質(zhì)粒DNA的提取定量酶切與PCR鑒定

質(zhì)粒DNA的提取、定量、酶切與PCR鑒定

一、實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)內(nèi)容流程，PCR操作步驟↓煮菌，PCR（PCR程序最后設(shè)4℃保溫）↓約2小時(shí)收集PCR產(chǎn)物學(xué)習(xí)PCR原理質(zhì)粒DNA提?。s1小時(shí)）↓紫外檢測(cè)定量知識(shí)（計(jì)算方法），步驟↓紫外檢測(cè)定量↓酶切步驟↓酶切約1~2小時(shí)↓學(xué)習(xí)酶切原理，瓊脂糖電泳原理↓電泳（樣品：質(zhì)粒DNA，PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物，Marker）↓約30分鐘觀察電泳結(jié)果、記錄、拍照、保存滅菌去離子水19l2*Premix25l正向引物-SO100(10M)2l反向引物-SO101(10M)2l菌液：2l總體積50l取0.2mlPCR反應(yīng)管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑(注意每換一種試劑換一個(gè)新吸頭,且PCR反應(yīng)管標(biāo)記在側(cè)面)：

如配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，可將PCR反應(yīng)管置臺(tái)式離心機(jī)中瞬時(shí)離心或者將反應(yīng)管蓋上蓋子使勁甩，使反應(yīng)液集中于管底，然后將反應(yīng)管放到基因擴(kuò)增儀(PCR儀)上。

儀器:PCR儀(BioRadMJmini)臺(tái)式離心機(jī)滅菌的薄壁離心管凝膠電泳系統(tǒng)等凝膠成像系統(tǒng)

一、實(shí)驗(yàn)儀器2、離心層析柱硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，不吸附蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)；通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫；四、實(shí)驗(yàn)步驟取1.5ml培養(yǎng)物加入Eppendorf管中9000rpm×30s，棄上清加入250μl溶液P1，吹打，使細(xì)菌沉淀分散，徹底懸浮。加入250μl溶液S2，顛倒6～10次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲?，直到溶液變得清?加入400μl溶液S3，立即溫和混勻，室溫放置3-5min。13000rpm離心10min，小心取上清液（700-800μl

）。將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm離心3min，棄濾液。加入500μl去蛋白液W1，13000rpm離心1min，棄濾液，向吸附柱中加入500μl漂洗液W2，13000rpm離心1min，棄濾液。重復(fù)步驟8一次。空柱13000rpm離心2min，然后室溫放置3-5min，使殘留乙醇揮發(fā)。取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加60μl-100μl洗脫緩沖液Eluent，室溫放置1min，13000rpm離心1min洗脫質(zhì)粒DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谝粋€(gè)潔凈的1.5ml離心管中混勻下列反應(yīng)物：混合后37℃水浴1-2h。用酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳注意事項(xiàng)：不要有氣泡，并盡量使液體在離心管底部。質(zhì)粒DNA的酶切分析反應(yīng)物體積（μl)無(wú)菌去離子水10.010×M酶切緩沖液2.0EcoRI1.0HindIII1.0質(zhì)粒DNA6.0總計(jì)20ul二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的方法了解和掌握紫外吸收檢測(cè)DNA濃度與純度的原理和測(cè)定方法了解質(zhì)粒酶切鑒定原理學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)質(zhì)粒DNA的構(gòu)型、分子量的大小掌握PCR基因擴(kuò)增的原理和操作方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)PolymeraseChainReaction儀器:PCR儀(BioRadMJmini)臺(tái)式離心機(jī)滅菌的薄壁離心管凝膠電泳系統(tǒng)等凝膠成像系統(tǒng)

一、實(shí)驗(yàn)儀器1、

菌液：DNA模板(含靶基因片段)2、引物：正向引物：5’GTA

AAA

CGA

CGG

CCA

GT3’

反向引物:5’CAG

GAA

ACA

GCT

ATG

AC3’3、2×Premix

：

Taq酶：5U/μl4×dNTP:10mMeach10×buffer:500mMKCl,100mMTris-HCl(pH8.3)MgCl2:25mM4、滅菌去離子水二、試劑

①94℃預(yù)變性2分鐘后開始以下循環(huán)②94℃30秒

55℃30秒30循環(huán)

72℃60秒③72℃8分鐘；④4℃保溫。實(shí)驗(yàn)過程約1小時(shí)30分鐘三、實(shí)驗(yàn)步驟溫度（℃）時(shí)間（min）94725094℃變性（30s）50℃退火（30s）72℃延伸（60s）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。DNA變性形成2條單鏈DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍滅菌去離子水19l2*Premix25l正向引物-SO100(10M)2l反向引物-SO101(10M)2l菌液：2l總體積50l取0.2mlPCR反應(yīng)管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑(注意每換一種試劑換一個(gè)新吸頭,且PCR反應(yīng)管標(biāo)記在側(cè)面)：

如配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，可將PCR反應(yīng)管置臺(tái)式離心機(jī)中瞬時(shí)離心或者將反應(yīng)管蓋上蓋子使勁甩，使反應(yīng)液集中于管底，然后將反應(yīng)管放到基因擴(kuò)增儀(PCR儀)上。

四、結(jié)果分析1、用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定;2、加5uLPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳;3、預(yù)期PCR產(chǎn)物大小約400~500bp;*由1985年穆里斯（K.Mullis）發(fā)明，他也因此獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA為模板，特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，在體外復(fù)制DNA的過程。五、實(shí)驗(yàn)原理變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C溶液反應(yīng)溫度升至中溫72℃，在Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條單鏈在解鏈和退火之后延伸為一條雙鏈加熱使模板DNA在高溫下90℃-95變性，雙鏈解鏈降低溶液溫度，使合成引物在低溫（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈實(shí)驗(yàn)原理

5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55原理示意圖

Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成

模板DNA

引物

dNTP

耐熱的DNA聚合酶緩沖液(一)模板DNAPCR可以以DNA或RNA為模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。模板的濃度要適當(dāng)

基因組DNA：50-100ng質(zhì)粒DNA:5-10ng(二)引物與摸板DNA鏈互補(bǔ)的小片段DNA分子；PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵；引物1引物2引物的特異性：引物的設(shè)計(jì)與合成對(duì)PCR的成功與否起著決定性的作用引物的濃度：引物量太低，則產(chǎn)物量降低，會(huì)出現(xiàn)假陰性引物濃度過高會(huì)促進(jìn)引物的錯(cuò)誤引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會(huì)增加引物二聚體的形成一般認(rèn)為PCR反應(yīng)中引物的終濃度為0.2～1μmol/L為宜引物的設(shè)計(jì)：使用引物設(shè)計(jì)軟件NTI9.0,PRIME5.0等引物的設(shè)計(jì)原則：1、引物長(zhǎng)度：15~25個(gè)核苷酸，最佳長(zhǎng)度為18～21個(gè)核苷酸。2、(G+C）%含量:40%~60%。并且，兩個(gè)引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似。3、兩個(gè)引物之間配對(duì)堿基數(shù)小于5個(gè)。4、引物自身配對(duì)的堿基對(duì)數(shù)不大于3。特別是在引物3’端。5、引物與模板非特異性配對(duì)為點(diǎn)的堿基配對(duì)率小于70%。6、Tm值高于55℃（三）Taq

酶從水生棲熱菌Thermus

Aquaticus

（Taq

）中分離出的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶酶濃度：酶的濃度太低會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量降低，如果酶的濃度太高則會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增每100μl反應(yīng)液中含1-2.5UTaqDNA聚合酶為佳保存：-20℃（四）dNTP

dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（五）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。①變性溫度與時(shí)間變性充分：變性溫度越高，時(shí)間越長(zhǎng)變性就越充分。變性溫度、時(shí)間要適應(yīng)：溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)又會(huì)影響TaqDNA聚合酶的活性，變性溫度90-95℃為宜。②退火溫度與時(shí)間：復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好，升高復(fù)性溫度可以增加非特異性結(jié)合，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在35－70℃,一般低于引物Tm值的5℃左右。復(fù)性時(shí)間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)增加非特異的復(fù)性。引物延伸溫度一般為72℃。延伸時(shí)間：72℃時(shí)，核苷酸的合成速度為35-100個(gè)核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。然而，延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。③延伸溫度與時(shí)間：PCR循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)要恰當(dāng)：一般是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。當(dāng)然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。常規(guī)PCR循環(huán)次數(shù)一般為25～40個(gè)周期。PCR相關(guān)技術(shù)熒光定量PCR（real-timePCR）PCR相關(guān)技術(shù)融匯PCR技術(shù)、DNA探針雜交技術(shù)（標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)），結(jié)合先進(jìn)的光譜檢測(cè)技術(shù)發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度來對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。PCR相關(guān)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：起始定量PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克?。ǘ┗蛲蛔儯ㄈ〥NA和RNA的微量分析（四）DNA的序列測(cè)定（五）基因的突變分析PCR的臨床應(yīng)用遺傳病的診斷：β-地中海貧血診斷、產(chǎn)前診斷、肝癌研究、α-1抗胰蛋白酶缺陷癥、苯丙酮尿癥、痛風(fēng)病等診斷研究生物識(shí)別：PCR已用于人免疫缺陷病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、人乳頭瘤病毒（HPV）等十幾種病毒檢測(cè)癌基因的研究：選擇腫瘤基因突變部位進(jìn)行擴(kuò)增，可協(xié)助對(duì)腫瘤的診斷。質(zhì)粒DNA的提取與定量

ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA一、什么是質(zhì)粒？獨(dú)立于細(xì)菌染色體以外，能獨(dú)立自主復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA分子；基因工程常采用的載體方法：

堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法

概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離、純化質(zhì)粒DNA二、實(shí)驗(yàn)原理

基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。

在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。

當(dāng)以pH4.8的NaAc溶液調(diào)節(jié)pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。三、實(shí)驗(yàn)材料宿主菌：大腸桿菌DH5a菌株載體：PMD-19T質(zhì)粒插入片段基因：CHD5目的片段400bp質(zhì)粒大小為:2692bp+400bp=3092bp酶切片段大小為?米爾副教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā)現(xiàn)的CHD5，其編碼基因位于1號(hào)染色體的特異部分（1p36）。當(dāng)CHD5失去功能的時(shí)候，細(xì)胞內(nèi)平時(shí)起抑癌作用的系統(tǒng)會(huì)被關(guān)掉。CHD5如同腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)的總開關(guān)，這提示CHD5與多種人類癌癥有關(guān)。根據(jù)CHD5的調(diào)節(jié)功能，可以設(shè)計(jì)更好更有效的癌癥治療策略。此前，這個(gè)基因一直是個(gè)謎。這項(xiàng)研究對(duì)未來的癌癥治療將產(chǎn)生重要影響，提高CHD5的表達(dá)量會(huì)帶來額外的抑癌效果。臨床實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，許多神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的CHD5基因缺失，說明CHD5與人類癌癥有莫大關(guān)系，打開CHD5開關(guān)功能的藥物可能會(huì)對(duì)很多種癌癥的治療有效。補(bǔ)充知識(shí)：模板基因溶液P1（細(xì)菌懸浮液）已加入RNaseA溶液P2（細(xì)菌裂解液）溶液P3（中和液）去蛋白液PE洗脫液WB

已加入無(wú)水乙醇滅菌水（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（二）材料：含pMD18-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α（三）試劑：

LB培養(yǎng)基（液體、固體）Bioteke質(zhì)粒提取試劑盒（北京百泰克，中國(guó)）溶液I

50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)2

mg/mL溶菌酶作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II0.2mol/LNaOH(從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋)1%SDS作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III5mol/L乙酸鈉 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液中鈉的濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為5mol/L。作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，Na＋可中和DNA2、離心層析柱硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，不吸附蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)；通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫；四、實(shí)驗(yàn)步驟取1.5ml培養(yǎng)物加入Eppendorf管中9000rpm×30s，棄上清加入250μl溶液P1，吹打，使細(xì)菌沉淀分散，徹底懸浮。加入250μl溶液S2，顛倒6～10次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲?，直到溶液變得清?加入400μl溶液S3，立即溫和混勻，室溫放置3-5min。13000rpm離心10min，小心取上清液（700-800μl

）。將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm離心3min，棄濾液。加入500μl去蛋白液W1，13000rpm離心1min，棄濾液，向吸附柱中加入500μl漂洗液W2，13000rpm離心1min，棄濾液。重復(fù)步驟8一次?？罩?3000rpm離心2min，然后室溫放置3-5min，使殘留乙醇揮發(fā)。取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加60μl-100μl洗脫緩沖液Eluent，室溫放置1min，13000rpm離心1min洗脫質(zhì)粒DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩＞弘x心12000rpm,1min棄上清短時(shí)離心徹底棄上清加250μl溶液P1旋渦振蕩懸浮沉淀加250μl溶液P2加400μl

溶液P3顛倒顛倒數(shù)次放置3-5min離心13000rpm,10min取上清700μl加到吸附柱中離心13000rpm,1min棄濾液，加入500μl去蛋白液13000rpm,1min離心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）棄濾液，加入500μl漂洗液WB（10）離心13000rpm,1min棄濾液，加入500μl漂洗液WB（11）離心13000rpm,1min棄濾液（12）離心13000rpm,2min放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加70μl洗脫液EB離心13000rpm,1min（13）-20℃保存?zhèn)溆盟模|(zhì)粒定量檢測(cè)

紫外分光光度計(jì)法

原理：1,物質(zhì)在光的照射下會(huì)產(chǎn)生對(duì)光的吸收效應(yīng)

2,而且物質(zhì)對(duì)光的吸收是具有選擇性的

3,各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜一、質(zhì)粒定量紫外吸收檢測(cè)質(zhì)粒DNA的濃度和純度核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測(cè)定260nm的吸收峰即可對(duì)DNA進(jìn)行定量。260nm時(shí)，1A=50g/mL

dsDNA=37g/mL

ssDNA

=40g/mL

RNA

=30g/mL

Oligo可以通過計(jì)算確定雙鏈DNA濃度，公式如下:

dsDNA=50×(A260)×稀釋倍數(shù)以上濃度單位為g/mL（注：本實(shí)驗(yàn)要用的eppendorf公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì),會(huì)根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)自動(dòng)算出質(zhì)粒DNA的最終濃度和Ratio值.）A260/A280可以反應(yīng)DNA的純度：可根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)的比值（A260/A280）估計(jì)核酸的純度。A260/A280=1.8，純凈DNAA260/A280<1.8，說明樣品中含有蛋白質(zhì)或酚等污染。應(yīng)再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀純化DNA。A260/A280>1.8，說明有RNA污染，可用RNA酶處理

二、實(shí)驗(yàn)儀器三、實(shí)驗(yàn)方法1．打開儀器電源開關(guān)，無(wú)需預(yù)熱。2．根據(jù)樣品的不同，在儀器控制面版上選擇對(duì)應(yīng)的方法組，如測(cè)量質(zhì)粒DNA濃度選，測(cè)量RNA濃度選等，以此類推。3．選擇進(jìn)入方法組后，選擇你所需要的方法，然后按enter鍵確認(rèn)。4．按parameter/dilution鍵設(shè)置樣品稀釋倍數(shù)，輸入樣品的體積和稀釋樣品所用稀釋液的體積，按enter鍵確認(rèn)。（取質(zhì)粒DNA樣品2μl+98μl滅菌水）5．后推打開儀器上放置石英比色皿的槽蓋。6．按照設(shè)置的稀釋方法，先向石英比色皿中加入對(duì)應(yīng)體積的空白稀釋液，然后把石英比色皿放入檢測(cè)槽，按blank鍵進(jìn)行調(diào)零。7．再按照設(shè)置的稀釋方法，向石英比色皿中加入對(duì)應(yīng)體積的樣品，并用微量加樣器輕輕混勻。8．按sample鍵，儀器會(huì)根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)自動(dòng)計(jì)算出樣品的最終濃度。注意事項(xiàng)：1．為確保液體始終處于檢測(cè)區(qū)的中心位置，被檢測(cè)樣品的體積必須≧50ul。2．為避免石英比色皿受到污染，每次檢測(cè)樣品濃度前后都要用滅菌蒸餾水或去RNase水清洗石英比色皿3．實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，前推蓋上檢測(cè)槽的槽蓋，并關(guān)掉儀器電源。數(shù)據(jù)處理測(cè)量次數(shù)質(zhì)粒DNA濃度(μg/ml)Ratio值(A260/A280)123平均值酶切鑒定

DNArestrictionenzymedigestion

在一個(gè)潔凈的1.5ml離心管中混勻下列反應(yīng)物：混合后37℃水浴1-2h。用酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳注意事項(xiàng)：不要有氣泡，并盡量使液體在離心管底部。質(zhì)粒DNA的酶切分析反應(yīng)物體積（μl)無(wú)菌去離子水10.010×M酶切緩沖液2.0質(zhì)粒DNA6.0HindIII1.0EcoRI1.0總計(jì)20ul限制性內(nèi)切酶酶分子識(shí)別位點(diǎn)切割位點(diǎn)限制作用是否需用ATPⅠ類

三亞基雙功能酶二分非對(duì)稱至少在識(shí)別位點(diǎn)外1000bpYesⅡ類內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn)無(wú)特異性NoⅢ類二亞基雙功能酶5-7

bp非對(duì)稱在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bpYes限制性內(nèi)切酶可分為三類限制性內(nèi)切酶是DNA操作過程中所使用的基本工具。限制酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割,

產(chǎn)生平末端的DNA片段；有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端。限制性內(nèi)切酶★平末端

在識(shí)別順序的中心對(duì)稱軸處切割5’G-G-C-C3’3’C-C-G-G5’5’G-G3’C-C-C-C3’-G-G5’HaeIII限制性內(nèi)切酶★3’端粘性末端

在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的3’末端切割。5’G-G-T-A-C-C3’3’C-C-A-T-G-G5’G-G-T-A-C3’CC3’C-A-T-G-GKpnI限制性內(nèi)切酶5’G-A-A-T-T-C3’3’C-T-T-A-A-G5’GC-T-T-A-A5’5’A-A-T-T-CGEcoRI★5’端粘性末端

在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的5’末端切割。5’A-A-G-C-T-T3’3’T-T-C-G-A-A5’AT-T-C-G-A5’5’A-G-C-T-TAHindIII限制性內(nèi)切酶如：EcoRⅠ和HindⅢ的識(shí)別序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC

HindⅢ：A↓AGCTT目的片段400bp質(zhì)粒大小為:2692bp+400bp=3092bp酶切片段大小為?雙酶切限制酶的選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFERBuffer的選擇查閱內(nèi)切酶供應(yīng)商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表，如果有一種buffer能同時(shí)使2種酶的活力都超過70%的話，就可以用這種buffer作為反應(yīng)buffer；如果兩種酶廠家不同無(wú)法查時(shí)可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和；酶量的選擇任何時(shí)候2種酶的總量不能超過反應(yīng)體系的1/10體積，而且最大反應(yīng)體系最好不要小于20ul。以TAKARA的為例，其對(duì)1單位酶的定義如下：在50μl

反應(yīng)液中，30℃溫度下反應(yīng)1小時(shí)，將1μg

的λDNA完全分解的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的因素外，該酶可分解15μg的DNA。瓊脂糖凝膠電泳DNAagarosegelelectrophoresis一、瓊脂糖凝膠天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose，約占80％）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。

在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型(相對(duì)分子質(zhì)量不同的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣)，且DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子：一般來說，其中閉環(huán)結(jié)構(gòu)泳動(dòng)最快，其次為線性結(jié)構(gòu)，最慢的可能是單鏈開環(huán)。二、瓊脂糖凝膠電泳原理染色溴化乙錠(EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，可與DNA結(jié)合,在紫外光照射下呈現(xiàn)紅橙熒光,有致癌性。Gelview:熒光染料,在紫外光照射下呈現(xiàn)綠色熒光瓊脂糖凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍膠濃度（％）線性DNA分子大?。╧b）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3膠濃度越大，越適宜分離的DNA越小影響遷移速率因素

1、DNA的分子大小

2、瓊脂糖濃度

3、DNA分子的構(gòu)象

4、電源電壓

5、嵌入染料的存在

6、離子強(qiáng)度影響

三、實(shí)驗(yàn)材料１．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色；二甲苯晴呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。２．Gelview

：熒光染料,在紫外光照射下呈現(xiàn)綠色熒光３．TBE：５×TBE貯液2L：54gTris-base、

27.5g硼酸、20ml0.5M的EDTA(pH8.0)

加水至1L,用錢稀釋10倍４．瓊脂糖：1g5、DNAMarker5000DNAMarke