石蠟切片的制作

石蠟切片的制作2/2/20231植物制片的基本步驟1、取材2、殺死、固定、保存3、脫水、置換4、滲透、包埋5、切片、粘片6、染色、封固需要時(shí)間長(zhǎng)（十幾天），但可長(zhǎng)期保存。

2/2/202321.取材

材料來源及部位。①種類：②部位：③年齡或發(fā)育階段④是觀察橫切面還是縱切面？2/2/20233取材原則：動(dòng)作------快，輕，用力均勻體積合適刀要鋒利2/2/202342.固定

目的---保持原來的結(jié)構(gòu)固定液固定時(shí)間固定后的處理2/2/20235名稱優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)95%酒精材料固定后無需沖洗就可以脫水，使用簡(jiǎn)便，固定糖原和核酸原生質(zhì)收縮，但仍然能保持細(xì)胞壁的形狀甲醛福爾馬林市面出售為飽和液，濃度為40%，又稱福爾馬林，是很好的硬化劑，材料易收縮。滲透力慢。與酒精混合，可以阻止材料過于堅(jiān)硬冰醋酸H3COOH滲透力強(qiáng)而快，能溶解脂肪，可保存蛋白質(zhì)不變質(zhì)，是染色體很好的保存劑組織發(fā)脹，可阻止酒精、甲醛等引起的收縮2/2/20236鋨酸OsO4能良好固定細(xì)胞的細(xì)微構(gòu)造，是脂肪類的唯一固定劑。用于電鏡的超薄切片中作為主要的固定劑。是目前最昂貴最好的固定劑。滲透力很弱，所以材料越小越好。名稱優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)戊二醛常用的非凝固型固定劑。特點(diǎn)：固定蛋白質(zhì)；可以部分保持酶和蛋白質(zhì)的活性。固定能力比甲醛強(qiáng)。常用于電鏡制片的固定。不能保存脂肪，對(duì)細(xì)胞膜的顯示較差。2/2/20237混合固定劑固定組織時(shí)，單獨(dú)使用一種固定劑很難對(duì)組織成分有理想的固定效果。通常幾種固定劑混用，制成混合固定劑。以求得補(bǔ)償某試劑對(duì)組織所致的缺陷。2/2/20238F.A.A固定液最常用的固定液。固定時(shí)間，不受限制，短為24小時(shí)，長(zhǎng)可延至數(shù)月或數(shù)年。[配法]－－－－

50％或70％酒精－－90毫升

冰醋酸－－－－－－5毫升

福爾馬林－－－－－5毫升

柔軟材料用50％酒精，堅(jiān)硬材料用70％酒精配制。

2/2/20239卡諾氏(Carnoy‘s)固定液

有極快的滲透力，固定根尖和花藥只需40-60分鐘，時(shí)間太長(zhǎng)不好(不能超一天)。固定后用95％酒精沖洗，在組織不能立即處理時(shí)，需轉(zhuǎn)入70％酒精中保存。配法有兩種：2/2/2023104%多聚甲醛---0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.3）配制該固定劑較適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，繼續(xù)浸泡固定2～24h（4度）。另外，該固定劑較為溫和，適于組織標(biāo)本的較長(zhǎng)期保存。

2/2/202311配制方法稱取40g多聚甲醛，加入500～800ml0.1mol/L磷酸緩沖液，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少許1MNaOH才能使溶液清亮，最后定容1000ml，充分混勻。

2/2/202312固定組織時(shí)應(yīng)注意：①保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。②組織塊不易過大過厚，厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。③固定液必須有足夠的量，一般大于組織20倍以上。(4)抽氣：使固定液盡快滲入材料內(nèi)部，并排除材料內(nèi)氣泡的干擾2/2/202313固定時(shí)間的選擇不同的固定液。材料的大小，組織的特性與致密度。溫度的不同。2/2/202314組織固定后的處理沖洗或漂洗：組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液造成的人為假象。修塊:大小合適、去除形態(tài)不好的部分，材料經(jīng)過固定后，需要保存下來以備利用，通常使用的保存劑是70%的酒精溶液，可以使一般的材料保存較長(zhǎng)的時(shí)間而不至于變壞。通常在4度冰箱中存放。2/2/2023153.洗滌與脫水固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會(huì)影響以后的染色效果。水和透明劑不能互溶，只有脫去水分后，才能讓透明劑進(jìn)入。2/2/202316凡用酒精配制的固定液，一律用同濃度的酒清洗。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混，為了減少組織材料的急劇收縮，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行.30%--50%---70%---85%---95%--100%---100%每步30-60分鐘左右。2/2/202317要求及注意：保證脫水梯度和每一步脫水時(shí)間，水要完全脫凈，不同大小的組織塊脫水時(shí)間不同。不能過度脫水（過久使組織變脆,收縮）在酒精中加入曙紅，用于染色。材料可以放在70％酒精中保存，正丁醇、叔丁醇、丙酮等也可做脫水劑。2/2/2023184.透明純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。2/2/202319通常組織先經(jīng)純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1～2小時(shí)，再轉(zhuǎn)入純透明劑中浸漬。材料進(jìn)入無水的透明劑中后，若透明劑變渾濁，說明材料中的水分未脫干凈，必須回到前面一級(jí)無水的脫水劑中再次脫水（但是效果往往不好）。透明劑的浸漬時(shí)間則要根據(jù)組織材料塊大小及組織特性而定。如果透明時(shí)間過短或者過長(zhǎng)，都不合適。2/2/2023205.浸蠟與包埋用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時(shí)或者過夜，再先后移入熔化的石蠟液中浸漬幾天浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)3℃左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。2/2/202321石蠟特點(diǎn)：熔點(diǎn)：45-50℃軟蠟55-60℃硬蠟材料較硬的，用熔點(diǎn)較高的石蠟包埋；切片較薄時(shí)（在8微米以下），用熔點(diǎn)較高的石蠟包埋；夏季采用熔點(diǎn)較高的石蠟（56,58）,冬季宜選用熔點(diǎn)較低的石蠟（52,54）。2/2/202322石蠟的處理：新蠟應(yīng)溶一次，增加密度。并用濾紙過濾去處雜質(zhì)。加5%~10%的蜂蠟,增加石蠟的韌性。反復(fù)溶的舊蠟包埋效果更好。如果將2-3種不同熔點(diǎn)的石蠟混合使用效果好。2/2/202323程序：在溶蠟箱中進(jìn)行55-60℃，恒溫。浸蠟：二甲苯透明后的組織塊在二甲苯：石蠟（1：1）中1次，在石蠟中2次，每次1-3天左右。包埋：在室溫進(jìn)行2/2/2023246.切片包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的方形或長(zhǎng)方形，附于小木塊上，2/2/2023252/2/202326切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可用熱水或冷水等方法適當(dāng)改變蠟塊硬度。通常切片厚度為8～12微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。2/2/2023277.貼片與烤片用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后操作中使材料脫落在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟片鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入45℃溫箱中干燥2/2/202328常用的粘片劑－郝伯特(Haupt)粘貼劑：動(dòng)物膠(明膠)1克水100毫升甘油15毫升石碳酸2克2/2/202329注意問題：使用時(shí)明膠液不能多。粘貼時(shí)注意蠟片的方向（光面向下）展片臺(tái)的溫度如果超過45℃以上，載玻片上的蠟就會(huì)熔化，以后的脫蠟困難，難以染色！而且材料會(huì)發(fā)脆。2/2/2023308.脫蠟及水化干燥后的切片需脫蠟及水化才能在水溶性染液中進(jìn)行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級(jí)經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。脫蠟及以后過程中，必須時(shí)時(shí)知道材料位于載玻片的哪一面！2/2/202331其順序如下----

二甲苯→1/2二甲苯+1/2純酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色

以上各級(jí)約需5～10分鐘。

2/2/2023329.染色染色的目的是使細(xì)胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色和足夠強(qiáng)的差異以便于觀察。經(jīng)染色可顯示細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器及內(nèi)含物以及不同類型的細(xì)胞組織。根據(jù)觀察要求及研究?jī)?nèi)容采用不同的染色劑及染色方法。2/2/202333(1)天然染料A、蘇木精也叫蘇木色精，源于蘇木科植物蘇木的心材。多色性，需媒染；配制后需充分氧化遇酸呈紅色，遇堿呈藍(lán)色。常用配方：海氏蘇木精。2/2/202334B、洋紅取自胭脂蟲雌蟲體，為酸性染料。特點(diǎn)：滲透力強(qiáng)；一般用于涂抹制片?？蓪⒑思叭旧w染成深紅色。2/2/202335(2)煤焦染料A、番紅植物組織學(xué)常用染料。堿性；常用于與固綠、亮綠、苯胺藍(lán)對(duì)染，或與結(jié)晶紫、桔紅G進(jìn)行三重染色。其中以番紅-O為最好。染色效果：木化細(xì)胞壁紅色，角化細(xì)胞壁粉紅色，栓化細(xì)胞壁黃褐色，染色體、核仁、中心體紅色。2/2/202336B、亮綠酸性染料；可將細(xì)胞質(zhì)和纖維素壁染成綠色?？膳c番紅對(duì)染。C、固綠酸性染料；特點(diǎn)與亮綠類似。色彩不如亮綠鮮艷，但不易褪色2/2/202337J、甲苯胺藍(lán)-O（TBO）酸性染料。常與番紅或真曙紅進(jìn)行二重染色。染纖維素，細(xì)胞壁，鞭毛等。2/2/202338復(fù)合染色法番紅與固綠染色法番紅用l％的水溶液，固綠用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)，染色步驟如下：1.番紅水液

番紅0.1g溶入蒸餾水,定溶至100ml。

2.番紅酒液

番紅0.5g或1g溶入50%酒精,定溶至100ml。

2/2/202339TBO整體染色1烘干的切片放入0.5％TBO,10-30s(易染色過深)TBO配制--0.5％TBO溶在2.5％Na2CO32流水沖洗10mins，3蒸餾水洗，烘干過夜4烘干的石蠟切片脫蠟（放入純二甲苯I中10mins，再轉(zhuǎn)入純二甲苯II中10mins），樹脂封片2/2/20234010.切片脫水、透明和封片染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經(jīng)梯度酒精脫水，在95％及純酒精中的時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)以保證脫水徹底；如染液為酒精配制，則應(yīng)縮短在酒精中的時(shí)間，以免脫色。二甲苯透明后，滴加適量（1～2滴）中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現(xiàn)氣泡。2/2/202341封片加拿大樹膠（Canadabalsam）溶于二甲苯中成為——二甲苯-加拿大樹膠液。絕對(duì)不能混入水和酒精，否則樹膠回渾濁，不能觀察。2/2/202342將載玻片從二甲苯中取出，務(wù)必使有材料的一面朝上。迅速在材料上加適量封固劑，封固劑最好正正地滴在材料上（不能使二甲苯干很久后才封片）。