臨床免疫學(xué)檢驗：5 免疫熒光技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)

用可以微量檢測的標(biāo)記物（示蹤物質(zhì)）標(biāo)記抗原或抗體，作為試劑，與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合反應(yīng)后，測定抗原抗體復(fù)合物中的標(biāo)記物，從而推斷所測抗體或抗原有無及量的多少。免疫標(biāo)記技術(shù)

=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性免疫標(biāo)記技術(shù)的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)酶熒光素同位素常用標(biāo)記物

熒光素酶同位素膠體金可發(fā)光化學(xué)物質(zhì)試驗命名：

根據(jù)標(biāo)記物命名如：免疫熒光技術(shù)免疫酶技術(shù)等第七章熒光免疫技術(shù)（fluoroimmunoassay)（P61)

原理：用熒光素標(biāo)記抗原或抗體，與待測標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，通過檢測熒光，確定標(biāo)本中有無待測的抗體或抗原。特點：特異性、敏感性、直觀性熒光免疫技術(shù)分類：免疫熒光顯微技術(shù)（定性、定位）免疫熒光測定技術(shù)---熒光免疫分析（定量）一.熒光、熒光素及熒光顯微鏡（一）熒光

一種光照射某種物質(zhì)時，該物質(zhì)由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時，可發(fā)射出比照射光波長更長的光，稱為熒光。照射光:可見光、紫外光(二）熒光素

能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可作為染料。

常用熒光素：1.異硫氰酸熒光黃(FITC)

可發(fā)出黃綠色熒光2.四乙基羅丹明（RB200)

發(fā)出橘紅色熒光3.藻紅蛋白（PE）

發(fā)出橙色熒光4.鑭系螯合物：銪（Eu3+)、鉍(Tb3+)、鈰(Ce3+)等螯合物。熒光衰變時間長，適合時間分辨熒光免疫測定（三）熒光顯微鏡

1.結(jié)構(gòu)：主要組成

A.白熾光源（超高壓汞燈）：發(fā)射紫外光或蘭紫光；

B.兩組濾光板:激發(fā)濾板（選擇合適的激發(fā)光譜）；抑制濾板（抑制紫外光或蘭紫光進(jìn)入視野，只允許熒光通過。

C.顯微鏡：普通的光學(xué)顯微鏡。

光路程序：白熾光源——發(fā)射紫外光or蘭紫光——激發(fā)濾板——紫外光

——被檢物（熒光染色標(biāo)本）——紫外光＋熒光

——抑制濾板——熒光（顯微鏡下可見）目鏡阻擋濾鏡載玻片熒光顯微鏡光路示意圖光源隔熱濾片激發(fā)濾片聚光器物鏡熒光顯微鏡光路示意圖熒光顯微鏡據(jù)光源路徑分

透射式（光源從下面經(jīng)聚光器會聚后到達(dá)樣品，適用于觀察對光可透的標(biāo)本）落射式（光源從上面到達(dá)樣品，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。適用于觀察透明度不好的標(biāo)本及各種活性組織等）2.使用注意事項：染色后立即檢查（熒光易猝滅）準(zhǔn)備好后開啟白熾光源，不能隨時啟滅。打開后15分鐘才能關(guān)閉每次使用2小時保持室內(nèi)通風(fēng)

熒光素可以標(biāo)記（染色）抗原，也可以標(biāo)記抗體標(biāo)記抗原用得少標(biāo)記抗體用得多

一般免疫熒光顯微技術(shù)均標(biāo)記抗體二.免疫熒光顯微技術(shù)（一）熒光抗體的制備（二）片子的制作（三）熒光抗體染色方法（一）熒光抗體的制備：

純化的一定量抗體加一定量FITC(攪拌使結(jié)合）去除游離熒光素測抗體效價、測熒光素與蛋白質(zhì)（Ab）結(jié)合比（F/P）

小量分裝保存?zhèn)溆肍/P是評價熒光抗體的重要指標(biāo)。活細(xì)胞染色：F/P=2.4

固定標(biāo)本染色：F/P=1.5

抗體效價：＞1：16（二）片子的制作：1.常做切片（組織）、涂片（細(xì)菌）、印片（細(xì)胞），要求薄、均勻，并與玻片充分固定。固定后不能被洗脫。2.注意保持抗原完整性3.不同材料固定方法不同（無水已醇、丙醇、聚甲醛等）（三）熒光抗體染色法

1.直接法

待測標(biāo)本固定（Ag？）+Ab

快、直接、干擾因素少用于檢測抗原每檢測一種抗原需標(biāo)記相應(yīng)的熒光抗體,較麻煩洗滌，AgAb2.間接法

分兩步：第一步：熒光素標(biāo)記抗抗體（如熒光標(biāo)記的羊抗人IgG）；

第二步：已知Ag固定＋待測標(biāo)本（Ab？）——洗滌，＋熒光標(biāo)記的抗抗體——洗滌，熒光顯微鏡鏡檢

間接法用得最多優(yōu)點：制備一種熒光標(biāo)記二抗（抗抗體）可用于多種Ab檢測靈敏度高3.補(bǔ)體法：第一步：熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體；第二步：已知Ag固定＋待測標(biāo)本（Ab？）＋補(bǔ)體——洗滌，＋熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體——洗滌，熒光顯微鏡鏡檢特點：

靈敏度高，制備一種熒光抗補(bǔ)體用于多

種檢測

干擾因素多，補(bǔ)體不穩(wěn)定，易失活，該法少用4.雙標(biāo)記法

用兩種熒光素（FITC、羅丹明）分別標(biāo)記針對同一Ag上不同抗原表位的抗體，對同一標(biāo)本染色，當(dāng)Ag有兩種相應(yīng)抗原表位存在時，可同時見到黃綠和橙紅兩種熒光。（四）免疫熒光顯微技術(shù)優(yōu)缺點優(yōu)點：

1.特異性、敏感性高

2.快速

3.可定位

4.既可測Ag（各種病原體、腫瘤相關(guān)抗原）、可測Ab（自身抗體）缺點：1.需要熒光顯微鏡2.存在非特異熒光干擾（產(chǎn)生原因：自發(fā)、抗體不純、交叉反應(yīng)、技術(shù)問題）3.定性測定、判斷結(jié)果不客觀4.制備的片子難以長期保存（熒光猝滅）4.免疫熒光顯微技術(shù)的優(yōu)缺點5.熒光顯微鏡的光源分幾種？三.熒光免疫分析時間分辨熒光免疫測定---液相檢測原理：用銪(Eu3+)等具有較長熒光壽命的稀土金屬作熒光標(biāo)記物來標(biāo)記Ab或Ag，從而檢測待測標(biāo)本中相應(yīng)Ag或