免疫細(xì)胞分離技術(shù)(終)

免疫細(xì)胞分離技術(shù)

（針對淋巴細(xì)胞）41110111向珍娟41110124龔琦青41110131周武免疫細(xì)胞分離技術(shù)的意義我們知道進(jìn)行有關(guān)細(xì)胞免疫方面的檢測，特別是有關(guān)免疫細(xì)胞功能的體外實(shí)驗(yàn)，往往須將待檢淋巴細(xì)胞從血液或組織中分離出來，而外周血會有多種細(xì)胞成分，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和血咆群體。但有些細(xì)胞如淋巴細(xì)胞的物理特性及生化特性與其他細(xì)胞差異甚微，用簡單的方法不容易分純，因此產(chǎn)生了專門的細(xì)胞分離純化技術(shù)。白細(xì)胞分離吞噬細(xì)胞的分離和收集淋巴細(xì)胞分離

白細(xì)胞的分離自然沉降法聚合物加速沉降法自然沉降法采集血液試管直立靜置室溫（30~60min）抗凝（如加肝素）血漿層白細(xì)胞層紅細(xì)胞層吸管吸取白細(xì)胞層置新試管中離心棄上清并洗滌加蒸餾水低滲處理（裂解紅細(xì)胞）反復(fù)洗滌得純度較高的白細(xì)胞懸液聚合物加速沉降法本法是利用高分子量的聚合物如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（PVP）等使紅細(xì)胞凝集成串，加速紅細(xì)胞沉降，使之與白細(xì)胞分離。優(yōu)點(diǎn)：本法的細(xì)胞獲得率比自然沉降法高。吞噬細(xì)胞的分離和收集

方法：斑蝥敷貼法操作：用濾紙蘸取10％中藥斑蝥酒精浸出液，貼敷在臂內(nèi)側(cè)皮膚表面，4～5h后皮膚局部充血，48h后局部形成水皰，吸取皰中的組織液，內(nèi)含巨噬細(xì)胞；優(yōu)點(diǎn)：可從人體組織液中獲取較純的巨噬細(xì)胞，不需作進(jìn)一步體外分離，細(xì)胞量損失較少；缺點(diǎn)：此法對病人皮膚有一定損傷，有時可引起局部感染，應(yīng)慎用。2023/2/3淋巴細(xì)胞分離三步走（一）外周血單個核細(xì)胞的分離（二）純淋巴細(xì)胞群的采集（三）淋巴細(xì)胞亞群的分離（一）外周血單個核細(xì)胞的分離外周血中單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075～1.090，血小板為1.030～1.035。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。Ficoll分層液法

外周血單個核細(xì)胞的分離Ficoll分層液法

Percoll分層液法分層液基本要求

①對細(xì)胞無毒

②基本等滲

③不同于血漿等分離物質(zhì)

④有一定的比重最佳選擇（目前）

Ficoll（聚蔗糖-泛影葡胺溶液）：2份6％聚蔗糖蒸餾水溶液+1份34%泛影葡胺生理鹽水溶液組成，其比重為1.077±0.002.

分離過程（1）分層液置試管底層（2）肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個清晰的界面（3）水平式離心（4）不同層次的液體和細(xì)胞帶（5）吸取單個核細(xì)胞層Ficoll分層液法

分離成品：淋巴細(xì)胞

單核細(xì)胞分離純度：95%左右，其中淋巴細(xì)胞約占90%~95%

Percoll分層液法Percoll分離液法是一種連續(xù)密度梯度離心分離法。Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細(xì)胞無毒性。Percoll液經(jīng)高速離心后可形成一個連續(xù)的密度梯度，不同密度的細(xì)胞將懸浮于各自不同的密度區(qū)帶，從而將密度不等的細(xì)胞分離純化。分離過程（1）用Percoll原液(密度1．135)與約等量的磷酸緩沖液均勻混合（2）高速離心后，形成一個從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度（3）將已制備的單個核細(xì)胞懸液輕輕疊加在液面上（4）低速離心后，得四個細(xì)胞層。表層為死細(xì)胞殘片和

血小板，底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，中間有兩層，上層富含單核細(xì)胞(78％)，下層富含淋巴細(xì)胞(98％）。Percoll分層液法優(yōu)點(diǎn)：純化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；缺點(diǎn)：操作流程較長，手續(xù)較多。連續(xù)密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞中各細(xì)胞成分的分布示意圖（二）純淋巴細(xì)胞的分離

根據(jù)密度離心分離法獲得的淋巴細(xì)胞主要混合在單個核細(xì)胞懸液中，由于淋巴細(xì)胞在數(shù)量上占單個核細(xì)胞的大多數(shù)，因此，單個核細(xì)胞有時也可以大致地代表淋巴細(xì)胞直接用于某些實(shí)驗(yàn)，但嚴(yán)格地講，采用上述方法獲得的單個核細(xì)胞需去除單核細(xì)胞才能較為準(zhǔn)確地代表淋巴細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。純淋巴細(xì)胞群的采集

實(shí)驗(yàn)原理：利用單核細(xì)胞在37℃和Ca2+存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性；實(shí)驗(yàn)方法：粘附貼壁法吸附柱過濾法磁鐵吸引法2023/2/3粘附貼壁法將已制備的單個核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。缺點(diǎn)：因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。2023/2/3吸附柱過濾法將單個核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞；優(yōu)點(diǎn)：此法簡單易行，對細(xì)胞極少損害。2023/2/3磁鐵吸引發(fā)法原理：利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性；操作：在單個核細(xì)胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內(nèi)短時旋轉(zhuǎn)搖動，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞。2023/2/3（三）淋巴細(xì)胞亞群的分離

原則：根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化；陽性選擇法：凡根據(jù)細(xì)胞的特性和標(biāo)志選擇純化所需細(xì)胞的方法；陰性選擇法：選擇性去除不要的細(xì)胞，僅留下所需的細(xì)胞的方法；2023/2/3淋巴細(xì)胞亞群的分離通過以上兩步的實(shí)驗(yàn)分離操作，我們得到純度比較高的淋巴細(xì)胞混合液。然而在具體的實(shí)驗(yàn)操作中，我們還需要將淋巴細(xì)胞進(jìn)一步的進(jìn)行分離。原則：根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化；陽性選擇法：凡根據(jù)細(xì)胞的特性和標(biāo)志選擇純化所需細(xì)胞的方法；陰性選擇法：選擇性去除不要的細(xì)胞，僅留下所需的細(xì)胞的方法；分離方法1.E花環(huán)沉降法2.尼龍毛分離法3.免疫吸附分離法4.免疫磁性微珠分離法5.流式細(xì)胞儀分離法E花環(huán)沉降法基本原理：T細(xì)胞有羊紅細(xì)胞受體(E受體)，可以與羊紅細(xì)胞結(jié)合形成較大的E花環(huán)的特性，可將T細(xì)胞和B細(xì)胞分離。分離過程（1）將淋巴細(xì)胞與一定比例的綿羊紅細(xì)胞混合（2）淋巴細(xì)胞形成E花環(huán)（3）用淋巴細(xì)胞分層液分離（4）浮懸在分層界面的細(xì)胞群則富含B細(xì)胞，而T細(xì)胞由于與羊紅細(xì)胞結(jié)合形成E花環(huán)后比重較大，則沉降在管底相關(guān)拓展：用神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理羊紅細(xì)胞將有利于花環(huán)的形成和增加穩(wěn)定性。另外將沉降在管底與羊紅細(xì)胞結(jié)合的T細(xì)胞經(jīng)低滲法處理可使圍繞細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞快速裂解，又可得到E受體陽性的T細(xì)胞群。尼龍毛分離法

原理：本法利用B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，可將T和B細(xì)胞分開。操作方法：取松散而經(jīng)過處理的尼龍毛（聚酰胺纖維），均勻充填在內(nèi)徑5～6nm的聚乙烯塑料管（飲料管即可）內(nèi)，經(jīng)Hanks液浸透保溫，將單個核細(xì)胞懸液加入柱內(nèi)，放37℃溫箱靜置1～2h。用預(yù)溫的含10％～20％小牛血清培養(yǎng)液灌洗，洗脫液內(nèi)含有非粘附的T細(xì)胞，重復(fù)灌洗幾次以除去管內(nèi)殘留的T細(xì)胞。再用冷或溫培養(yǎng)液邊沖邊洗邊擠壓塑料管，此時洗脫液內(nèi)富含B細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：如此得到的T細(xì)胞純度在90％以上，B細(xì)胞純度可達(dá)80％。2023/2/3免疫吸附分離法----

親和板結(jié)合分離法原理：各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液，凡抗原陽性的細(xì)胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲?。?023/2/3親和板結(jié)合分離法同樣若用特異性抗原交聯(lián)在塑料板上，則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體接觸，可引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時，本法更適用。如要分離CD4+或CD8+細(xì)胞，則可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。用抗Ig抗體則可分離B細(xì)胞。同樣，用活化的C3包被，可分離出有C3受體的細(xì)胞。2023/2/3親和板結(jié)合分離法（陽性選擇法）（1）將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上（2）加細(xì)胞懸液（3）各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同抗原性的特點(diǎn)和表面標(biāo)志，抗原陽性的細(xì)胞與相應(yīng)的固相抗體結(jié)合，吸附在平板上（3）多次細(xì)胞洗滌后我們將得到吸附在平板上的抗原陽性細(xì)胞（4）同理若用特異性抗原交聯(lián)于塑料板上，則可分離得到具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。但淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體連接后有可能引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時，即將其用于陰性選擇，本法更合適。2023/2/3免疫磁珠法分離細(xì)胞原理：

免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。免疫磁珠法分為陽性分離法和陰性分離法：

陽性分離法－磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞

陰性分離法－磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于磁場的細(xì)胞為所需細(xì)胞。熒光激活細(xì)胞分離儀(FACS)分離法

主要原理是細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個流經(jīng)檢測區(qū)進(jìn)行測定。當(dāng)細(xì)胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩攪動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴（40000個/s），每小滴內(nèi)最多含一個細(xì)胞（其中只有百分之幾的液滴中含細(xì)胞），細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞