動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)姓名：李健專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)目錄細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和準(zhǔn)備工作細(xì)胞培養(yǎng)總原則無(wú)菌操作技術(shù)及常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作方法1.2細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和準(zhǔn)備工作一、細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)恒溫培養(yǎng)箱其他設(shè)備（電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、細(xì)胞液氮儲(chǔ)存器、離心機(jī)、恒溫水域鍋、消毒器、抽濾裝置等）無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室⑴設(shè)計(jì)原則：防治微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無(wú)煙塵。⑵組成：更衣間：放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。緩沖間：位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)與幾個(gè)操作間相通。操作間：放在內(nèi)間，供無(wú)菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，房間不受日光直射，大小適宜，高2.5m。超凈工作臺(tái)分類側(cè)流式：氣流由左側(cè)或右側(cè)通過臺(tái)面流向?qū)?cè)直流式：氣流從上向下或從下向上流動(dòng)外流式：氣流向操作者方向吹來(lái)注意事項(xiàng)：使用前半小時(shí)先開紫外線燈滅菌，再關(guān)滅菌燈啟動(dòng)風(fēng)機(jī)，然后進(jìn)行操作。使用后用75％的酒精擦洗臺(tái)面。

切記：不要用有機(jī)溶劑擦拭擋風(fēng)玻璃。恒溫培養(yǎng)箱變通電熱恒溫培養(yǎng)箱

CO2培養(yǎng)箱37℃，飽和濕度，5％CO2其他設(shè)備酶標(biāo)儀二、細(xì)胞培養(yǎng)常用器材及處理方法玻璃器材塑料器材橡皮器材金屬器材其他用品玻璃器材常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管。首次使用：重復(fù)使用的處理步驟：自來(lái)水刷洗0.1％稀鹽酸浸泡過夜自來(lái)水沖洗自來(lái)水刷洗硫酸－重鉻酸鉀浸泡過夜自來(lái)水沖洗10次雙蒸水沖洗2次單蒸水沖洗3次晾干、包裝121℃高壓蒸汽滅菌20min塑料器材

常用的塑料器材有多孔培養(yǎng)板（4孔、6孔、

12孔、24孔、96孔）、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸頭。重復(fù)使用的處理步驟：自來(lái)水刷洗3％HCl或2％NaOH溶液浸泡過夜自來(lái)水充分沖洗雙蒸水沖洗3次紫外線直接照射或輻照滅菌橡皮器材首次使用：自來(lái)水刷洗5％NaOH溶液煮沸15min自來(lái)水沖洗8次4％HCl鹽酸煮沸15min自來(lái)水沖洗8次雙蒸水沖洗1次單蒸水沖洗3次晾干、包裝121℃高壓蒸汽滅菌20min

重復(fù)使用的處理步驟：注意：橡膠器材需用鋁鉑包裝，放在鋁盒內(nèi)高壓蒸汽滅菌。自來(lái)水刷洗洗衣粉加熱煮沸10min自來(lái)水充分沖洗單蒸水沖洗3次蒸餾水煮沸2次，每次15min晾干、包裝121℃高壓蒸汽滅菌20min雙蒸水沖洗1次其他用品

緩沖液（PBS）：高壓蒸汽消毒

血清：56℃水浴滅活30min

合成培養(yǎng)基：過濾除菌（0.22μm、0.45μm）常見消毒法的適應(yīng)對(duì)象紫外線消毒電離輻射消毒高壓蒸汽消毒干熱消毒過濾除菌化學(xué)滅菌法適應(yīng)對(duì)象不適應(yīng)對(duì)象空氣、臺(tái)面、不適于用其它方法消毒的器皿試劑、培養(yǎng)液適于大量消毒且不適于用高壓、過濾消毒的器皿活的生物材料適于絕大多數(shù)器皿試劑玻璃器皿活的生物材料易燃、揮發(fā)性物質(zhì)金屬、橡膠、塑料制品遇熱易變性、失效試劑和培養(yǎng)液含大分子物質(zhì)量高的試劑不能用物理法除菌的物品場(chǎng)所培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃,15磅,20分鐘；布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先121℃,15磅,20分鐘，然后在烘箱中烘干玻璃瓶：干熱滅菌170℃,4小時(shí)。常用物品消毒壓力及時(shí)間無(wú)菌無(wú)毒害的環(huán)境1支持生長(zhǎng)增殖的營(yíng)養(yǎng)2其它類似體內(nèi)的環(huán)境3維持細(xì)胞性狀4

細(xì)胞培養(yǎng)總原則(一)細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合理常用設(shè)施及設(shè)備培養(yǎng)器皿：透明度好、無(wú)毒、利于細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌操作基本技術(shù)工作環(huán)境及表面的處理細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理培養(yǎng)液與培養(yǎng)細(xì)胞的處理(二)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。血清：血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子及其它營(yíng)養(yǎng)成分。其它成分（條件培養(yǎng)基）合成培養(yǎng)基的主要成分氨基酸碳水化合物無(wú)機(jī)鹽維生素其它輔助物質(zhì)培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）McCoys5AM199F12血清牛血清、馬血清、人血清（1）儲(chǔ)存于-20℃—-70℃低溫冰箱中（2）一般廠商提供的血清為無(wú)菌（3）熱滅活是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清，目的是使血清中的補(bǔ)體成分（complement）滅活（4）血清中的沉淀物絮狀物，可用離心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理。血清的主要作用

⑴提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

⑵提供貼壁和擴(kuò)展因子（FN、LN）

⑶提供激素及各種生長(zhǎng)因子（FGF、EGF、PDGF)

⑷提供結(jié)合蛋白（中和代謝產(chǎn)物及蛋白分解酶等細(xì)胞障礙因素）

⑸對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用注意點(diǎn)：

血清型號(hào)、種類不同，所含營(yíng)養(yǎng)因素有差別，不可忽視；在需要觀察細(xì)胞某種特性時(shí)，血清使問題變復(fù)雜，要除去。血清的使用與儲(chǔ)存

使用前的處理

56℃滅活30min→去除補(bǔ)體成分

（趨勢(shì)：大部分細(xì)胞培養(yǎng)不需滅活；需要滅活的：巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞等）

儲(chǔ)存條件

滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），－20℃儲(chǔ)存；使用前4℃融化。

使用濃度

一般為5％～20％，最常用的是10％。其它常用液體試劑⑴Hank’s⑵D-Hank’s⑶PBS⑷NaHCO3（7.5%

）⑸胰酶溶液（0.25%）0.01MPBS*(pH7.4,高壓滅菌)組分含量(g/L)NaCl8.0KCl0.2Na2HPO4Na2HPO4?7H2ONa2HPO4?12H2O1.442.683.58KH2PO40.24H2O1000

緩沖液1×PBS(Phosphate-BufferedSallines)

消化液⑴作用：分離組織和分散細(xì)胞⑵常用消化液：胰蛋白酶二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)⑶通常使用濃度:0.25%Trypsin:0.25ginPBS0.02%-0.03%EDTA:0.02-0.03gEDTApH:7.4；過濾；-20℃保存胰蛋白酶(簡(jiǎn)稱胰酶)：黃白色粉末，易潮解，冷暗干燥處保存，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制。目前應(yīng)用的胰蛋白酶主要來(lái)自?；蜇i的胰腺胰酶的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，離散細(xì)胞胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰酶簡(jiǎn)介胰蛋白酶胰酶對(duì)細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的種類和細(xì)胞的特性有密切關(guān)系。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。通常：胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液可終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。

胰蛋白酶EDTA是一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞毒性小，價(jià)格低廉，使用方便。通常與胰蛋白酶溶液混合使用(混合液)，濃度見前面。注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，一定要用Hanks液沖洗干凈，因殘留的EDTA會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

EDTA·4Na溶液(三)其它類似體內(nèi)的環(huán)境溫度氣體滲透壓氫離子濃度(PH)其他(四)合理的計(jì)劃，維持細(xì)胞性狀

盡早凍存原代細(xì)胞，復(fù)蘇后狀態(tài)恢復(fù)的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定存在的細(xì)胞。需要做實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞要選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。防止細(xì)胞污染，如遇污染，及時(shí)處理。無(wú)菌操作技術(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無(wú)菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠。【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無(wú)誤后將其放置操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。

【操作前消毒】無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩鳌U液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。

【洗手和著裝】原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長(zhǎng)袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽?！净鹧嫦尽?/p>

在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無(wú)菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行?！静僮鳌窟M(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

1.紫外滅菌：實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%酒精擦拭無(wú)菌操作抬面，并開啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70%酒精擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。

2.無(wú)菌操作：

無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70%酒精擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。無(wú)菌操作常識(shí)3.

安全取用：小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。無(wú)菌操作常識(shí)85培養(yǎng)細(xì)胞的觀察１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)：

1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。

2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：1．懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2．半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3．貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細(xì)胞傳代方法貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法：1吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-5min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5離心，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液制成懸液。6吸取1/10—1/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。7加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。8將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。

在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定1．臺(tái)盼藍(lán)法

活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色；

用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力；

方法：

1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中；

2、加入0.5ml0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘；

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片；

4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力；

死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀。

活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來(lái)進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。

2．四唑鹽（MTT）比色法

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；

MTT比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值；

MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。操作步驟：（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）；（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)；（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解；（4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)490納米）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。常規(guī)觀察需每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)過程中出現(xiàn)的變化：1.培養(yǎng)液的顏色與透明度2.細(xì)胞形態(tài)變化3.

細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)4.微生物污染細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：

當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入