非編碼RNA研究方法及應(yīng)用之環(huán)狀RNA

環(huán)狀RNA（CircularRNA,circRNA環(huán)狀RNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類特殊的非編碼RNA分子，也是RNA領(lǐng)域最新的研究熱點(diǎn).環(huán)狀RNA由特殊的選擇性剪切產(chǎn)生，大量存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，具有一定的組織、時(shí)序和疾病特異性.這種分子有巨大潛力成為新的疾病診斷標(biāo)志物.環(huán)狀RNA由于結(jié)構(gòu)的特殊性，容易在經(jīng)典分離過程被丟棄，這是其一直被科學(xué)家忽視的重要原因.經(jīng)典RNA測(cè)序方法只能分離具有特征“尾巴”的RNA，由于環(huán)狀RNA首尾鏈接，沒有尾巴，因此被普遍忽視，或許環(huán)狀RNA的功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過想像。2012年，斯坦福大學(xué)和霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的科學(xué)家在PlosOne發(fā)表的一項(xiàng)研究首次證實(shí)，人體細(xì)胞的基因表達(dá)時(shí)，環(huán)形RNA分子而非線性RNA分子是更普遍現(xiàn)象。2013年《自然》雜志的兩篇研究主要針對(duì)1500個(gè)核苷酸大小的環(huán)狀大RNA。小鼠和人類的大腦都可表達(dá)這種RNA分子，這種分子中包含70個(gè)miR的結(jié)合位點(diǎn)，簡(jiǎn)直就是miR的分子海綿。其中一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA可以阻斷miR-7功能，使被miR-7抑制的靶基因表達(dá)增高。研究證實(shí)斑馬魚環(huán)狀RNA通過抑制miR-7效應(yīng)影響大腦發(fā)育。

外顯子circRNA：由套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化形成，可經(jīng)核孔復(fù)合體運(yùn)輸至胞質(zhì)，具脫支酶抗性；內(nèi)含子circRNA：由內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化形成，可經(jīng)核孔復(fù)合體運(yùn)輸細(xì)胞質(zhì)，具RNA外切酶抗性.A:miRNA分子“海綿”作用;B:影響RNA聚合酶延長并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄;C:與RNA結(jié)合蛋白相互作用調(diào)控翻譯過程;D:在核糖體中被翻譯為蛋白質(zhì).對(duì)于環(huán)狀RNA的具體功能尚未有明確研究報(bào)道，目前只有幾種假定的說法:1）circRNA可以作為“sponge”海綿吸miRNA，抑制其功能；2)circRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)直接調(diào)控其他RNA水平；3）circRNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)活性、募集蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分或調(diào)控蛋白質(zhì)的活性；4）circRNA也可作為翻譯的模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。重要作用及研究意義：1）circRNA獨(dú)具的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源（ceRNA）特征可為藥物開發(fā)提供新的思路；2）circRNA的組織特異性和穩(wěn)定性可能使其成為一種良好的生物標(biāo)志物；3)circRNA的研究為生命的進(jìn)化研究提供新的方向。circRNA功能特征研究策略一、環(huán)狀RNA確定與篩選1）環(huán)狀RNA生物信息學(xué)預(yù)測(cè)2)環(huán)狀RNA高通量測(cè)序3）環(huán)狀RNA表達(dá)豐度檢測(cè)4）FISH檢測(cè)環(huán)狀RNA的亞細(xì)胞定位5）NorthernBlot檢測(cè)環(huán)化RNA的存在二、環(huán)狀RNA的功能研究1）環(huán)狀RNA的過表達(dá)實(shí)驗(yàn)（Gainoffunction）2）環(huán)狀RNA功能缺失實(shí)驗(yàn)（Lossoffunction）三、環(huán)狀RNA的表達(dá)調(diào)控1）環(huán)狀RNA與miRNA互作結(jié)合生物預(yù)測(cè)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證2）環(huán)狀RNA與miRNA相互作用預(yù)測(cè)研究3）環(huán)狀RNA與蛋白相互作用研究circRNA篩選circRNA表達(dá)研究circRNA功能和機(jī)制研究二代測(cè)序及生物學(xué)分析篩選circRNA篩選方法：表達(dá)量高、差異倍數(shù)顯著、位于網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵位置、在其他疾病中有過報(bào)道/本體基因?qū)膊∮杏绊懙取?.驗(yàn)證是否為真正的circRNA：q-PCR（RNaseR處理）,sanger測(cè)序2.表達(dá)及穩(wěn)定性檢測(cè)：q-PCR，Northrnblot等。3.定位：FISH實(shí)驗(yàn)。1.成環(huán)機(jī)制：CRISPR/Cas9技術(shù)2.沉默/過表達(dá)：對(duì)細(xì)胞/動(dòng)物表型的影響3.作為miRNA分子海綿：熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)4.與其結(jié)合的蛋白：RIP、pulldowncircRNA研究circRNA與腫瘤治療

circRNA有望成為抗腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn).與傳統(tǒng)的僅含有一個(gè)microRNA應(yīng)答元件(MRE)的線性miRNA海綿相比,circRNA海綿多含有數(shù)個(gè)MREs.在惡性黑色素瘤細(xì)胞系中,circRNA海綿表現(xiàn)出了優(yōu)于線性海綿的抗癌效果.作為一種替代表達(dá)線性海綿的選擇,表達(dá)circRNA海綿提供了一種產(chǎn)生持久海綿效應(yīng)的方法。環(huán)狀海綿或許是細(xì)胞內(nèi)最佳的抑制miRNA活性的方式.由于circRNA含有更多的miRNA結(jié)合位點(diǎn),因此其比典型miRNA抑制劑更有效。隨著天然環(huán)化circRNA對(duì)miRNA管理的發(fā)現(xiàn),RNA環(huán)或許是更合適的miRNA抑制劑載體,這或許可成為第二代miRNA抑制劑.這些合成circRNA抑制劑或許將成為未來的治療靶點(diǎn),并可能成為治療癌癥的新方法。ceRNA(competingendogenousRNAs)

ceRNA(competingendogenousRNAs)ceRNA假說揭示了一種RNA間相互作用的新機(jī)制。ceRNA假說揭示了一種RNA間相互作用的新機(jī)制。已知microRNA可以通過結(jié)合mRNA導(dǎo)致基因沉默，而ceRNA可以通過競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合microRNA來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。ceRNA可以通過應(yīng)答元件(microRNAresponseelements，MREs)與microRNA結(jié)合從而影響microRNA導(dǎo)致的基因沉默，這揭示了一條RNA->microRNA調(diào)節(jié)通路的存在，具有重大生物意義。ceRNA代表一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，比起miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更為精細(xì)和復(fù)雜，涉及更多RNA分子，包括mRNA、假基因、長鏈非編碼RNA和miRNA等。2011年，Pandolfi等人在“AceRNAHypothesis:TheRosettaStoneofaHiddenRNALanguage?”這篇文章中，Pandolfi等人提出了一種關(guān)于信使RNAs如何轉(zhuǎn)錄假基因，以及長鏈非編碼RNAs如何相互“交流”的新假說，這些進(jìn)一步的研究將有助于癌癥等疾病的分子機(jī)理的解析。Pandolfi等人提出了ceRNA（competingendogenousRNA，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA）的假說，認(rèn)為這種ceRNA活性能形成一種大規(guī)模轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以擴(kuò)大人類基因組中的功能性遺傳信息。他們認(rèn)為這種活性通過miRNAs應(yīng)答元件，可以作為mRNAs轉(zhuǎn)錄假基因，以及長鏈非編碼RNAs相互“交流”的新語言。Pandolfi等人也認(rèn)為ceRNA活性也在病理?xiàng)l件，比如癌癥中扮演了重要角色，因此對(duì)于解開一些癌癥研究之謎具有重要意義。數(shù)據(jù)庫（1）starBase平臺(tái)（/mirLncRNA.php）構(gòu)建了最全面的CLIP-Seq實(shí)驗(yàn)支持的miRNA和lncRNA的調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò),包括構(gòu)建了ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)盡管microRNAs（miRNAs），其他的非編碼RNAs（non-codingRNAs，ncRNAs（例如lncRNAs，假基因和circRNAs（circularRNAs，循環(huán)RNAs））和競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNAs（competingendogenousRNAs，ceRNAs）涉及到細(xì)胞命運(yùn)決定和各種人類疾病，然而令人驚訝地，對(duì)多種類型RNAs間的調(diào)控相互作用網(wǎng)絡(luò)知之甚少。本研究中，我們開發(fā)了starBasev2.0（/）以從由37項(xiàng)獨(dú)立研究產(chǎn)生的108套CLIP-Seq（PAR-CLIP、HITS-CLIP、iCLIP、CLASH）數(shù)據(jù)集中系統(tǒng)地鑒定RNA-RNA和蛋白質(zhì)-RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過分析數(shù)百萬個(gè)RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，迄今為止，我們鑒定了約9000對(duì)miRNA-circRNA、16,000對(duì)miRNA-假基因和285,000對(duì)miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。我們從CLIP支持的miRNA靶位點(diǎn)中鑒定了約10,000個(gè)ceRNA對(duì)。通過結(jié)合13種功能基因組注釋，我們開發(fā)了miRFunction和ceRNAFunction網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器以從miRNA介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中預(yù)測(cè)miRNA和其他ncRNA的功能（/mrnaCeRNA.php）（2）DIANA-LncBase數(shù)據(jù)庫（www.microrna.gr/LncBase）構(gòu)建了基于單個(gè)CLIP-Seq數(shù)據(jù)的miRNA和lncRNA調(diào)控關(guān)系。（3）lnCeDB：充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA的人類長鏈非編碼RNA數(shù)據(jù)庫長鏈非編碼RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）通過干擾microRNA（miRNA）通路，充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。這些lncRNAs中有miRNA響應(yīng)元件（miRNAresponsiveelements，MRE），并控制與它們的靶mRNAs結(jié)合的可用內(nèi)源性miRNAs，因此減少這些mRNAs的抑制。lnCeDB提供了一個(gè)能夠潛在地充當(dāng)ceRNAs的人類lncRNAs數(shù)據(jù)庫（來自GENCODE19版）。分別從TargetScan和StarBase中收集了人類miRNAs推斷的mRNA靶和比對(duì)到AGO剪裁區(qū)的靶。從miRCode數(shù)據(jù)庫中下載了人類miRNAs的lncRNA靶（更新至GENCODE11）。通過我們的找到種子匹配靶位點(diǎn)算法預(yù)測(cè)了靶向剩余GENCODE19lncRNAs的miRNA。這些推斷的miRNA-lncRNA相互作用被用被比對(duì)到lncRNAs中的Ago相互作用區(qū)。為了找出一個(gè)lncRNA-mRNA對(duì)真正成為ceRNA的可能性，我們求助于兩種方法。第一，從ceRNA對(duì)間共享的MREs數(shù)與個(gè)別候選基因的MREs總數(shù)比中計(jì)算了一個(gè)ceRNA值。第二，通過使用ceRNA對(duì)間共享的miRNAs數(shù)針對(duì)個(gè)別RNAs相互作用的miRNAs數(shù)的超幾何檢驗(yàn)確定了每個(gè)ceRNA對(duì)的P值。典型地，在被公共miRNA(s)靶向的一對(duì)RNAs中，應(yīng)該有一個(gè)表達(dá)關(guān)聯(lián)，因此增加一個(gè)ceRNA的水平導(dǎo)致其他ceRNA水平的增加。幾乎等摩爾的競(jìng)爭(zhēng)性RNAs濃度與更加深刻的ceRNA效果關(guān)聯(lián)。在InCeDB中，人們不僅能夠?yàn)g覽被共同miRNAs靶向的lncRNA-mRNA對(duì)，而且能夠比較22種人類組織中的lncRNA-mRNA對(duì)的表達(dá)以估計(jì)該對(duì)真正成為ceRNAs的幾率?？捎眯裕簭?lncedb/免費(fèi)下載。（4）競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA數(shù)據(jù)庫ceRDB一個(gè)給定mRNA能夠通過與miRNAs相互作用而被調(diào)節(jié)，反過來這些miRNAs的有效性能夠通過它們與另外mRNAs的相互作用而被調(diào)節(jié)。一個(gè)給定mRNA利用與miRNAs相互作用的功效，通過共享的miRNA響應(yīng)元件（miRNAresponseelements，MREs）被另外的mRNA（競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源mRNA）調(diào)控的概念正成為一種基礎(chǔ)遺傳調(diào)控機(jī)制。mRNA-mRNA交互的分子基礎(chǔ)是通過miRNA響應(yīng)元件，它們能夠基于分子相互作用和進(jìn)化保守型進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過研究miRNA響應(yīng)元件在全基因組mRNA中的同現(xiàn)性，我們?yōu)楸籱iRNAs靶向的特異mRNA預(yù)測(cè)了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA。與最近發(fā)表的工作中預(yù)測(cè)的調(diào)控PTEN的mRNAs相比，表明競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA數(shù)據(jù)庫（ceRDB）中呈現(xiàn)的結(jié)果具有生物相關(guān)性?？捎眯裕?cefinder/。ceRNA的研究進(jìn)展1.1人工合成的miRNA“海綿”作為ceRNA的研究

2007年，麻省理工大學(xué)的Ebert等開發(fā)了一種高效的miRNA抑制劑，他們稱之為miRNA“海綿”(miRNAsponge)。包含若干個(gè)miRNA靶定位點(diǎn)。更重要的是，這些靶定位點(diǎn)與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)切割位點(diǎn)有一些錯(cuò)配。合成的miRNA“海綿”就不會(huì)被降解，而與RISC穩(wěn)定結(jié)合，讓它遠(yuǎn)離天然的靶點(diǎn)。相對(duì)于miRNA“海綿”而言，ceRNA的優(yōu)勢(shì)在于可以抑制多種miRNA的活性，通過改變miRNA應(yīng)答元件的種類和數(shù)量，可起到網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的作用。為此，Tang等開發(fā)了一種人工ceRNA，稱為短串聯(lián)靶標(biāo)類似物(shorttandemtargetmimic,STTM)，可以有效抑制多種miRNA的功能。1.2假基因轉(zhuǎn)錄本作為ceRNA的研究

假基因(pseudogene)是在基因組內(nèi)，結(jié)構(gòu)上與編碼某一蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因相似，在進(jìn)化過程中獲得突變而喪失了產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物能力的序列片段。假基因轉(zhuǎn)錄本如果作為候選ceRNA，必須滿足可以轉(zhuǎn)錄而且進(jìn)化保守的特點(diǎn)。2010年發(fā)表了一篇Nature文章，是關(guān)于腫瘤抑癌基因磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)基因及其假基因1(PTENP1)的轉(zhuǎn)錄物有一部分高度同源的序列，PTENP1可以被調(diào)控PTEN的miRNA所調(diào)控，這種受相同miRNA共調(diào)節(jié)的關(guān)系使得過表達(dá)PTENP1引起PTEN的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加，進(jìn)而發(fā)揮腫瘤抑制作用，在缺乏miRNA的細(xì)胞內(nèi)，則PTENP1對(duì)PTEN的調(diào)控將明顯減弱。2014年最新研究發(fā)現(xiàn)，在X和Y染色體上，腫瘤抑制基因候選-2假基因(TUSC2P)與其在3'UTR區(qū)相應(yīng)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物腫瘤抑制基因候選-2(TUSC2)高度同源。TUSC2的3'UTR區(qū)和TUSC2P有多個(gè)相同miRNA結(jié)合位點(diǎn)，包括miR-17、miR-93、miR-299-3p、miR-520a、miR-608和miR-661。研究發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)的TUSC2P和TUSC2的3'UTR區(qū)抑制了細(xì)胞的增殖、存活、遷移和集落形成，增加了腫瘤細(xì)胞的死亡。通過內(nèi)生的miRNA相互影響，TUSC2P和TUSC2的3'UTR區(qū)吸收了這些miRNA，導(dǎo)致TUSC2的翻譯增加。lncRNA作為ceRNA的研究Cesana等研究人和鼠的骨骼肌分化過程發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，調(diào)控miRNA及其靶基因的表達(dá)，同時(shí)也受到miRNA的調(diào)控。通過高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選出一個(gè)叫做肌分化長鏈基因間RNA1(linc-MD1)的lncRNA，受到嚴(yán)格的調(diào)控。在未分化的肌細(xì)胞中，miR-133和miR-135可分別結(jié)合決定因子樣蛋白-1(MAML-1)和肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2C(MEF2C)基因的mRNA，并抑制其表達(dá)。linc-MD1含有這兩個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，分化過程中高表達(dá)的lincMD1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞中的miR-133和miR-135，降低了這兩種miRNA的游離濃度，從而解除了對(duì)肌肉分化相關(guān)蛋白質(zhì)因子的抑制作用,促進(jìn)細(xì)胞分化。肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(HULC)是一種在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在干細(xì)胞中低表達(dá)的lncRNA。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄后的HULC可以與miR-372配對(duì)結(jié)合，起到類似ceRNA的作用，能吸附并競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-327等miRNA的活性，影響相關(guān)基因的表達(dá)。Faghihi等發(fā)現(xiàn)，β分泌酶編碼基因(BACE1)座位能轉(zhuǎn)錄出1條lncRNA(BACE1反義RNA)，這條反義RNA可以和BACE1基因的mRNA互補(bǔ)，通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA對(duì)BACE1基因降解。Karreth等利用小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)了鋅指E-box結(jié)合同源框2(ZEB2)的mRNA和PTENmRNA產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性作用。當(dāng)ZEB2mRNA低表達(dá)時(shí)，PTEN的蛋白表達(dá)下降；而過表達(dá)了ZEB2mRNA之后，PTEN的蛋白表達(dá)增高。他們并運(yùn)用了免疫共沉淀的方法，指出了miR-92a、miR-25等miRNA在ZEB2的RNA和PTEN的mRNA上有共同的結(jié)合位點(diǎn)。編碼蛋白的mRNA作為ceRNA的研究研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)多能蛋白聚糖(versican)mRNA的3'UTR，可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-199a-3P、miR-136和miR-144，解除了這些miRNA對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1(retinoblastoma1,RB1)基因和PTENmRNA轉(zhuǎn)錄后抑制作用，提高了它們的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。Jeyapalan等過表達(dá)分化群44(CD44)抗原mRNA的3'UTR，這種3'UTR能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-216a、miR-330和miR-608，從而解除了這些miRNA對(duì)CD44本身以及細(xì)胞分裂周期蛋白42(CDC42)的轉(zhuǎn)錄后抑制作用。circRNA作為ceRNA的研究小腦變性相關(guān)蛋1(CDR1as)的環(huán)形天然反義轉(zhuǎn)錄物具有60多個(gè)miR-7的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)CDR1as表達(dá)高時(shí)，能大量結(jié)合miR-7，導(dǎo)致miR-7靶標(biāo)表達(dá)水平升高；當(dāng)CDR1as表達(dá)低時(shí)，結(jié)合少量miR-7從而導(dǎo)致miR-7靶標(biāo)表達(dá)水平降低。目前已有一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circRNA作為體內(nèi)ceRNA的作用是較為普遍的，為miRNA在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控方式研究提供了新的思路。circRNA在基因表達(dá)調(diào)控中重要作用的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了人們對(duì)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，而且提示circRNA在藥物開發(fā)和疾病診治中具有良好的應(yīng)用前景。ceRNA的研究策略1.結(jié)合下一代測(cè)序技術(shù)(NGS)的運(yùn)用下一代測(cè)序技術(shù)是利用一系列高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的基因組DNA或者RNA測(cè)序，能快速準(zhǔn)確獲得基因組編碼序列。目前，結(jié)合下一代測(cè)序技術(shù)，ceRNA研究中常用的分子生物學(xué)研究方法有：微列陣(microarray)、RNA測(cè)序(RNA-seq)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)、染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序(ChIP-seq)等。RNA-seq通過高通量測(cè)序技術(shù)分析包括mRNA、小分子RNA、非編碼RNA等RNA轉(zhuǎn)錄本種類，同時(shí)還可以反映RNA的表達(dá)水平，可準(zhǔn)確地分析出組織細(xì)胞的基因表達(dá)譜。利用該技術(shù)對(duì)來源于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC)的人類神經(jīng)元進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了多種lncRNA參與神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病發(fā)生。

RIP是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合情況的技術(shù)，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。目前，RIP技術(shù)也有了衍生的新方法，RIP與RNA-seq結(jié)合發(fā)展成為RIP-seq，應(yīng)用于癌癥以及其他疾病整體水平的RNA變化檢測(cè)。Chakraborty等最新報(bào)道了非編碼RNA沉默與定位分析(c-KLAN)技術(shù)，可對(duì)lncRNA進(jìn)行功能缺失研究和細(xì)胞定位。2.生物信息學(xué)分析在研究抑癌基因PTEN的ceRNA時(shí)，研究者用了一種叫做MuTaME(mutuallytargetedMREenrichment)的生物信息學(xué)分析方法。隨著對(duì)ceRNA研究的逐步深入，現(xiàn)已建立了幾個(gè)ceRNA相關(guān)的數(shù)據(jù)庫。Sarver等建立了首個(gè)ceRNA數(shù)據(jù)庫(ceRDB)，可用于預(yù)測(cè)互為ceRNA的mRNA。Liu等建立了長鏈基因間非編碼RNA(lincRNA)數(shù)據(jù)庫Linc2GO，用于注釋lincRNA的功能。ceRNA表達(dá)上的一致性ceRNA和它的靶mRNA存在如下關(guān)系：當(dāng)ceRNA的數(shù)量減少時(shí)，因?yàn)槠湮鄳?yīng)miRNA的數(shù)目較少，miRNA抑制固有靶mRNA的作用較強(qiáng)，使其表達(dá)減少；當(dāng)ceRNA的數(shù)量增多時(shí)，因?yàn)槠淇山Y(jié)合較多的miRNA，使得miRNA固有靶mRNA得以解除抑制，表達(dá)增多。因此，對(duì)于某一RNA來說，它和它的ceRNA之間的表達(dá)水平存在著同向變化的特點(diǎn)。ceRNA和相應(yīng)的miRNA之間表達(dá)部位是一致。在Hansen等研究circRNA時(shí)，由于神經(jīng)組織中含有豐富的miR-7，他們?cè)谛∈蟮呐咛ツX組織E13.5做了原位雜交染色，從形態(tài)學(xué)上觀察到了有基本重疊表達(dá)的神經(jīng)組織，提示了CDR1as和miR-7可能擁有類似的功能。3'UTR對(duì)ceRNA作用的影響ceRNA之間的相互調(diào)節(jié)作用是依賴于miRNA和3'UTR的，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)缺乏miRNA或3'UTR突變之后，該調(diào)節(jié)作用就不存在了。miRNA在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中起著核心的作用，任何彼此調(diào)控的ceRNA之間，都是通過miRNA池介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的，而miRNA主要通過與轉(zhuǎn)錄物的3'UTR的miRNA應(yīng)答元件互補(bǔ)配對(duì)來降低基因的表達(dá)。有研究表明，mRNA的翻譯可以限制miRNA的沉默功能，使miRNA結(jié)合位點(diǎn)限制于3'UTR內(nèi)。因此，不受翻譯活性干擾，可以高效結(jié)合miRNA的非編碼RNA更適合ceRNA理論的研究。ceRNA功能的鑒定ceRNA網(wǎng)絡(luò)的驗(yàn)證包括對(duì)miRNA與RNA之間和ceRNA之間相互作用的驗(yàn)證兩個(gè)方面。MiRNA與mRNA之間相互作用的鑒定(1)確認(rèn)miRNA與RNA之間存在物理上的結(jié)合Salmena等利用RIP技術(shù)(RNABindingProteinImmunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀)技術(shù)將miRNA和PTEN的3'UTR進(jìn)行共沉淀，然后用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)沉淀物中確實(shí)富含預(yù)測(cè)的miRNA。(2)確認(rèn)miRNA對(duì)靶RNA有抑制作用在細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miRNA，然后用RT-PCR、WesternBlot和熒光素酶報(bào)告法檢測(cè)miRNA對(duì)轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平及3'UTR活性的影響。由于miRNA可以通過Dicer酶使mRNA降解，也可直接阻礙翻譯過程，從這兩個(gè)水平進(jìn)行檢測(cè)可以具體分析其作用方式。此外，構(gòu)建靶點(diǎn)突變型的熒光素酶報(bào)告質(zhì)?？梢詸z測(cè)抑制作用是否是通過之前預(yù)測(cè)的MRE位點(diǎn)發(fā)生的。若靶RNA具有明確的生理活性，還可進(jìn)一步檢測(cè)其下游的信號(hào)通路、細(xì)胞特性的改變情況。如果能進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)，比如移植瘤實(shí)驗(yàn)或是使用轉(zhuǎn)基因小鼠，則更具有說服力。(3)確認(rèn)靶RNA對(duì)miRNA有抑制作用當(dāng)miRNA具有已證實(shí)的靶基因或生理功能時(shí)，可以據(jù)此進(jìn)行檢測(cè)。比如，miR-372能幫助細(xì)胞克服p21介導(dǎo)的細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)阻滯。Wang等人用HULC的抑制劑H89處理細(xì)胞后，檢測(cè)到細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)的加強(qiáng)，從而證明HULC能抑制miR-372的活性。以PTEN為例，當(dāng)PTEN的ceRNA表達(dá)上調(diào)在miRNA表達(dá)水平不變的前提之下，PTEN的表達(dá)水平上調(diào)從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，反之則會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Karreth等在動(dòng)物水平上也做了相應(yīng)的證明。當(dāng)ZEB2mRNA表達(dá)抑制時(shí)，PTEN的蛋白表達(dá)降低，從而激活了磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤生長速度增快；而ZEB2mRNA過表達(dá)時(shí)，PTEN蛋白表達(dá)升高，小鼠腫瘤生長速度減慢。目前對(duì)于ceRNA的研究基本都集中在腫瘤方向，近年來已有研究證實(shí)，ceRNA和前列腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤相關(guān)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。以肝癌為例，已發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)ceRNA調(diào)控作用。功能學(xué)驗(yàn)證ceRNA間的相互作用的鑒定與驗(yàn)證miRNA與RNA之間的相互作用類似，驗(yàn)證ceRNA的關(guān)系是通過檢測(cè)一種基因的RNA變化時(shí)，其它基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、翻譯產(chǎn)物、下游的信號(hào)通路及相關(guān)細(xì)胞或機(jī)體表型的改變情況。使用Drosha或Dicer突變型細(xì)胞可檢測(cè)其相互作用是否是通過miRNA介導(dǎo)的;而過表達(dá)mRNA的3'UTR區(qū)，或構(gòu)建其熒光素酶報(bào)告體可以驗(yàn)證相互作用是否發(fā)生在3'UTR區(qū);也可轉(zhuǎn)染MRE缺失的突變體以進(jìn)一步確認(rèn)作用位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是通過生化手段對(duì)預(yù)測(cè)的靶標(biāo)進(jìn)行核查，它雖然能大大提高預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度，但由于存在諸多的不可控因素，與實(shí)際情況還是有一定的偏差。在實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)需要合理選用細(xì)胞類型，并選用多種不同的細(xì)胞系。ceRNA調(diào)控機(jī)制的異?？蓪?dǎo)致癌癥和其他疾病的發(fā)生，為明確腫瘤的發(fā)生機(jī)理提供了新視角，與miRNA的相互競(jìng)爭(zhēng)作用也給腫瘤臨床治療帶來新方法。盡管ceRNA網(wǎng)絡(luò)工作的具體分子機(jī)制需要大量實(shí)驗(yàn)來證實(shí)，但目前以ceRNA方式檢測(cè)轉(zhuǎn)錄子上的MRE并識(shí)別相關(guān)性miRNA的新技術(shù)已成為現(xiàn)實(shí)。ceRNA的MRE可結(jié)合多種不同的miRNA。因此，ceRNA海綿體能調(diào)節(jié)多個(gè)miRNA的多種靶標(biāo)基因，其抑制miRNA的功能在臨床治療方面可能是一種理想的選擇。雖然miRNA海綿、ceRNA海綿在miRNA功能失活方面的研究為臨床治療提供了新思路，但如何消除脫靶效應(yīng)，以及進(jìn)一步評(píng)估兩者之間的潛在作用仍須深入探究。人們常常需要下調(diào)或上調(diào)miRNA和mRNA的表達(dá)，這里也有很多值得注意的地方。當(dāng)進(jìn)行過表達(dá)時(shí)，確定合適的過表達(dá)量很關(guān)鍵，既要足以產(chǎn)生明顯的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象又要考慮到避免超出細(xì)胞或機(jī)體的生理限度。研究表明，當(dāng)過表達(dá)特定的miRNA時(shí)，這些miRNA會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RISC，導(dǎo)致其他內(nèi)源miRNA不能與RISC結(jié)合而無法發(fā)揮其抑制基因表達(dá)的作用，導(dǎo)致它們靶基因表達(dá)量升高，從而可能干擾我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用siRNA等方法抑制基因表達(dá)時(shí)，除了要考察其干擾的效率還要注意避免產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，尤其是在研究基因與假基因間的相互作用時(shí)，由于二者序列同源性很高，對(duì)siRNA序列的優(yōu)化就顯得異常重要。ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建多數(shù)的研究主要集中在一個(gè)或幾個(gè)miRNA介導(dǎo)的一對(duì)ceRNA之間相互作用、影響的信號(hào)通路以及與疾病相關(guān)性的確證，但這只是整個(gè)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的幾個(gè)節(jié)點(diǎn)。人們希望從整體水平上了解ceRNA網(wǎng)絡(luò)，于是有研究者繪制出了不同條件下的ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖。簡(jiǎn)單的ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖可以通過總結(jié)已知的miRNA-mRNA作用情況得到。這種總結(jié)性的關(guān)系圖確實(shí)可以給人們帶來一定的啟發(fā)，不過它與完整的網(wǎng)絡(luò)圖之間還有很大的差距，而且只適用于人們研究較多的生理或病理過程。于是有研究者借助生物信息學(xué)手段繪制了更為龐大的ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖。Sumazin等用Hermes方法分析惡性膠質(zhì)瘤表達(dá)譜中任意兩個(gè)基因間所共有的miRNA組(commonmiRProgram)，然后以RNAs作為節(jié)點(diǎn)，以其mPR(miRprogrammediatedregulatory)交互作用繪制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中由miRNA組介導(dǎo)的大型RNA互作圖。除了這些特定疾病中的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，ceRNA數(shù)據(jù)庫也已經(jīng)出現(xiàn)。ceRDB是Aaronr等利用Targetscan數(shù)據(jù)構(gòu)建，只要輸入一個(gè)mRNA的名稱，就可以搜索到與其共有miRNA數(shù)量最多的前50個(gè)甚至前500個(gè)mRNA作為候選的ceRNA。starBasev2.0是中山大學(xué)的Yang等通過整合大量的芯片數(shù)據(jù)和腫瘤樣本，提供miRNA-lncRNA、miRNA-mRNA、ceRNAnetwork和蛋白-RNA等的相關(guān)性預(yù)測(cè)和基因功能分析。但它們的缺點(diǎn)是過分依賴miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件。目前各預(yù)測(cè)軟件都是根據(jù)已知的miRNA和靶基因間作用的規(guī)律性來設(shè)計(jì)算法，但其側(cè)重點(diǎn)有所不同，彼此之間預(yù)測(cè)結(jié)果的交集往往很小，甚至同一軟件的不同版本的預(yù)測(cè)結(jié)果也在不斷變化。此外，miRNA的多靶基因特性也與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)系，這是任何算法都難以預(yù)測(cè)的。從ceRNA的研究現(xiàn)狀來看，生物信息學(xué)已與各種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法占到了同等重要的地位。無論是靶標(biāo)的預(yù)測(cè)還是對(duì)基因的表達(dá)、功能和相互作用的分析都離不開相關(guān)的計(jì)算機(jī)軟件及數(shù)據(jù)庫。雖然目前各預(yù)測(cè)算法的準(zhǔn)確度和靈敏度還不高，ceRNA數(shù)據(jù)庫也在不斷完善中，但隨著ceRNA發(fā)現(xiàn)的增多，miRNA和靶基因作用機(jī)制的闡明，預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度也將進(jìn)一步提高，從而使生物學(xué)家能更有針對(duì)性關(guān)注特定的miRNA靶基因進(jìn)行研究。在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方面，由于ceRNA網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)高度復(fù)雜的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)周圍環(huán)境十分敏感，人們需要進(jìn)行嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，或是開發(fā)新的更有效的實(shí)驗(yàn)方法，只有這樣才能不斷減少人為因素的干擾并提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說服力。此外，結(jié)合基因本體(GO)分析、信號(hào)通路分析、相互作用組(Interactome)和蛋白質(zhì)組學(xué)，從不同角度全方面認(rèn)識(shí)ceRNA網(wǎng)絡(luò)，將帶給人們新的啟發(fā)。外泌體circRNA作為biomarkerIF：14.812肝癌細(xì)胞外泌體中的circRNA與相應(yīng)的線性RNA數(shù)量比例顯著高于肝癌細(xì)胞中的。為了驗(yàn)證circRNA和miRNA的關(guān)系，將miR-7轉(zhuǎn)入細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞及外泌體中CDR1as的水平，結(jié)果顯示外泌體中CDR1as的表達(dá)量顯著減少。健康人血清e(cuò)xosomes檢測(cè)到1215個(gè)circRNAs；qPCR結(jié)果顯示在RnaseR處理后circRNA表達(dá)量沒有發(fā)生顯著變化；室溫下放置24h表達(dá)量基本沒有變化。小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞exosomescircRNAMHCC-LM3(高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，提取腫瘤細(xì)胞exosomesrna進(jìn)行環(huán)狀RNAqRT-PCR檢驗(yàn)，humanCDYLcircRNA顯著差異表達(dá)，并且exo-circRNA豐度與成瘤大小呈正相關(guān)。結(jié)腸癌病人和正常人的血清外泌體circRNA有很大差別，與正常人相比，結(jié)腸癌病人有257newcircRNA。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，結(jié)腸癌血清中circ-KLDHC10表達(dá)顯著升高。exo-circRNA有望成為癌癥診斷biomarker案例3提取檢測(cè)：分別從缺氧(1%O2)或正常(20%O2)培養(yǎng)的OSCC(口腔鱗狀細(xì)胞癌)細(xì)胞培養(yǎng)基上清提取exo(外泌體)，掃描電鏡觀察形態(tài)，Westernblot檢測(cè)exomarkerCD63和CD81。

source：cellresearchIF：14.812缺氧腫瘤細(xì)胞分泌的exosome能影響正常腫瘤細(xì)胞嗎？給缺氧exosome(缺氧培養(yǎng)的細(xì)胞分泌的exo)添加熒光PKH67標(biāo)簽，孵育OSCC細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察顯示PKH67標(biāo)記的exosome(綠色)被OSCC細(xì)胞內(nèi)化吸收。缺氧exosome對(duì)OSCC細(xì)胞遷移和入侵有何作用？敲降細(xì)胞的HIF-1α或HIF-2α，提取exosome后孵育細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示缺氧exosome增強(qiáng)癌細(xì)胞遷移和入侵，但敲降后exosome不能。為什么缺氧exosome有此功能？或許是exosomalmiRNA起的作用方法：OSCC細(xì)胞株Cal-27正?；蛉毖跖囵B(yǎng)24h，從細(xì)胞培養(yǎng)基提取exo，提取總RNA，進(jìn)行miRNA測(cè)序。

通過測(cè)序得到了差異表達(dá)miRNA，下一步做什么？選擇差異顯著的miR-21作為接下來的研究對(duì)象，研究它與HIF-1α、HIF-2α的關(guān)系。敲降HIF-1α、HIF-2α，檢測(cè)cell、exosome中miR-21水平以及ChIP實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞、exosome表達(dá)miR-21，是通過HIF-1α、HIF-2α與miR-21HRE區(qū)結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。方法：敲降缺氧或正常細(xì)胞的miR-21，提取exosome后孵育細(xì)胞，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)；敲降HIF-1α、HIF-2α后再過表達(dá)miR-21，顯示miR-21是缺氧exosome誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、入侵所依賴的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法：將Cal-27細(xì)胞皮下注射到nu/nu小鼠，生成60mm3腫瘤。注射缺氧或正常exosome(10ug)到移植瘤中央，檢測(cè)各種指標(biāo)，顯示腫瘤exosome的miR-21誘導(dǎo)移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移。臨床樣本分析從OSCC病人血清提取exosome(OSCCexo)，檢測(cè)miR-21水平。非編碼RNA整合分析lncRNA、miRNA分別與mRNA可以通過靶向關(guān)系進(jìn)行關(guān)聯(lián)，lncRNA/circRNA與miRNA可以通過相互結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，mRNA和mRNA之間可以通過蛋白質(zhì)互作關(guān)系進(jìn)行關(guān)聯(lián)，從而可以形成ncRNA-mRNA-protein的互作網(wǎng)絡(luò)。

（1）mRNA-miRNA（2）mRNA-lncRNA（3）mRNA-lncRNA-miRNA（4）mRNA-miRNA-circRNA轉(zhuǎn)錄組整合分析競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）分析流程TotalRNAlncRNA測(cè)序miRNA測(cè)序circRNA測(cè)序miRNA/lncRNA/mRNA/circRNA標(biāo)準(zhǔn)分析關(guān)聯(lián)分析構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)差異表達(dá)的lncRNA/miRNA/circRNA/mRNA差異ncRNA靶基因與差異mRNA交集富集分析整合分析類型（1）mRNA-miRNA（2）mRNA-lncRNA

（3）mRNA-lncRNA-miRNA

將差異mRNA、差異lncRNA靶基因、差異miRNA靶基因取并集，對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG富集分析，還可與差異lncRNA、miRNA構(gòu)建共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。（4）mRNA-miRNA-circRNA

將差異mRNA、差異miRNA靶基因、差異circRNA靶基因取并集，對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG富集分析，還可與差異circRNA、miRNA構(gòu)建共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。案例1High-throughputdataintegrationofRNA–miRNA–circRNArevealsnovelinsightsintomechanismsofbenzo[a]pyrene-inducedcarcinogenicity研究目的：通過對(duì)mRNA，miRNA，circRNA整合分析，從而更深入的了解化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞致癌的機(jī)理。研究背景：本文作者已經(jīng)利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)苯并芘處理的HepG2細(xì)胞進(jìn)行了mRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄本的新亞型和可變剪切是由苯并芘刺激產(chǎn)生的，尤其是參與DNA損傷反應(yīng)和凋亡的基因（TP53,BCL2,XPA）。為深入了解致癌機(jī)制，作者又對(duì)其進(jìn)行mRNA、miRNA和circRNA測(cè)序，進(jìn)行整合分析。雜志：NucleicAcidsResIF：9.202發(fā)表時(shí)間：2015.03研究思路實(shí)驗(yàn)結(jié)果BaP刺激后的HepG2mRNA表達(dá)水平

通過測(cè)序在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)共找到1143個(gè)差異表達(dá)的mRNA，GO富集分析顯示基因在“細(xì)胞響應(yīng)（藥物、殺蟲劑、致癌物等）異型生物質(zhì)的刺激”term中顯著富集，因此證實(shí)HepG2的確能有效響應(yīng)苯并芘刺激。BaP刺激后的HepG2miRNA表達(dá)水平16個(gè)成熟的miRNA在整個(gè)BaP處理過程中被顯著地影響，但只有miR-181a-13p在整個(gè)處理過程中過表達(dá)。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)的5個(gè)成熟miRNA均是miR-181家族成員（(miR-181a-15p,miR-181a-25p,miR-181b-15p/3p，miR-181b-1）。有趣的是miR-181家族也被報(bào)道參與肝癌誘發(fā)機(jī)制。文獻(xiàn)解讀

文獻(xiàn)解讀circRNA預(yù)測(cè)

本研究結(jié)果顯示只有17個(gè)circRNA在所有的樣本中存在，其中有幾個(gè)circRNA在不同時(shí)間點(diǎn)是差異表達(dá)的，但是在整個(gè)處理過程中沒有表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)。文獻(xiàn)解讀整合分析：mir-181a,DNArepairgenes和circRNA

共有328個(gè)基因的3'UTR與miR-181a-13p種子序列互補(bǔ)，其中14個(gè)基因在受到BaP處理后差異表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的MGMT(O6-methylguanineDNAmethyltransferase)能防止DNA復(fù)制時(shí)發(fā)生突變或染色體變異，它主要在肝臟組織表達(dá)，先前報(bào)道顯示MGMT的消耗可增加致癌風(fēng)險(xiǎn)。MGMT在BaP處理的24h內(nèi)表達(dá)被抑制，可能一部分是由于miR-181a-13p對(duì)它進(jìn)行抑制或降解。在36h時(shí)表達(dá)量開始增加，可能是由于一些circRNA與miR-181a-13p結(jié)合，解除了對(duì)MGMT的抑制。文獻(xiàn)解讀文獻(xiàn)解讀案例2

樣本：來自50個(gè)病人膝關(guān)節(jié)的損傷軟骨與完整軟骨主要結(jié)果：損傷軟骨與完整軟骨比較，有107個(gè)lncRNA差異表達(dá)，51個(gè)上調(diào)，56個(gè)下調(diào)。其中TMSB4pseudogene,lncRNA-MSR顯著上調(diào)，在受到機(jī)械壓力時(shí)被激活。另外，lncRNA-MSR通過與miRNA-152競(jìng)爭(zhēng)來調(diào)節(jié)TMSB4的表達(dá)。發(fā)表時(shí)間：2016.06IF：6.938發(fā)表時(shí)間：2016.03IF：5.228新lncRNA-MSR顯著上調(diào)，其本體基因是TMSB4lncRNA測(cè)序mRNA測(cè)序正常軟骨損傷軟骨COL2A1、ACAN顯著下調(diào)，TMSB4、MMP13、ADAMTS5顯著上調(diào)篩選差異的lncRNAMSR敲除實(shí)驗(yàn)MSR過表達(dá)實(shí)驗(yàn)機(jī)械壓力實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)出與MSR/TMSB4均互補(bǔ)的miR-152，miR-217miR-152抑制MSR/TMSB4的表達(dá)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

lncRNA-MSR可作為ceRNA調(diào)節(jié)TMSB4的表達(dá)--軟件預(yù)測(cè)出2個(gè)miRNA（miR-152，miR-217）與MSR、TMSB4序列均互補(bǔ)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明MSR、TMSB4可被miR-152顯著抑制，而沒有受到miR-217的影響。另外，miR-152的過表達(dá)可抑制MSR、TMSB4的表達(dá)，相反地，miR-152被抑制后可增加MSR、TMSB4的表達(dá)。案例3--外顯子+轉(zhuǎn)錄組MutationsandalteredexpressionofSERPINF1inpatientswithfamilialotosclerosis

雜志：HumanMolecularGenetics影響因子：5.985發(fā)表日期：2016.03文章簡(jiǎn)介：作者對(duì)10個(gè)家族遺傳性耳硬化癥病人（來自4個(gè)家族）進(jìn)行外顯子測(cè)序，找到23個(gè)候選變異位點(diǎn)。另外又對(duì)84個(gè)病人和175個(gè)正常個(gè)體進(jìn)行sanger檢測(cè)，共有6個(gè)罕見雜合突變發(fā)生在SERPINF1基因上，3個(gè)為錯(cuò)義突變，3個(gè)發(fā)生在SERPINF1-012轉(zhuǎn)錄本的5-UTR區(qū)。RNA-seq分析表明SERPINF1-012是主要的轉(zhuǎn)錄本類型，5-UTR區(qū)的突變可影響轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量。外顯子+轉(zhuǎn)錄組通過外顯子測(cè)序和sanger驗(yàn)證，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)罕見雜合突變發(fā)生在SERPINF1基因上。軟件預(yù)測(cè)顯示c.167C>G,c.331G>A，c.392C>A突變?yōu)橛泻ψ儺悾溆嗳齻€(gè)對(duì)SERPINF1-001為非有害變異，并且位于SERPINF1-012轉(zhuǎn)錄本的5'-UTR區(qū)。外顯子+轉(zhuǎn)錄組

RNA-seq對(duì)SERPINF1每個(gè)外顯子上的reads數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)exons5–8的reads數(shù)量遠(yuǎn)大于exon1-4，說明SERPINF1-012是基因SERPINF1的主要轉(zhuǎn)錄本亞型。與對(duì)照組相比，耳硬化癥病人和SERPINF1-012的5‘-UTR區(qū)發(fā)生突變（c.601G>A）的病人組織中基因表達(dá)量均顯著降低，表明在SERPINF1-012的5‘-UTR區(qū)的突變會(huì)影響轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量。RT-qPCR證實(shí)SERPINF1-012的5’-UTR區(qū)發(fā)生突變導(dǎo)致其表達(dá)量降低。對(duì)野生型及5‘-UTR區(qū)突變的序列構(gòu)建熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，與野生型相比，c.440-40_440-38delTCG和c.441G>C熒光素酶活性顯著減小，說明這兩個(gè)位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致SERPINF1-012翻譯效率降低；而c.601G>A的突變使SERPINF1-012翻譯效率增加。案例4轉(zhuǎn)錄組+DNA甲基化研究目的：通過DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析以揭示急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制。分析內(nèi)容：DNA甲基化峰值的分布差異甲基化區(qū)域內(nèi)基因的篩選差異表達(dá)lncRNA的篩選關(guān)聯(lián)分析研究思路關(guān)聯(lián)分析19pre-BALLpatientsamples10NormalprecursorB-cellpopulations結(jié)果甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析顯示，在ALL病人中，62個(gè)基因（MTSS1,PAWR,EXT1）啟動(dòng)子的差異甲基化區(qū)域（DMRs）高度甲基化而基因表達(dá)下調(diào)，主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡；37個(gè)基因啟動(dòng)子DMRs呈現(xiàn)低甲基化而表達(dá)上調(diào)，主要參與GTP酶的激活和細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)。除了蛋白編碼基因外，差異甲基化還發(fā)生在