條件的確定

分批滅菌包括升溫、保溫和降溫三個階段。滅菌主要是在保溫過程中實現(xiàn)的。注意事項培養(yǎng)基的配置應(yīng)注意計量準確，所配置的培養(yǎng)基體積應(yīng)扣除種子液的體積和滅菌過程冷凝水的預(yù)留體積；實消前，先空消，并校正pH、DO等傳感電極