第六章種子擴(kuò)培

第六章種子擴(kuò)大培養(yǎng)

一、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)和目的

1、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)，不但要得到純而壯的培養(yǎng)物，還要獲得活力旺盛的、性能穩(wěn)定、接種數(shù)量足夠的、純的培養(yǎng)物。2、種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)扁平或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。

3、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的

為發(fā)酵罐的投料提供足夠數(shù)量的代謝旺盛的種子。因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間的長短和接種量的大小有關(guān)，接種量大，發(fā)酵時(shí)間則短。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，就有利于縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵罐的利用率，并且也有利于減少染菌的機(jī)會(huì)。

對(duì)于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過程來說，必須根據(jù)菌種生長繁殖速度快慢及生產(chǎn)的規(guī)模決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級(jí)數(shù)。4、種子標(biāo)準(zhǔn)菌種細(xì)胞生長活力強(qiáng)，遲緩期短生理性狀穩(wěn)定能滿足大發(fā)酵罐要求無雜菌污染保證穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。種子擴(kuò)大流程圖

二、種子擴(kuò)大培養(yǎng)(制備)階段實(shí)驗(yàn)室種子的制備：生產(chǎn)車間種子制備:

A

實(shí)驗(yàn)室種子的制備：

e.g產(chǎn)黃青霉菌(P.chrysogonum)原始菌種斜面試管獲得孢子250ml茄子瓶（大米或小米）25~28℃，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存）。

對(duì)于不產(chǎn)孢子的赤霉素生產(chǎn)菌，也可用大米固體培養(yǎng)基在茄子瓶中培養(yǎng)菌絲體，用作種子罐種子。產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌，產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌，可以用搖瓶液體培養(yǎng)法，孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖床上培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。不產(chǎn)孢子的細(xì)菌，如生產(chǎn)谷氨酸的棒狀桿菌、短桿菌，生產(chǎn)上一般采用斜面營養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)培，再轉(zhuǎn)入液體搖瓶培養(yǎng)，獲得細(xì)胞懸液再接種。e.g.Glutamicacid-producer：（谷氨酸生產(chǎn)菌）原始菌種（出發(fā)菌種）固體試管斜面（32°C，18~24小時(shí)）

三角瓶培養(yǎng)（搖床）

種子罐培養(yǎng)e.g.yeast：原始菌種（出發(fā)菌種）10ml麥汁試管250ml三角瓶培養(yǎng)（27°C~28°C，3天）（25°C，2天）5~10L卡氏罐（15°C~20°C，3~5天）B：生產(chǎn)車間種子制備：

種子罐的作用：使有限數(shù)量的孢子(菌體)發(fā)芽、生長、并繁殖成大量的菌絲體(菌體)，滿足發(fā)酵罐的需要（菌體生長和產(chǎn)物形成）。實(shí)驗(yàn)室種子進(jìn)入種子罐有孢子進(jìn)罐法和搖瓶菌種進(jìn)罐法。

種子罐級(jí)數(shù)的確定：種子罐級(jí)數(shù)是指制備種子逐級(jí)擴(kuò)培的次數(shù)。依據(jù)：菌種生長特性，孢子發(fā)芽及菌體繁殖的速度以及所用的發(fā)酵罐的容積。種子罐(seedingtank)的級(jí)數(shù)產(chǎn)物的品種生產(chǎn)規(guī)模工藝條件

種子罐級(jí)數(shù)越少越好，原因：

簡化生產(chǎn)工藝和控制減少接種帶來的染菌機(jī)會(huì)需考慮：盡量延長發(fā)酵罐生產(chǎn)產(chǎn)物的時(shí)間，縮短由于種子發(fā)芽、生產(chǎn)而占用的非生產(chǎn)時(shí)間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率［產(chǎn)物／ml·h］。e.g.Glutamatefermentation一級(jí)種子擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)室種子種子罐發(fā)酵罐e.g.penicillinfermentation二級(jí)種子擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)室種子一級(jí)種子罐二級(jí)種子罐發(fā)酵罐e.g.Streptomycinfermentation三級(jí)種子擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)室種子一級(jí)種子罐二級(jí)種子罐三級(jí)種子罐發(fā)酵罐

(Streptomycesgriseus)－－灰色鏈霉菌

種齡與接種量：

種齡(seedage)指種子罐培養(yǎng)種子從開始至結(jié)束的培養(yǎng)時(shí)間。

過老：生產(chǎn)能力下降，菌體自溶。

過嫩：前期生長緩慢，發(fā)酵周期延長，產(chǎn)物形成時(shí)間推遲，甚至造成異常發(fā)酵。

適宜時(shí)間：以菌體處于生命力極為旺盛的對(duì)數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達(dá)到最高峰時(shí)，較為適宜。嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，培養(yǎng)12小時(shí)接種，酶活最高。

接種量:指移入的種子的體積和接種后培養(yǎng)液的體積比。

接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度。

種子多，種子液中含有大量的胞外水解酶，有利于對(duì)基質(zhì)的利用。生產(chǎn)菌迅速占據(jù)了整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，減少染菌機(jī)會(huì)。但種子過多，易使菌體（菌絲體）生長過快，培養(yǎng)液粘度增加，溶氧降低，產(chǎn)物合成受影響。

e.g.嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶接種1%，酶活最高；1.5%~4%影響不大；大于4%，酶產(chǎn)量明顯下降。

制霉菌素生產(chǎn)中，1%比10%效果好，0.1%與1%效果相當(dāng)。

發(fā)酵生產(chǎn)的趨勢(shì)：采取大接種量及豐富培養(yǎng)基。如谷氨酸：大接種量20%。有的采用雙種法增大接種量：兩只種子罐一只發(fā)酵罐如卡那霉素：雙種比單種的發(fā)酵單位提高8%，到達(dá)產(chǎn)量高峰的時(shí)間提前。

倒種法：將培養(yǎng)適宜的發(fā)酵液倒出適量給另一個(gè)發(fā)酵罐作為種子。如鏈霉素：倒種法比單種法的發(fā)酵單位提高12%。

三、影響種子質(zhì)量的因素

1、原材料質(zhì)量：如四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中配制孢子培養(yǎng)基的麩皮、霉菌用的大（?。┟?、瓊脂的牌號(hào)的不同、蛋白胨加工原料不同等均影響種子的質(zhì)量。原料質(zhì)量的波動(dòng)，起主要作用的是其中的無機(jī)鹽含量的不同，如微量元素Mg++、Ca++、Ba++能刺激孢子的形成。P含量的多少也影響種子的質(zhì)量。氨基酸發(fā)酵中，淀粉水解糖制備后，加入其他的營養(yǎng)物（麩皮水解液、豆餅水解液、玉米漿），也對(duì)種子質(zhì)量多少有些影響。一般情況：培養(yǎng)基糖分要少，氮源要多，無機(jī)鹽所占的比例要大。種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分趨于一致也有好處，種子很快適應(yīng)，但各成分的數(shù)量根據(jù)目的各自確定。

總之，各成分選擇得當(dāng)，才能發(fā)揮菌種的特征，提高產(chǎn)量。

2、培養(yǎng)條件：

溫度、pH值、濕度、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間等都影響種子質(zhì)量。溫度：影響孢子質(zhì)量濕度：對(duì)孢子的數(shù)量和質(zhì)量影響很大。

如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂霉菌的孢子，在北方干燥地區(qū)孢子斜面長的快，在含少量水分的試管斜面培養(yǎng)基中下部孢子長的好，而上部孢子稀少；氣溫高，濕度大的地區(qū)，斜面孢子長的慢，試管下部冷凝水多而不利于孢子形成。

一般相對(duì)濕度40~45%時(shí)孢子數(shù)量最多，孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。通氣量：提高種子質(zhì)量，如青霉素發(fā)酵，一級(jí)種子通氣1：3，二級(jí)種子1：1.1-1.5，否則菌絲結(jié)團(tuán)，影響種子質(zhì)量。冷藏時(shí)間：如土霉素菌種孢子斜面培養(yǎng)四天左右，即于4℃冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體自溶，而培養(yǎng)五天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。鏈霉素生產(chǎn)菌，斜面孢子在6℃冷藏兩個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月降低8%。

四、種子質(zhì)量的控制措施

必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性；提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境條件，保證無雜菌侵入。

1、菌種穩(wěn)定性的檢查：少量菌種--無菌生理鹽水--遞增稀釋--平板劃線培養(yǎng)。挑出形態(tài)整齊，孢子豐滿的菌落進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定其生產(chǎn)能力。

2、無菌檢查：顯微鏡觀察、種子液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、生化分析。種子液平板劃線、斜面培養(yǎng)用肉眼觀察是否有異常菌落、異?，F(xiàn)象及鏡檢是否有雜菌。五、種子質(zhì)量的判斷：考察種子在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。感官判斷：看顏色、聞氣味理化指標(biāo)測(cè)定：1、pH值2、培養(yǎng)基滅菌后的糖、氨基氮3、菌體形態(tài)、濃度4、產(chǎn)物量5、殘?zhí)菨舛?、酶活力（如土霉素生產(chǎn)，淀粉酶的活力與發(fā)酵單位有一定的關(guān)系）。六、工業(yè)微生物培養(yǎng)的類型

靜置培養(yǎng)法：即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，也稱為嫌氣性培養(yǎng)。

通氣培養(yǎng)法：生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發(fā)酵，也稱為好氣性培養(yǎng)。

1、表面培養(yǎng)法（surfaceculturing)：

好氧靜置培養(yǎng)法。針對(duì)容器內(nèi)培養(yǎng)基物形態(tài)又分為液態(tài)表面培養(yǎng)和固體表面培養(yǎng)。這種方法菌的生長速度與培養(yǎng)基的深度有關(guān)，單位體積的表面積越大，生長速度越快。

2、固體培養(yǎng)（發(fā)酵）法(solidculturing)：

固體培養(yǎng)又分為淺盤(shallowpan)固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)，統(tǒng)稱曲法培養(yǎng)。它起源于我國釀造生產(chǎn)特有的傳統(tǒng)制曲技術(shù)。其最大特點(diǎn)是固體曲的酶活力高。

3、液體深層培養(yǎng)（發(fā)酵）法：(liquidsubmerged

culturing)

液體深層發(fā)酵法從罐底部通氣，進(jìn)入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解。這種由罐的底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對(duì)于由氣液界面靠自然擴(kuò)散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來講，稱為深層培養(yǎng)法。液體曲(liquidkoji)、檸檬酸、谷氨酸、肌苷酸(inosinicacid)及其他發(fā)酵產(chǎn)品先后采用此法進(jìn)行生產(chǎn)。

特點(diǎn)：容易按照生產(chǎn)菌種對(duì)于代謝的營養(yǎng)要求以及不同生理時(shí)期的通氣、攪拌、溫度、培養(yǎng)基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養(yǎng)條件。外循環(huán)帶升式發(fā)酵罐

內(nèi)循環(huán)帶升式發(fā)酵罐

小型機(jī)械攪拌發(fā)酵罐1—三角皮帶轉(zhuǎn)軸；2—軸承支架；3—聯(lián)軸節(jié)；4—軸封；5—窺鏡；6—取樣口；7—冷卻水出口；8—夾套；9—螺旋片；10—溫度計(jì)接口；11—軸；12—攪拌器；13—底軸承；14—放料口；15—冷水進(jìn)口；16—通風(fēng)管；17—熱電偶接口；18—擋板；19—接壓力表；20—手孔；21—電動(dòng)機(jī)；22—排氣口；23—取樣口；24—進(jìn)料口；25—壓力表接口；26—窺鏡；