實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)

實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第一頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)基本概念細(xì)胞培養(yǎng)：從動(dòng)物或植物中取出細(xì)胞，使其在合適的人工環(huán)境中生長。細(xì)胞來源：細(xì)胞可直接從組織中取出并采用酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可來自已經(jīng)建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。原代培養(yǎng)：是指將細(xì)胞從組織中分離后，使其在合適的條件下增殖，直到占據(jù)所有可用基質(zhì)(即：匯合)的培養(yǎng)階段。傳代培養(yǎng)：在細(xì)胞生長至匯合，必須將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的容器中并更換新鮮培養(yǎng)基，為其提供更多繼續(xù)生長的空間。細(xì)胞系：首次傳代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物即被稱為細(xì)胞系。細(xì)胞株：如果將細(xì)胞系的一個(gè)細(xì)胞通過克隆或者其他方法從培養(yǎng)物中明確地選擇出來，就成為一個(gè)細(xì)胞株。第二頁，共六十八頁，2022年，8月28日有限細(xì)胞系與連續(xù)細(xì)胞系：正常細(xì)胞通常只能分裂有限的次數(shù)，隨后就會(huì)喪失增殖的能力，這是一個(gè)由遺傳決定的事件，被稱為衰老；這種只能分裂有限的次數(shù)的細(xì)胞系被稱為有限細(xì)胞系。但是，一些細(xì)胞系會(huì)通過“轉(zhuǎn)化”的過程變?yōu)橛郎约?xì)胞系，這一過程可自然發(fā)生，也可經(jīng)化學(xué)或病毒誘導(dǎo)發(fā)生。有限細(xì)胞系發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得無限分裂能力后，就成為連續(xù)細(xì)胞系。培養(yǎng)條件：細(xì)胞培養(yǎng)的人工環(huán)境必須包括合適的容器，容器中含有一定的基質(zhì)或介質(zhì)，為細(xì)胞提供必需的營養(yǎng)素(氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì))、生長因子、激素和氣體(O2、CO2)，并可調(diào)節(jié)其物理化學(xué)環(huán)境(pH、滲透壓、溫度)。細(xì)胞培養(yǎng)基本概念第三頁，共六十八頁，2022年，8月28日為什么要細(xì)胞培養(yǎng)？避開機(jī)體自身調(diào)節(jié)和實(shí)驗(yàn)應(yīng)激的整體因素的影響；環(huán)境控制、均一性（可以使用一批同源細(xì)胞獲得穩(wěn)定、可重復(fù)的結(jié)果）、經(jīng)濟(jì)、規(guī)模和機(jī)械化；第四頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)中最重要的一項(xiàng)技術(shù)，可為細(xì)胞正常生理和生化(例如：代謝研究、衰老研究)、藥物和毒性化合物對(duì)細(xì)胞的作用以及致突變和致癌研究提供上佳的模型系統(tǒng)。細(xì)胞培養(yǎng)還可用于藥物篩選和開發(fā)以及生物化合物(例如：疫苗、治療性蛋白)的大規(guī)模生產(chǎn)。第五頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室一更二更一間二間三間走廊隔間準(zhǔn)備室第六頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備基本設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥(即：層流通風(fēng)櫥或生物安全柜)培養(yǎng)箱(推薦使用濕式二氧化碳培養(yǎng)箱)水浴鍋離心機(jī)冰箱和冰柜(–20°C)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(例如：Countess?自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或血球計(jì)數(shù)器)倒置顯微鏡液氮(N2)冷凍柜或凍存容器滅菌器(即：高壓滅菌器)擴(kuò)增設(shè)備：抽吸泵(蠕動(dòng)泵或真空泵)pH計(jì)共聚焦顯微鏡流式細(xì)胞儀其他用品：細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、滾瓶、多孔板)吸管和移液器注射器和針頭廢物容器培養(yǎng)基、血清和試劑細(xì)胞系第七頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥通過維持工作區(qū)域上方穩(wěn)定、單向的HEPA過濾空氣流動(dòng)，保護(hù)工作環(huán)境免受灰塵及其他空氣污染物污染。氣流可以呈水平方向，與工作臺(tái)面平行吹過，或者也可呈垂直方向，從通風(fēng)櫥上方吹向工作臺(tái)面。第八頁，共六十八頁，2022年，8月28日第九頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日準(zhǔn)備與滅菌第十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日滅菌方式的選擇熱穩(wěn)定的物品（玻璃器皿、金屬）用干熱滅菌：160℃，1h；熱穩(wěn)定的液體：水、鹽溶液和適度熱穩(wěn)定的塑料制品：硅樹脂、尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯用濕熱滅菌：121℃，20min；不耐熱液體：過濾除菌；不耐熱物品：射線滅菌30min，70%乙醇擦拭。第十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日滅菌方式的選擇項(xiàng)目消毒方式玻璃器皿干熱金屬制品干熱帶螺口蓋的玻璃品高壓滅菌，將蓋懸松玻璃移液管干熱槍頭高壓滅菌離心管(5ml，15ml，50ml)高壓滅菌，直立放置EP管(1.5ml，2ml，5ml，10ml)高壓滅菌試管干熱艾本德移液器（新）高壓滅菌，整支高壓滅菌過濾瓊脂氨基酸蛋白胨抗生素EDTA牛血清白蛋白甘油膠原酶HEPES藥物甲基纖維素谷氨酸鹽酚紅生長因子鹽溶液HCL水NaHCO3NaOH血清丙酮酸鈉胰蛋白酶第十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日玻璃器皿、金屬器皿的清洗和滅菌將玻璃和金屬器皿放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清潔劑（Decon）的洗液中，侵泡過夜或至少2h（鋁、銅制品不得浸泡）;試管刷清洗，自來水沖洗4次，去離子水沖洗3次；倒置于烘箱中烘干；鋁箔封口保存；使用前24~48h，放入干熱滅菌箱中，160℃滅菌1h，自然冷卻后使用；100目和600目的篩網(wǎng)需要超聲清洗。第二十頁，共六十八頁，2022年，8月28日塑料制品的清洗和滅菌將塑料制品放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清潔劑（Decon）的洗液中浸泡30min，自來水沖洗干凈；置于超聲清洗器中清洗30min；用自來水充分清洗后用去離子水清洗（塑料制品要用專用的刷子或者將自來水連上膠管伸進(jìn)塑料管內(nèi)部沖洗）；將離心管的蓋子和管體分開用圖紙包起來，直立放入滅菌鍋中濕熱滅菌121℃，20min（高速離心管尤其注意滅菌時(shí)要直立放置）；自然冷卻后置于烘箱中烘干。第二十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日水的制備和滅菌細(xì)胞培養(yǎng)需要用超純水（UPW）；第一：反向滲透或蒸餾；第二：碳過濾去除有機(jī)或無機(jī)膠體（總有機(jī)碳TOC≤10ug/L）；第三：去離子（電阻≥10MΩ/cm）；高壓滅菌121℃，20min，自然冷卻。第二十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日PBS的制備燒杯中加入1L滅菌超純水；放在磁力攪拌器上，設(shè)定轉(zhuǎn)速200r/min；打開PBS干粉（1L裝）加入燒杯中；攪拌至完全溶解；PH計(jì)檢測(cè)PH為7.4，變化＜0.1；分裝至滅菌的儲(chǔ)液瓶中，蓋子只輕旋一圈，放入滅菌鍋中濕熱滅菌；自然冷卻后蓋緊，4℃或室溫保存。第二十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日配置完全培養(yǎng)基燒杯中加入1L滅菌超純水，置于磁力攪拌器上，設(shè)定200r/min，邊攪拌邊加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉）；用注射器吸取超純水，將包裝袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下；干粉溶解后加入2.438gNaHCO3，攪拌至完全溶解；用HCl和NaOH調(diào)節(jié)PH為7.2，過濾除菌后（PH接近7.4）4℃保存；商業(yè)胎牛血清一般是熱滅活的，可以直接使用，如果需要過濾，先用0.22μm濾器過濾后，再用0.1μm濾器低壓過濾才能保證無菌、無支原體。雙抗：稱取氨芐青霉素0.625g，鏈霉素1g，PBS定容至100ml，4℃過夜，過濾除菌分裝。使用時(shí)如需配置200ml完全培養(yǎng)基，需加入180mlDMEM/F12，加入20ml胎牛血清，再加入2ml雙抗即可。使用時(shí)再加入血清的好處是DMEM/F12培養(yǎng)基可以4℃保存6~9個(gè)月，而加入血清后只能保存2~3周。第二十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術(shù)第二十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術(shù)目的：在干凈的培養(yǎng)物和含有微生物的外環(huán)境之間建立一個(gè)屏障，防止微生物的污染，細(xì)菌、支原體、酵母菌、真菌孢子等。要求：與培養(yǎng)物直接接觸的所有材料必須無菌（物品無菌），培養(yǎng)物和它的非滅菌環(huán)境之間不能有直接接觸（環(huán)境無菌）。要素：無菌工作區(qū)域、良好的個(gè)人衛(wèi)生、無菌試劑和培養(yǎng)基以及無菌操作。第二十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日無菌工作區(qū)域——潔凈臺(tái)的使用在一個(gè)十分干凈的工作臺(tái)上開始工作（什么都沒有）；用70%乙醇充分擦洗、紫外滅菌30min；只把需要的物品（確保充分滅菌或用70%酒精擦拭）放入工作臺(tái)內(nèi)，潔凈臺(tái)不可用做儲(chǔ)存區(qū)域；將工作區(qū)的物品整理好（中央寬敞、容易拿取、拿取時(shí)不跨越物品、不遮擋層流）；隨時(shí)移走不再需要的物品；要在視野范圍內(nèi)操作；如有任何溢出物需隨時(shí)擦去，并用70%乙醇擦洗；實(shí)驗(yàn)完畢要移走潔凈臺(tái)里的所有物品（什么都沒有），并用70%乙醇徹底擦洗工作面，然后紫外滅菌30min；第二十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日在通風(fēng)櫥中部開闊區(qū)域放置細(xì)胞培養(yǎng)容器移液器置于右前方易于取用的地方試劑和培養(yǎng)基置于右后方，便于吸取試管架置于中后部，用于固定其他試劑小型容器置于左后部，用于盛放廢液第二十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日第二十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日良好的個(gè)人衛(wèi)生洗手、戴上PE手套；更換潔凈服（長款）；女生要將頭發(fā)扎在身后；戴上乳膠手套；操作中經(jīng)常進(jìn)行手消毒（自動(dòng)手消毒機(jī)）；如進(jìn)行有生物危險(xiǎn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要P2實(shí)驗(yàn)室、生物安全柜、保證無裸露的皮膚。第三十頁，共六十八頁，2022年，8月28日外來試劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)物的無菌商品化試劑和培養(yǎng)基經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制以確保其無菌性，但其瓶子的外表面不是無菌的，新采購的試劑瓶子以及從冰箱或水浴槽中拿出來后，要用70%酒精擦拭滅菌再放入潔凈臺(tái)內(nèi)。自己配置的所有試劑、培養(yǎng)基和溶液必須采用適當(dāng)?shù)臏缇椒?例如：高壓蒸汽、無菌過濾)進(jìn)行滅菌。引進(jìn)的培養(yǎng)物（如購買的細(xì)胞系）是高危污染源，要先經(jīng)過檢疫，并堅(jiān)持用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)直至證明沒有污染。第三十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)箱的無菌培養(yǎng)箱是主要的污染源，應(yīng)每學(xué)期做徹底清潔（箱體、架子、隔板、托盤），可用70%酒精充分擦拭，并完全揮發(fā)晾干。培養(yǎng)箱使用時(shí)底部濕盤要加入1%硫酸銅。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，盡可能選購帶滲透蓋的培養(yǎng)瓶，不僅可以在CO2環(huán)境中迅速達(dá)到平衡，而且不會(huì)有污染的危險(xiǎn)。第三十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作紫外滅菌：潔凈臺(tái)使用前、使用中的間隙、使用后都要用紫外滅菌，但光束的有效性有限，因?yàn)樗荒苓_(dá)到縫隙中。70%酒精擦拭：潔凈臺(tái)使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各種試劑瓶、儲(chǔ)液瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿，放入潔凈臺(tái)之前，必須用70%乙醇擦拭其外部，注意要選用抗乙醇的記號(hào)筆。移液：使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體；每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。使用時(shí)方可打開無菌吸管的包裝。吸管應(yīng)始終位于工作區(qū)域內(nèi)。一般移液操作用移液管和電動(dòng)移液器，微量移液操作（1ml及以下）用移液器，一次為多個(gè)器皿分裝液體用注射器，只有滅菌的部分（移液管、槍頭、注射器）可以伸進(jìn)無菌容器內(nèi)（儲(chǔ)液瓶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶），移液時(shí)避免使吸管尖端觸碰到任何非滅菌物品包括瓶口螺紋的外緣。第三十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作加蓋：所有試劑瓶子要用深螺旋的聚丙烯蓋子，使用時(shí)要將蓋子口朝下放置在工作區(qū)域，不用時(shí)要及時(shí)蓋好，但可以不用旋緊。灼燒：開放工作臺(tái)才需要灼燒，細(xì)胞培養(yǎng)用的潔凈臺(tái)中不需要也不建議灼燒、明火既破壞了層流又難以除去生物危害物質(zhì)，還帶來了火災(zāi)隱患，明火帶來的高溫還會(huì)影響HEPA過濾的壽命。試劑瓶和培養(yǎng)瓶的操作：在潔凈臺(tái)內(nèi)可以使試劑瓶口敞開直立，但不能讓手或其他物品在開口的容器或無菌吸管的上方往來。倒出液體：任何時(shí)候都不要從試劑瓶或培養(yǎng)瓶中直接傾倒培養(yǎng)基和試劑。第三十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日小結(jié)保持一個(gè)干凈有調(diào)理的工作空間，并僅在需要的時(shí)候才在其中工作。盡可能的預(yù)先準(zhǔn)備好再開始操作，使培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱外停留最短的時(shí)間，而且要做到各種操作快速、簡便和順利。保持能看到操作面上的每樣?xùn)|西，時(shí)時(shí)警惕無菌面和非無菌面的偶然接觸。實(shí)驗(yàn)完畢后，保持工作區(qū)的干凈整潔。第三十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日污染化學(xué)污染：培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑；生物污染：細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染。細(xì)菌：通常被細(xì)菌污染的培養(yǎng)物呈云霧狀(即：渾濁狀)，有時(shí)表面會(huì)覆蓋一層薄膜。另外，經(jīng)常還會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然降低。在低倍顯微鏡下可見，細(xì)菌為細(xì)胞之間移動(dòng)的微小顆粒，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出各個(gè)細(xì)菌的形狀，有球狀、桿狀和螺旋狀等。圖為被大腸桿菌污染的293細(xì)胞第三十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日酵母：培養(yǎng)物被酵母污染后也會(huì)變得渾濁，

但pH值變化極小，污染嚴(yán)重時(shí)pH值才會(huì)升高。在顯微鏡下，酵母呈單個(gè)卵圓形或球形顆粒，有些會(huì)芽生出較小的顆粒。圖為293細(xì)胞被酵母污染。霉菌：是真菌界的一種真核微生物，以被稱為菌絲的多細(xì)胞絲狀體形式生長。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細(xì)束狀纖維，有時(shí)呈較為密集的孢子團(tuán)塊。病毒：是一種微觀感染性物質(zhì)，利用宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)制。病毒體積極小，因而要檢測(cè)培養(yǎng)物中有無病毒以及將其從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室所用試劑中去除都十分困難。使用病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)卻會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員造成嚴(yán)重的健康威脅，特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的是人或靈長類動(dòng)物細(xì)胞時(shí)。第三十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日支原體：是一種沒有細(xì)胞壁的簡單細(xì)菌，被認(rèn)為是能夠自我復(fù)制的最小的生物。由于體積極小(一般小于1微米)，支原體的檢測(cè)十分困難。可在培養(yǎng)物中持續(xù)存在造成慢性支原體感染，而不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為：細(xì)胞增殖速度降低、飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；MycoFluor支原體檢測(cè)試劑盒：A固定細(xì)胞無污染，B固定細(xì)胞支原體污染，C活細(xì)胞支原體污染。第三十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日抗生素的使用細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不應(yīng)常規(guī)使用抗生素，因?yàn)檫B續(xù)使用抗生素會(huì)促進(jìn)抗生素耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，這種輕度污染最終將發(fā)展成大規(guī)模污染，而且連續(xù)使用抗生素還會(huì)掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會(huì)與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾您研究的細(xì)胞過程。抗生素只能作為對(duì)付污染的最后手段而且只能短期使用，并應(yīng)盡快撤除。如果長期使用抗生素，則應(yīng)同時(shí)進(jìn)行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對(duì)照。第三十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)—獲取細(xì)胞您可以通過原代細(xì)胞建立自己的培養(yǎng)系，或者也可選擇從商業(yè)供應(yīng)商或者非盈利性供應(yīng)單位(即細(xì)胞庫)處購買已經(jīng)建立的細(xì)胞系。聲譽(yù)良好的供應(yīng)單位可提供優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞系，而且會(huì)認(rèn)真地對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)，以確保其完好性，并且未被污染。不建議從其他實(shí)驗(yàn)室借用細(xì)胞，因?yàn)檫@會(huì)帶來很高的污染風(fēng)險(xiǎn)。無論來源如何，使用細(xì)胞之前都應(yīng)確保所有新到細(xì)胞系已經(jīng)過支原體污染檢測(cè)。第四十頁，共六十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)環(huán)境物理化學(xué)環(huán)境：溫度、pH值、滲透壓、O2和CO2；生理環(huán)境：激素和營養(yǎng)素濃度；培養(yǎng)方式：一種是使細(xì)胞在人工基質(zhì)上單層生長(即：貼壁培養(yǎng))，另一種是使細(xì)胞在培養(yǎng)基中自由漂浮生長(懸浮培養(yǎng))。除造血細(xì)胞系和其他一些細(xì)胞外，大多數(shù)脊椎動(dòng)物細(xì)胞均具有貼壁依賴性，必須在合適的基質(zhì)上培養(yǎng)，且該基質(zhì)必須經(jīng)過特殊處理，以便細(xì)胞粘附和伸展。培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是培養(yǎng)環(huán)境中最重要的成分，因?yàn)樗商峁┘?xì)胞生長所必需的營養(yǎng)素、生長因子和激素，并能調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系的pH值和滲透壓。培養(yǎng)基可分為三類：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、減血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基，三者對(duì)血清添加量的要求不同。第四十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日血清：是基礎(chǔ)培養(yǎng)基中極為重要的細(xì)胞生長和粘附因子、激素、脂質(zhì)和礦物質(zhì)來源。此外，血清還可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性，并可作為向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送脂質(zhì)、酶、微量營養(yǎng)素和微量元素的載體。但是，在培養(yǎng)基中添加血清也有一些缺點(diǎn)，包括：成本高，存在標(biāo)準(zhǔn)化、特異性和變異性問題，具有一些不良效應(yīng)，如：可促進(jìn)或抑制某些細(xì)胞的生長或功能。pH值：大多數(shù)正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好，而且不同細(xì)胞株間差異極小。但是，目前發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在輕度偏酸性的環(huán)境(pH7.0–7.4)中生長較好，而有些正常的成纖維細(xì)胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境(pH7.4–7.7)?？赏ㄟ^添加有機(jī)緩沖鹽(例如：HEPES)或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽來緩沖細(xì)胞培養(yǎng)中的pH值變化。二氧化碳：通常使用濃度為5%的二氧化碳來控制培養(yǎng)體系的pH值，大多數(shù)細(xì)胞二氧化碳濃度在4–10%之間。溫度：大多數(shù)人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在36℃至37℃下具有最佳生長狀態(tài)。禽類細(xì)胞系在38.5°C時(shí)具有最佳生長狀態(tài)。雖然此類細(xì)胞也可在37°C下培養(yǎng)，但其生長速度會(huì)變慢。第四十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日補(bǔ)充：CO2使用中的問題CO2鋼瓶漏氣問題；鋼瓶的閥門關(guān)到最小和開到最大均不會(huì)漏氣，只有開到中間大小才會(huì)漏氣；CO2氣壓過大吹壞培養(yǎng)箱濾器問題；上海減壓閥門廠樊瑞YT12X-0.1L￥380第四十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)(即：形狀和外觀)，確認(rèn)細(xì)胞健康狀態(tài)，還要仔細(xì)觀察培養(yǎng)的細(xì)胞以確定無污染；細(xì)胞變質(zhì)的征象包括：核周顆粒、胞質(zhì)空泡、細(xì)胞隆起變圓或與基質(zhì)分離等，這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致，例如：培養(yǎng)物污染、細(xì)胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質(zhì)，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。變質(zhì)嚴(yán)重時(shí)將會(huì)成為不可逆的變化（啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡），因此換液和傳代的頻率要避免發(fā)生這些變化，因?yàn)檫@些變化很難逆轉(zhuǎn)；新加入工作的培養(yǎng)員要先看一下細(xì)胞系留存的細(xì)胞參考圖片（以不同密度下拍攝），并且在以后的培養(yǎng)中經(jīng)常比較，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題。第四十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)根據(jù)形狀和外觀(即：形態(tài))可將培養(yǎng)的細(xì)胞分為三大類。成纖維樣細(xì)胞：為雙極或多極細(xì)胞，呈細(xì)長形，貼附在基質(zhì)上生長。上皮樣細(xì)胞：呈多角形，尺寸更為規(guī)則，貼附在基質(zhì)上呈散在斑片狀生長。淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞：呈球形，通常懸浮生長，不貼附在基質(zhì)表面。神經(jīng)元細(xì)胞：有多種形狀和大小，I型(有很長的軸突)，II型(沒有軸突)。成纖維樣細(xì)胞上皮樣細(xì)胞淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞第四十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日換液一旦培養(yǎng)開始就要定期為細(xì)胞更換培養(yǎng)基，即使不增殖的細(xì)胞也要更換；換液的依據(jù)：1.PH降低，PH降低通常表示乳酸蓄積，乳酸是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，是細(xì)胞生長的不利因素。培養(yǎng)基變橙色時(shí)需要換液，如果培養(yǎng)基變成黃色，此時(shí)PH已達(dá)到6.0，細(xì)胞將會(huì)失去活性；2.細(xì)胞的密度和類型，每種細(xì)胞都有其適合的接種密度，且生長速度也不相同，有的細(xì)胞系甚至需要每天換液和傳代，培養(yǎng)前一定要了解清楚；3.形態(tài)發(fā)生衰退，要做到對(duì)細(xì)胞形態(tài)很熟悉并且定期觀察，細(xì)胞形態(tài)衰退不可逆，要避免發(fā)生。第四十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日換液步驟觀察培養(yǎng)基顏色，鏡檢觀察細(xì)胞的密度以及是否有污染和衰退，決定是否換液；以70%酒精擦拭培養(yǎng)瓶底；打開培養(yǎng)瓶蓋，用5ml移液器或蠕動(dòng)泵吸出培養(yǎng)基；加入預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基，如果是不易貼壁的細(xì)胞（293），可以將培養(yǎng)瓶立起，將培養(yǎng)基加在細(xì)胞培養(yǎng)面的對(duì)側(cè)，防止將細(xì)胞吹散；蓋好蓋子，放回培養(yǎng)箱。第四十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日傳代細(xì)胞生長：延遲期、對(duì)數(shù)生長期、停滯期；細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長晚期、接近匯合而未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)即應(yīng)進(jìn)行傳代。正常細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)會(huì)脫離細(xì)胞周期并停止生長，進(jìn)入停滯期(接觸抑制)，重新接種后需要較長時(shí)間才能恢復(fù)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞即使達(dá)到匯合狀態(tài)也能繼續(xù)增殖，但如不及時(shí)傳代會(huì)開始衰退，并且增殖效率逐漸降低，最后逐漸死亡；若細(xì)胞處于延滯期不要傳代，脫離細(xì)胞周期的細(xì)胞需傳代后繼續(xù)培養(yǎng)恢復(fù)；傳代要注意接種密度，若到了適合的時(shí)間還沒有匯合要增加接種密度，若很快彼此匯合要降低密度。原代前脂肪傳代比率是1:2第四十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日傳代步驟傳代準(zhǔn)備：裝有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)容器；新的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿；一次性無菌吸管、槍頭等；完全生長培養(yǎng)基，預(yù)熱至37℃；磷酸鹽緩沖液（PBS），不含鈣、鎂和酚紅，預(yù)熱至37℃；胰蛋白酶，預(yù)熱至37℃；細(xì)胞計(jì)數(shù)器；傳代步驟吸出舊的培養(yǎng)基并丟棄；用PBS沖洗細(xì)胞(每10cm2培養(yǎng)表面積需要2mL溶液，25cm2瓶加5mlPBS)。從貼壁細(xì)胞層的對(duì)側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細(xì)胞層，輕搖容器；吸出PBS并丟棄；第四十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日傳代步驟加入預(yù)熱的胰蛋白酶，試劑量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層(每10cm2大約0.5mL)，輕輕搖晃容器，使胰蛋白酶完全覆蓋細(xì)胞層；將多余的胰酶吸出，將培養(yǎng)容器在37℃下孵育約2~10分鐘，不同細(xì)胞系孵育時(shí)間有所差異；在顯微鏡下觀察細(xì)胞解離情況。如果解離程度未達(dá)90%，可將孵育時(shí)間延長幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細(xì)胞解離；加入預(yù)定體積的新鮮培養(yǎng)基。吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使培養(yǎng)基分散。細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋到該細(xì)胞系推薦的接種密度；將細(xì)胞重進(jìn)接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放回培養(yǎng)箱。第五十頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞的凍存原理：緩慢冷凍，親水的低溫保護(hù)劑（DMSO、甘油）可使細(xì)胞內(nèi)的水分離開細(xì)胞，在極低的溫度下（液氮-196℃）保存細(xì)胞，快速復(fù)蘇，減少細(xì)胞內(nèi)晶體的形成;DMSO：濃度范圍5%~15%，最佳7.5%~10%;細(xì)胞密度較高似乎有利于提高存活率（106~107）；以1℃/min的速度冷凍存活率最高，程序降溫盒；第五十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日凍存步驟鏡檢細(xì)胞：外觀健康、形態(tài)學(xué)特征、處于平臺(tái)期前的對(duì)數(shù)生長晚期、沒有污染；用胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基終止消化后離心，棄去培養(yǎng)基；加入含有10%DMSO的凍存液，使細(xì)胞濃度為106~107；將細(xì)胞懸液分裝至標(biāo)記好的凍存管中，擰緊蓋子；將凍存管放入程序降溫盒中，置于-80℃過夜；次日，將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存并填寫凍存記錄，一周后從液氮中取出一只驗(yàn)證凍存效果，再次記錄。第五十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日凍存細(xì)胞使用管理新獲得的細(xì)胞系應(yīng)盡快凍存幾只，稱為原始凍存；當(dāng)細(xì)胞系大量繁殖成功應(yīng)進(jìn)行凍存，作為種子儲(chǔ)備；應(yīng)保護(hù)好原始凍存和種子儲(chǔ)備，絕不可分發(fā)使用；若使用或分發(fā)該細(xì)胞系，需要連續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞系并分次凍存，分次凍存可分發(fā)給其他使用者，使用者需要按需自己凍存，當(dāng)使用者不在需要該細(xì)胞系時(shí)，應(yīng)予以丟棄而不可傳給他人使用；當(dāng)分次凍存將要用盡時(shí)，可從種子儲(chǔ)備細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充，當(dāng)種子儲(chǔ)備低于5只時(shí)，可用原始凍存進(jìn)行補(bǔ)充，要根據(jù)細(xì)胞使用的情況盡可能多的預(yù)留分次凍存細(xì)胞。第五十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞轉(zhuǎn)染基本知識(shí)第五十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日什么是轉(zhuǎn)染？為什么要做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)？細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、基因表達(dá)與調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中，其應(yīng)用越來越廣泛。

第五十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)染技術(shù)的分類常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transienttransfection)，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stabletransfection)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè)。后者也稱永久轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/10000的轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

第五十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)磷酸鈣-DNA共沉淀法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞操作簡便但重復(fù)性差，不適用于原代細(xì)胞DEAE-葡聚糖法帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞相對(duì)簡便、結(jié)果可重復(fù)，但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入細(xì)胞適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件陽離子脂質(zhì)體法（常用）帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化較大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放并表達(dá)可用于表皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等第五十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)腺病毒法通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因?qū)?。除了卵?xì)胞以外，不會(huì)整合到宿主染色體中；除了抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞，能感染幾乎所有的細(xì)胞類型。慢病毒法隨機(jī)整合到宿主染色體，可能導(dǎo)致基因失活或激活癌基因，攜帶基因不能太大。逆轉(zhuǎn)錄病毒法隨機(jī)整合到宿主染色體，可能導(dǎo)致基因失活或激活癌基因，攜帶基因不能太大，細(xì)胞需處于分裂期。第五十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日慢病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒表達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)病毒基因組RNADNARNA病毒原型人免疫缺陷I型病毒(HIV)

人5型腺病毒(Ad5)白血病病毒(MMLV)

載體系統(tǒng)1個(gè)表達(dá)質(zhì)粒和3個(gè)包裝質(zhì)粒1個(gè)穿梭質(zhì)粒和1個(gè)輔助質(zhì)粒1個(gè)表達(dá)質(zhì)粒宿主細(xì)胞分裂和非分裂的動(dòng)物細(xì)胞分裂和非分裂的動(dòng)物細(xì)胞分裂的動(dòng)物細(xì)胞是否整合整合型非整合型整合型表達(dá)豐度高水平表達(dá)高水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間慢(2~4天)快(1~2天)快(1~2天)克隆容量不超過6kb的外源片段高達(dá)8kb的外源片段不超過6kb的外源片段免疫原性低高低過表達(dá)micro

RNA特別適合適合不適合RNAi特別適合適合適合第五十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建感染目的細(xì)胞抗生素篩選建立單克隆細(xì)胞株擴(kuò)增單克隆細(xì)胞株Westernblot檢測(cè)擴(kuò)大培養(yǎng)2-3株Westernblot檢測(cè)第六十頁，共六十八頁，2022年，8月28日影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，細(xì)胞株本身的特性和活性，細(xì)胞培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)染的DNA或RNA的質(zhì)量，轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染試劑的選擇等。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中最常用的方法是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是減小脂質(zhì)體的毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染時(shí)間的長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于轉(zhuǎn)染效率的提高有巨大的作用。

根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的轉(zhuǎn)染方法第六十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日影響轉(zhuǎn)染效率的因素

1、轉(zhuǎn)染試劑2、細(xì)胞狀態(tài)3、細(xì)胞密度4、血清5、抗生素6、DNA質(zhì)量7、載體構(gòu)建第六十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)染試劑不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過這些資料可選擇最適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然，最適合的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。需要注意的是脂質(zhì)體（如Lipo2000）最怕劇烈吹打，更不能震蕩，那樣脂質(zhì)體會(huì)全部失效。

第六十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞狀態(tài)一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確保基因型不變。最適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為發(fā)生變化，也就是說同一種系的細(xì)胞株，在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以嘗試轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。

第六十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞密度不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試