GB/T 18089-2008藍(lán)舌病病毒分離、鑒定及血清中和抗體檢測技術(shù)

犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

犌犅／犜１８０８９—２００８

代替ＧＢ／Ｔ１８０８９—２０００

藍(lán)舌病病毒分離、鑒定及血清中和

抗體檢測技術(shù)

犐狊狅犾犪狋犻狅狀，犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱狊犲狉狌犿狀犲狌狋狉犪犾犻狕犪狋犻狅狀犪狀狋犻犫狅犱狔

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２００８１２３１發(fā)布２００９０５０１實施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局

發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會

書

犌犅／犜１８０８９—２００８

前言

本標(biāo)準(zhǔn)代替ＧＢ／Ｔ１８０８９—２０００《藍(lán)舌病微量血清中和試驗及病毒分離和鑒定方法》。

本標(biāo)準(zhǔn)與ＧＢ／Ｔ１８０８９—２０００相比主要變化如下：

———對標(biāo)準(zhǔn)名稱進(jìn)行了修改；

———刪除了藍(lán)舌病病毒鑒定中的病毒中和試驗部分；

———增加了病毒鑒定中ＲＴＰＣＲ方法的鑒定。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ為規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國云南出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國深圳出入境檢驗檢

疫局。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：周曉黎、楊建明、艾軍、花群義、楊曉花、張其艷、嚴(yán)樹發(fā)、董俊、葉玲玲、徐維加。

本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：

———ＧＢ／Ｔ１８０８９—２０００。

Ⅰ

書

犌犅／犜１８０８９—２００８

藍(lán)舌病病毒分離、鑒定及血清中和

抗體檢測技術(shù)

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了藍(lán)舌病病毒分離、鑒定及血清中和抗體檢測的技術(shù)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于藍(lán)舌病病毒的分離、鑒定及動物感染藍(lán)舌病病毒后血清中和抗體的檢測。

２符號和縮略語

下列符號和縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

ＢＨＫ２１———幼倉鼠腎細(xì)胞株；

ＢＬＰ———乳糖蛋白胨緩沖肉湯；

ＢＴ———藍(lán)舌??；

ｂｐ———堿基對；

ＣＰＥ———致細(xì)胞病變作用；

Ｃ６／３６———蚊子細(xì)胞株；

ＤＥＰＣ———焦碳酸二乙酯；

ＳＰＦ———無特定病原體；

ＴＣＩＤ５０———半數(shù)組織培養(yǎng)感染量；

Ｖｅｒｏ———非洲綠猴腎細(xì)胞株。

３藍(lán)舌病病毒分離

３．１材料

１０日齡～１１日齡ＳＰＦ雞胚。

３．２設(shè)備與器材

雞胚開孔器、照蛋燈或照蛋箱、乳缽或組織搗碎器、倒置顯微鏡。

３．３試驗程序

３．３．１樣品

肝素抗凝血（每５ｍＬ血液用１０ＩＵ肝素）、臟器（脾、肝、腎、淋巴結(jié)）、精液、庫蠓。用于病毒分離的

樣品應(yīng)置冷藏容器中保存，在２４ｈ內(nèi)送到實驗室，并立即進(jìn)行處理。

３．３．２血液樣品制備

取肝素抗凝血５ｍＬ，用磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ，配方見附錄Ａ）洗滌血樣３次～４次，每次２０００ｒ／ｍｉｎ

離心１０ｍｉｎ，棄上清液后加入倍量ＢＬＰ（配方見附錄Ａ），置冰浴中用超聲波處理（４０μＡ、１ｍｉｎ）。經(jīng)處

理的樣品當(dāng)天使用，使用前置４℃保存，剩余樣品置－７０℃保存?zhèn)溆谩?/p>

３．３．３組織樣品制備

無菌采集動物脾、淋巴結(jié)、肝、腎各５ｇ，剪碎后加入ＢＬＰ１０ｍＬ（含青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ、鏈霉素

２０００μｇ／ｍＬ），置乳缽中研磨，４℃冰箱中浸提４ｈ，取上清液５ｍＬ用超聲波裂解處理（１００μＡ、１ｍｉｎ～

２ｍｉｎ）或凍融三次，３０００ｒ／ｍｉｎ離心２０ｍｉｎ，取上清液使用，使用前置４℃保存，剩