非編碼RNA研究方法及應(yīng)用之長(zhǎng)鏈非編碼RNA

非編碼RNA研究方法及應(yīng)用長(zhǎng)鏈非編碼RNA

長(zhǎng)度在200nt以上、不編碼蛋白、但參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程的RNA分子.人類(lèi)基因組計(jì)劃研究發(fā)現(xiàn)只有3%的基因組序列是編碼蛋白質(zhì)的基因，而占人基因組62%的序列轉(zhuǎn)錄為lncRNA，這一結(jié)論提示非編碼區(qū)域可能通過(guò)表達(dá)lncRNA，活躍地參與到生物學(xué)功能的調(diào)控中.截至目前，在NONCODE中已經(jīng)收錄了73370個(gè)lncRNA，它們分別來(lái)自1239個(gè)物種，僅有不到200個(gè)進(jìn)行了功能注釋?zhuān)祟?lèi)對(duì)lncRNA的研究還知之甚少.隨著對(duì)lncRNA在哺乳動(dòng)物進(jìn)化及人類(lèi)疾病發(fā)生發(fā)展中作用的日益關(guān)注，lncRNA調(diào)控機(jī)制已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的新熱點(diǎn).1)在編碼蛋白基因的上游啟動(dòng)子區(qū)(橘色)轉(zhuǎn)錄，從而干擾鄰近蛋白編碼基因(藍(lán)色)的表達(dá)(如酵母SER3基因);2)抑制RNA聚合酶Ⅱ,或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾，而影響基因(藍(lán)色)表達(dá)；3)lncRNA(紫色)與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，進(jìn)而產(chǎn)生不同的剪切形式；4)lncRNA(紫色)與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA,調(diào)控基因的表達(dá)水平；5)lncRNA(綠色)結(jié)合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6)作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7)結(jié)合在特定蛋白上從而改變?cè)摰鞍椎陌|(zhì)定位；8)可作為小分子RNA(如miRNA)的前體分子。Signalarchetype（信號(hào)原型）：作為轉(zhuǎn)錄活性的分子信號(hào)或指示劑。Decoyarchetype（誘餌原型）：與其他調(diào)控RNA或蛋白結(jié)合并隔離。Guidearchetype（指導(dǎo)原型）：指導(dǎo)核糖核蛋白復(fù)合物定位到特定目標(biāo)。Scaffoldarchetype（支架原型）：作為相關(guān)分子元件（蛋白和/或RNA）組裝的平臺(tái)。

LncRNA的分類(lèi)lncRNA命名指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)

每一條lncRNA的名字應(yīng)具有唯一性

.lncRNA的名字應(yīng)是描述基因的縮寫(xiě).lncRNA名字僅由拉丁字母和阿拉伯?dāng)?shù)字組成

.lncRNA的名字中不應(yīng)涉及具體的物種類(lèi)型

.lncRNA的標(biāo)識(shí)應(yīng)避免采用一些常用的詞匯.lncRNA的標(biāo)識(shí)應(yīng)盡可能的反映其功能

.功能性轉(zhuǎn)錄假基因應(yīng)包含它們假基因的名字.首先，每條lncRNA的名字應(yīng)具有唯一性，不能發(fā)生一個(gè)基因幾個(gè)名字或存在重名的現(xiàn)象。因而，作者在發(fā)表新lncRNA時(shí)，可先獲取HGNC的認(rèn)可，如果作者發(fā)布的名字已在其他地方使用過(guò)，HGNC將會(huì)指定一個(gè)新名字供作者選擇。lncRNA的名字應(yīng)是描述基因的縮寫(xiě)，便于人們理解名字的含義。如BANCR就是BRAF-activatednon-proteincodingRNA的縮寫(xiě)。lncRNA的名字應(yīng)僅由拉丁字母和阿拉伯?dāng)?shù)字組成，不應(yīng)出現(xiàn)標(biāo)點(diǎn)符號(hào)。連字符僅在特殊場(chǎng)合使用，如：反義編碼蛋白基因可在標(biāo)識(shí)中加連字符（BACE1-AS就是BACE1antisenseRNA的名字）。lncRNA的名字中的字母應(yīng)為大寫(xiě)，為了與其它種類(lèi)物種的基因區(qū)別開(kāi)來(lái)（如嚙齒動(dòng)物基因的標(biāo)識(shí)只要求首字母大寫(xiě)，其余小寫(xiě)），人類(lèi)基因標(biāo)識(shí)中的字母都應(yīng)為大寫(xiě)，例如HOTAIR基因，在人類(lèi)中叫HOTAIR，而在老鼠中寫(xiě)成Hotair。lncRNA的名字中不應(yīng)涉及具體的物種類(lèi)型，例如：如果基因名字中有H/h（代表人類(lèi)），由于牽涉到同源基因的問(wèn)題，就會(huì)造成一些疑惑和誤導(dǎo)。lncRNA的命名應(yīng)避免采用一些常用的詞匯，否則會(huì)給分析研究帶來(lái)很多問(wèn)題，比如：“AIRN”基因最初公布時(shí)叫“AIR”，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索可得到22萬(wàn)條不相關(guān)的信息，而搜索“AIRN”則只有10條信息。lncRNA的命名應(yīng)盡可能的反映其功能，如XIST基因是“X(inactive)-specifictranscript”的縮寫(xiě)，該基因的作用是參與沉默一對(duì)X染色體的轉(zhuǎn)錄。命名的時(shí)候盡量反映基因通常的功能，而不體現(xiàn)其突變表型。其命名應(yīng)簡(jiǎn)潔明了，不應(yīng)包含以下信息：*具有攻擊或輕蔑的色彩。*具有個(gè)人及地方色彩。*含有神化，虛構(gòu)或歷史人物的名字。*含有“臆想”和沒(méi)什么意義的信息。功能性轉(zhuǎn)錄假基因在命名時(shí)應(yīng)保留它們假基因名稱(chēng)且不應(yīng)改變其基于功能的名稱(chēng)。為了方便搜索，這個(gè)功能應(yīng)加在名字的最后。eg:PTENP1是“phosphataseandtensinhomologpseudogene1(functional)”.而對(duì)于未知功能的lncRNA應(yīng)依據(jù)基因組上下文來(lái)命名，下圖則給出了系統(tǒng)化的命名的規(guī)則。如果有一個(gè)很接近的蛋白編碼基因，lncRNA的名字應(yīng)該以這個(gè)編碼基因名字開(kāi)始，再加后綴即可。后綴的分類(lèi)：反義（antisense，AS），eg:BACE1-AS；內(nèi)含子(intronic，IT），eg:SPRY4-IT1；重疊（overlapping，OT），eg:OSX2-OT；長(zhǎng)鏈基因間lncRNA（LongintergeniclncRNAs，lincRNAs），以LINC為前綴，數(shù)字為后綴，eg:LINC00485。此外，有些lncRNA與編碼基因是頭碰頭（headtohead），可推斷它們擁有雙向啟動(dòng)子，HGNC推薦將其命名為反義上游（Antisenseupstream，AU），例如，GENE2-AU1。lncRNA特征通常較長(zhǎng)，具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)剪接，具有polyA尾巴與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，分化過(guò)程中有動(dòng)態(tài)的表達(dá)與不同的剪接方方式.啟動(dòng)子同樣可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，如Oct3/4，Nanog,CREB,Sp1,c-myc,Sox2與p53，局部染色質(zhì)組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結(jié)構(gòu)特征.大多數(shù)的lncRNAs在組織分化發(fā)育過(guò)程中，都具有明顯的時(shí)空表達(dá)特異性.在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達(dá)方式.序列上保守性較低，只有約12%的lncRNA可在人類(lèi)之外的其它生物中找到.

LncRNA在生物體內(nèi)的功能

生物學(xué)功能：與表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、miRNA調(diào)控、細(xì)胞分化及發(fā)育等密切相關(guān)；應(yīng)急功能：可作為細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)招募蛋白形成復(fù)合物參與免疫反應(yīng)和宿主防御。LncRNA與疾?。号c人類(lèi)許多疾病，尤其是與衰老相關(guān)疾病有密切關(guān)系，例如心血管疾病、阿爾茲海默癥、糖尿病、癌癥等.LncRNA未來(lái)能否作為分子靶標(biāo)成功應(yīng)用于臨床診斷和癌癥治療，是發(fā)展的難點(diǎn)與熱點(diǎn).lncRNA表達(dá)特異性LncRNA與臨床疾病的關(guān)系大量研究表明，lncRNA從轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平參與蛋白質(zhì)編碼基因調(diào)控，其中包括發(fā)育相關(guān)基因及疾病發(fā)生相關(guān)基因。通過(guò)參與調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因，lncRNA既能影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也能影響生物體發(fā)育過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。lncRNA（ATXN80S)在RNA水平上參與8型脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)證的（spinocerebellarataxiatype8,SCA8)的發(fā)生。LncRNA失調(diào)有望成為人類(lèi)復(fù)雜性疾病發(fā)病的主要原因。

LncRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控LncRNA可從染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后加工等多種層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控LncRNA的順式和反式調(diào)控作用1.LncRNA篩選通過(guò)lncRNA芯片或RNA測(cè)序等方法對(duì)多對(duì)疾病模型和對(duì)照樣本組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析;通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選出具有表達(dá)差異的lncRNA，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)lncRNA的靶基因;通過(guò)PCR或NorthernBlot技術(shù)對(duì)候選lncRNA驗(yàn)證，確定其表達(dá)差異。2.LncRNA全長(zhǎng)克隆可以通過(guò)5'RACE獲取lncRNA5'全長(zhǎng)，3'RACE獲取lncRNA3'全長(zhǎng)，最終拿到完整的lncRNA序列。3.

表達(dá)分析細(xì)胞水平表達(dá)：在細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)表達(dá)差異。組織分布：檢測(cè)不同組織、不同階段表達(dá)特性。表達(dá)水平動(dòng)力學(xué)變化：比較不同處理?xiàng)l件下，如藥物處理、誘導(dǎo)處理下，表達(dá)水平差異。LncRNA的一般研究策略

4.功能研究功能獲得性研究：構(gòu)建lncRNA過(guò)表達(dá)載體。原則上是將全長(zhǎng)lncRNA定向克隆到表達(dá)載體上實(shí)現(xiàn)lncRNA的過(guò)表達(dá)。然而有些lncRNA很大或全長(zhǎng)尚未分離，這時(shí)將視lncRNA在基因組上的定位采取不同的研究策略。功能缺失性研究：可通過(guò)siRNA、shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA，干預(yù)lncRNA后檢測(cè)其對(duì)疾病相關(guān)基因表達(dá)影響和對(duì)細(xì)胞表型如增值、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等的影響?？赏ㄟ^(guò)RNApulldown、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法檢測(cè)與lncRNA結(jié)合的DNA、RNA、蛋白質(zhì)。采用lncRNA芯片分析技術(shù)結(jié)合mRNA對(duì)lncRNA功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，研究lncRNAtrans和cis作用機(jī)制。lncRNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程采用配體指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)，設(shè)計(jì)一種RNA配體，與癌癥相關(guān)的lincRNA結(jié)合達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。采用快速預(yù)測(cè)RNA與蛋白質(zhì)相互作用與結(jié)構(gòu)域（catRAPID）在線算法來(lái)預(yù)測(cè)RNA與蛋白質(zhì)的相互作用，該算法根據(jù)RNA和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、氫鍵和分子作用力來(lái)評(píng)估它們之間的相互作用的傾向。采用非編碼RNA沉默和定位分析（c-KLAN）技術(shù)對(duì)lncRNA進(jìn)行功能缺失（Loss-of-function）研究和細(xì)胞定位，該技術(shù)是在基于核糖核酸內(nèi)切酶制備的小干擾RNA（esiRNA）和熒光原位雜交（FISH）2種現(xiàn)有研究方法的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。5.表達(dá)調(diào)控：將lncRNA表達(dá)與其他領(lǐng)域相結(jié)合，解釋lncRNA調(diào)控機(jī)理。DNA甲基化：可通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)基因甲基化差異與lncRNA結(jié)合分析。轉(zhuǎn)錄因子：研究lncRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。染色質(zhì)重塑：lncRNA表觀調(diào)控。ceRNA機(jī)制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之間的調(diào)控機(jī)制。內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA（competingendogenousRNAs，ceRNA）揭示了一種RNA間相互作用的新機(jī)制。已知miRNA可以通過(guò)結(jié)合mRNA導(dǎo)致基因沉默，而ceRNA可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miRNA來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。ceRNA可以結(jié)合miRNA響應(yīng)元件（microRNAresponseelements，MREs)影響miRNA導(dǎo)致的基因沉默。LncRNA的一般研究實(shí)驗(yàn)手段

與蛋白質(zhì)的相互作用識(shí)別lncRNA的蛋白質(zhì)伙伴，可以為它們的功能的機(jī)制和路徑提高線索。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNABindingProteinImmunoprecipitation，RIP）技術(shù)，如chemical-cross-linkedRIP、nativeRIP(nRIP)、UV-crosslinkedimmunoprecipitation(CLIP)等通過(guò)使用抗體來(lái)pulldown核蛋白復(fù)合物，然后從中分離相關(guān)RNA用于分析。每個(gè)變體都有它各自優(yōu)勢(shì)和缺陷。nRIP提供交聯(lián)產(chǎn)物，而CLIP在避免交聯(lián)產(chǎn)物的重新組合的同時(shí)用于識(shí)別RNA與蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)。這些技術(shù)可以結(jié)合高通量測(cè)序，如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq，來(lái)識(shí)別lncRNA相互作用的全部宿主蛋白質(zhì)因子，盡管還需要技術(shù)手段的確認(rèn)。與DNA的相互作用

以染色體免疫共沉淀(ChIP)和RIP技術(shù)的原理為基礎(chǔ)，使用染色體RNA免疫共沉淀(ChRIP)來(lái)識(shí)別與特殊染色體標(biāo)簽相互作用的RNA。另一方面，chromatinoligo-affinityprecipitation(ChOP)、chromatinisolationbyRNApurification(ChIRP)、capturehybridizationofRNAtargets(CHART)使用標(biāo)記的互補(bǔ)寡核苷酸來(lái)識(shí)別與目的RNA相互作用的DNA位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)特征

lncRNA可以形成特殊的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)執(zhí)行它們的功能。通過(guò)selective2’-hydroxylacylationanalyzedbyprimerextension(SHAPE)和in-lineprobing來(lái)獲得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析，如SHAPE-Seq，連接其它依賴于RNA酶消化的技術(shù)，如fragmentationsequencing(FragSeq)和parallelanalysisofRNAstructure.

疾病相關(guān)LncRNA研究思路生物標(biāo)記物篩選（組織樣本）LncRNA芯片在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域的應(yīng)用利用LncRNA芯片揭示TSA治療肝癌的機(jī)制ceRNA機(jī)制揭秘lncRNA促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制

miRNA與lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用機(jī)制（