檢本熒光免疫技術(shù)

熒光免疫技術(shù)教學(xué)目的要求：掌握免疫熒光顯微鏡技術(shù)掌握時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)了解熒光免疫測(cè)定的臨床應(yīng)用1、概述

熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來(lái)的一種方法，是免疫標(biāo)記技術(shù)中發(fā)展最早的一種檢測(cè)方法。

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列新的儀器和技術(shù)問(wèn)世，使熒光技術(shù)不斷完善，已從原來(lái)僅限于檢測(cè)固定標(biāo)本，如檢測(cè)組織切片或細(xì)胞表面的抗原，擴(kuò)大到進(jìn)行活細(xì)胞分類檢測(cè)及多種成分定量檢測(cè)。熒光技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)和科學(xué)研究。2、技術(shù)分類：⑴熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))

抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。⑵免疫熒光測(cè)定技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法第一節(jié)熒光免疫技術(shù)的特點(diǎn)熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來(lái)處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光（fluorescence）。一、熒光的基本知識(shí)（一）發(fā)射光譜指固定激發(fā)波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下所記錄到的樣品發(fā)射熒光的相對(duì)強(qiáng)度。（二）激發(fā)光譜指固定檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)，用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)樣品所記錄到的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。（三）熒光的效率：熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率熒光效率﹦發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）（四）熒光壽命熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用的時(shí)間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。（五）熒光的淬滅

熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退成為熒光淬滅。例如紫外線照射、高溫、苯胺、硝基苯、酚、I-等。（六）熒光偏振二、熒光物質(zhì)第二節(jié)熒光抗體的制備一、抗體要求二、熒光素要求三、熒光素標(biāo)記抗體的方法四、熒光素標(biāo)記抗體的純化五、熒光抗體的鑒定六、熒光抗體的保存第三節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)免疫熒光顯微技術(shù)的基本原理是：熒光抗體可與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見(jiàn)明亮的特異熒光，即可對(duì)標(biāo)本中的抗原物質(zhì)進(jìn)行鑒定。一、標(biāo)本的制作熒光顯微技術(shù)主要是靠觀察切片標(biāo)本上熒光抗體的染色結(jié)果來(lái)對(duì)抗原進(jìn)行鑒定和定位。因此，標(biāo)本制作的好壞直接影響到檢測(cè)結(jié)果。常見(jiàn)的臨床標(biāo)本有：組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，可分別制成切片、印片和涂片。組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織

涂片：各種體液、穿刺液、細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)胞懸液培養(yǎng)細(xì)胞：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)細(xì)胞（人喉癌上皮細(xì)胞HEP-2)標(biāo)本的固定和保存：固定劑：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：4℃、-20℃二、熒光抗體染色與結(jié)果判斷于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體置25-37℃

30min或4℃過(guò)夜用PBS充分洗滌鏡檢。試驗(yàn)類型

1直接法

2間接法

3雙標(biāo)記法兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色。返回?zé)晒饪贵w染色結(jié)果判斷

設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照

區(qū)分特異和非特異染色

陽(yáng)性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型

抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)抗核抗體(核膜型)

“-”：無(wú)或僅見(jiàn)極微弱熒光。

“+”：熒光較弱但清楚可見(jiàn)。“++”：熒光明亮?！?++”：耀眼強(qiáng)熒光。特異熒光強(qiáng)度“+”以上判定為陽(yáng)性，對(duì)照光應(yīng)呈“-”或“±”。根據(jù)呈"+"的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價(jià)。

三、熒光顯微鏡檢查

利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。

經(jīng)熒光抗體染色的標(biāo)本，需要在熒光微鏡下觀察。一般要求染色后立刻鏡檢，以防熒光消褪，造成假陰性結(jié)果。

熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)魹V光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭隔熱濾光片：阻斷紅外線通過(guò)而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過(guò)紫外線可見(jiàn)波長(zhǎng)的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過(guò)，保護(hù)眼睛。返回透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡?；驹恚簩⒖乖贵w反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對(duì)液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。第四節(jié)熒光免疫分析熒光免疫測(cè)定的方法類型非均相熒光免疫測(cè)定：

時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定、熒光酶免疫測(cè)定均相熒光免疫測(cè)定：

熒光偏振免疫測(cè)定時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定(TR-FIA)基本原理：是用鑭系稀土元素螯合物（如Eu3+）標(biāo)記抗體或抗原，檢測(cè)標(biāo)本中的抗原或抗體。此螯合物具有較長(zhǎng)熒光壽命，得用時(shí)間分辨熒光分析儀延緩測(cè)量時(shí)間，可排除標(biāo)本中非特異性熒光的干擾，所得信號(hào)完全是稀土元素螯合物發(fā)射的特異熒光。時(shí)間分辨檢測(cè)原理示意圖自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長(zhǎng):10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測(cè)定鑭系元素特異熒光時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（雙抗體夾心法）示意圖方法評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長(zhǎng)測(cè)量快速，易自動(dòng)化易受污染，本底增高因此,是很有發(fā)展前途的超微量物質(zhì)免疫分析技術(shù)。第五節(jié)熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用

熒光抗體技術(shù)在臨床上可用作腫瘤細(xì)胞的診斷；細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)的檢驗(yàn)及自身免疫病的協(xié)助診斷等方面。一、熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用二、熒光免疫測(cè)定的應(yīng)用思考題1．熒光、熒光效率、熒光壽命和熒光淬滅的概念是什么？2．常用的熒光物質(zhì)有哪些？3．熒光免疫技術(shù)有哪些類型？4．熒光抗體技術(shù)的基本原理是什么？3．什么是熒光抗體？如何制備、純化和鑒定熒光抗體？4．熒光抗體染色有哪些方法？各自的反應(yīng)原理是什么？5．熒光免疫測(cè)定的基本原理是什么？有哪些方法類型?課堂練習(xí)1、用于標(biāo)記熒光抗體的熒光素應(yīng)符合下列要求，除外A與蛋白質(zhì)分子形成離子鍵B熒光效率高，與蛋白結(jié)合后仍能保持較高的熒光效率C熒光色澤與背景組織色澤對(duì)比鮮明D與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化和免疫學(xué)性質(zhì)E標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，安全無(wú)毒（A）2、熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)中，與普通光學(xué)顯微鏡相同的是A光源B濾板C聚光器D目鏡E物鏡（D）3、不能作為熒光顯微鏡光源的是A高壓汞燈B氚燈C紫外燈D氙燈E鹵素?zé)簦–）4、熒光抗體染色技術(shù)中，特異性最高，非特異性染色最低的方法是A直接法B間接法C補(bǔ)體結(jié)合法D雙標(biāo)記法E以上都不對(duì)(A)5、目前公認(rèn)的最有效的檢測(cè)抗核抗體的方法是AELISAB放射免疫技術(shù)C直接凝集實(shí)驗(yàn)D直接熒光法E間接熒光法(E)6、FITC在紫外光的激發(fā)下，所產(chǎn)生的熒光為A灰藍(lán)色B黃綠色C橙色D暗紅色E橙紅色（B）7、雙標(biāo)記熒光抗體技術(shù)的主要用途是A提高熒光強(qiáng)度B提高熒光效率C可同時(shí)檢測(cè)同一標(biāo)本中兩種抗原D使用一種標(biāo)記物可檢測(cè)多種抗原E減少非特異性熒光（C）8、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定特點(diǎn)中不包括A標(biāo)記物熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)B測(cè)定范圍狹窄C標(biāo)記物為鑭系元素D能排除非特異性熒光的干擾E熒光強(qiáng)，靈敏度高（B）9、下列有關(guān)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定的敘述中，錯(cuò)誤的是