GB/T 18448.2-2008實驗動物弓形蟲檢測方法

犐犆犛６５．０２０．３０

犅４４

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

犌犅／犜１８４４８．２—２００８

代替ＧＢ／Ｔ１８４４８．２—２００１

實驗動物弓形蟲檢測方法

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２００８１２０３發(fā)布２００９０３０１實施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局

發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會

書

犌犅／犜１８４４８．２—２００８

前言

ＧＢ／Ｔ１８４４８《實驗動物》由１０項實驗動物寄生蟲檢測方法組成。

本部分為ＧＢ／Ｔ１８４４８的第２部分《實驗動物弓形蟲檢測方法》。

本部分自實施之日起代替ＧＢ／Ｔ１８４４８．２—２００１。

本部分與ＧＢ／Ｔ１８４４８．２—２００１相比主要技術(shù)差異如下：

ａ）增加弓形蟲酶聯(lián)免疫吸附試驗（ＥＬＩＳＡ）和免疫酶染色試驗（ＩＥＡ），將ＰＣＲ檢測方法列入附錄

內(nèi)容，保留間接血凝試驗（ＩＨＡ）作為推薦方法之一；

ｂ）將檢測方法所需的“材料與試劑”和“檢測步驟”分別敘述。

本部分附錄Ａ是規(guī)范性附錄。

本部分由全國實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會提出并歸口。

本部分起草單位：全國實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會。

本部分主要起草人：潘振業(yè)、屈霞琴、陳俏梅、李冠民、王彥平。

本部分所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：

———ＧＢ／Ｔ１４９２６．３４—１９９４，ＧＢ／Ｔ１８４４８．２—２００１。

Ⅰ

書

犌犅／犜１８４４８．２—２００８

實驗動物弓形蟲檢測方法

１范圍

ＧＢ／Ｔ１８４４８的本部分規(guī)定了實驗動物弓形蟲的檢測方法和試劑等。

本部分適用于小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬及猴等實驗動物弓形蟲的檢測。

２原理

根據(jù)免疫學(xué)原理，采用弓形蟲抗原檢測被檢動物血清中的弓形蟲抗體。

３主要試劑和器材

３．１試劑

３．１．１ＥＬＩＳＡ抗原

３．１．１．１特異性抗原

弓形蟲（ＲＨ株）速殖子腹腔接種清潔級以上實驗小鼠（ＫＭ、ＩＣＲ、ＢＡＬＢ／ｃ等均可），３ｄ～５ｄ后，以

無菌生理鹽水灌洗被接種小鼠的腹腔，收集含有蟲體的小鼠腹腔液，３０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取沉淀，

ＰＢＳ洗３次。沉淀物加適量蒸餾水反復(fù)凍融５次，或用超聲波處理后，１００００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｍｉｎ，取上

清液。上清液用葡聚糖凝膠Ｇ２００進(jìn)行純化（柱內(nèi)徑×柱高：１．５ｃｍ×６０ｃｍ），流速為０．２ｍＬ／ｍｉｎ。每

管收集２ｍＬ左右。共收集６０管以上。分別測定每個收集管中蛋白在２８０ｎｍ下的吸光度值。分離純

化后，出現(xiàn)２個蛋白峰；將第一峰各管合并，即為弓形蟲特異性抗原（也稱弓形蟲可溶性抗原）。

３．１．１．２正常抗原

以無菌生理鹽水注射清潔級以上實驗小鼠（與制備抗原的小鼠同品種或品系）腹腔，３ｄ～５ｄ后，以

無菌生理鹽水灌洗被注射小鼠腹腔，收集小鼠腹腔液，３０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取沉淀，ＰＢＳ洗３次。

沉淀物加適量蒸餾水反復(fù)凍融５次，或用超聲波處理后，１００００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｍｉｎ，取上清液，即為正常

抗原。

３．１．２抗原片

弓形蟲ＲＨ株速殖子腹腔接種清潔級以上實驗小鼠（ＫＭ、ＩＣＲ、ＢＡＬＢ／ｃ等均可），３ｄ～５ｄ后處

死，收取蟲體，胰酶消化，以一定濃度涂片，充分晾干后冷丙酮固定，－２０℃保存。

３．１．３弓形蟲抗原致敏綿羊紅細(xì)胞

將綿羊紅細(xì)胞與一定濃度的鞣酸液反應(yīng)，制成鞣化紅細(xì)胞，然后，用弓形蟲可溶性抗原在適宜的條

件下致敏鞣化紅細(xì)胞，制成弓形蟲抗原致敏綿羊紅細(xì)胞。

３．１．４正常對照綿羊紅細(xì)胞。

３．１．５陽性對照血清

自然感染弓形蟲的相應(yīng)動物抗體陽性血清，或弓形蟲免疫血清。

３．１．６陰性對照血清

確證無弓形蟲感染的動物血清。

３．１．７酶結(jié)合物

辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬和猴ＩｇＧ