蛋白質(zhì)分離純化主要方法11-12

蛋白質(zhì)分離純化主要方法2/2/202312/2/20232蛋白質(zhì)分離純化方法分子量大小溶解度差異透析及超濾密度梯度離心凝膠過(guò)濾等電點(diǎn)沉淀及pH控制鹽溶及鹽析有機(jī)溶液分級(jí)沉淀溫度對(duì)溶解的影響電荷不同區(qū)帶電泳離子交換層析PAGE等電聚焦毛細(xì)管電泳對(duì)配體親和力親和層析HPLC2/2/20233蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟層析法電泳法超離心法超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等電點(diǎn)沉淀有機(jī)溶劑沉淀透析│←前處理→│←粗分級(jí)→│←細(xì)分級(jí)→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶漲和自溶、酶解、化學(xué)處理）生物組織→無(wú)細(xì)胞提取液→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶2/2/20234鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、重金屬鹽沉淀法、生物堿或酸類沉淀法、加熱變性沉淀法離子交換層析吸附層析凝膠過(guò)濾（分子篩）親和層析等電聚集層析分離純化方法沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦膜分離技術(shù)透析超濾離心法2/2/20235純度鑒定分子量測(cè)定層析法：凝膠過(guò)濾;高效液相色譜法(HPLC)電泳法：PAGE、梯度凝膠電泳、等電聚焦電泳等免疫化學(xué)法：專一的沉淀線SDS-PAGE電泳法：測(cè)定亞基數(shù)超速離心：成分均一其它：如,結(jié)晶法……2/2/20236定義：利用半透膜把大小分子分開(kāi)的方法。操作

蛋白質(zhì)溶液置半透膜袋中，置流動(dòng)溶劑（如蒸餾水）中，使小分子雜質(zhì)（如無(wú)機(jī)鹽、單糖、雙糖、AA、小肽等透出）蛋白質(zhì)留于袋中而得到分離。一透析2/2/20237透析工作圖半透膜原理2/2/202382/2/20239二層析技術(shù)（chromatography）p148一、層析技術(shù)一般原理二、層析技術(shù)分類及應(yīng)用2/2/202310（一）、層析技術(shù)原理層析系統(tǒng)都由兩個(gè)相組成：一是固定相，它是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；另一是流動(dòng)相，即可以流動(dòng)的物質(zhì)，當(dāng)待分離的混合物通過(guò)固定相時(shí)，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對(duì)比）不同，與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作用小，向前移動(dòng)的速度快。反之，與固定相相互作用越強(qiáng)的組份，向前移動(dòng)速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到將各組份分離的目的。2/2/202311(二)層析相關(guān)概念1.固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對(duì)層析的效果起著關(guān)鍵的作用。2/2/2023122.流動(dòng)相：在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。2/2/202313（三）、層析法分類（按分離原理分類）分配層析吸附層析凝膠過(guò)濾（分子篩層析）離子交換層析親和層析

聚焦層析2/2/202314層析法分類（按裝置分類）

紙層析薄膜層析

柱層析2/2/202315填充物分部收集玻璃柱洗脫液樣品2/2/202316各類層析的原理和載體類別分離原理基質(zhì)或載體吸附層析

化學(xué)、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應(yīng)纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)sepharose、sephadex離子交換層析離子基團(tuán)的交換反應(yīng)離子交換樹(shù)脂、纖維素、葡聚糖親和層析分離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點(diǎn)和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有多種電荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的sepharose6B）2/2/202317

原理：以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃?dòng)相。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動(dòng)相中的溶解度不同。層析時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相從固定相上流過(guò)時(shí)，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動(dòng)相向前移動(dòng)。吸附層析（absorptionchromatography）2/2/2023182/2/202319原理：

分配層析是利用混合物(樣品)在二種或二種以上的不同溶劑中的分配系數(shù)不同而使物質(zhì)分離的方法分配層析實(shí)際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相（展開(kāi)劑）。分配層析(p148)2/2/202320物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速度可以用Rf表示：色斑中心至原點(diǎn)中心的距離Rf=──────────────溶劑前緣至原點(diǎn)中心的距離載體：纖維素硅藻土硅膠應(yīng)用：各種生化物質(zhì)的分離鑒定2/2/202321凝膠層析（gelfiltration）又稱為凝膠排阻層析（gelexclusionchromatography）、分子篩層析（molecularsievechromatography）、凝膠過(guò)濾（gelfiltration）、凝膠滲透層析（gelpermeationchromatography）等。2/2/202322原理p303凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。2/2/202323載體

葡聚糖凝膠（sephadex）

瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用:

測(cè)定分子量脫鹽和濃縮分離提純生物大分子除去熱原物質(zhì)2/2/202324離子交換層析（ion-changechromatography）原理離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過(guò)一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。2/2/202325分類：根據(jù)交換劑上吸附的離子交換基團(tuán)不同，陽(yáng)離子交換劑;陰離子交換劑；按其解離度的大小，分為強(qiáng)、中強(qiáng)、弱三種：

2/2/202326磷酸基團(tuán)（PO3H2）和亞磷酸基團(tuán)（PO2H）

結(jié)合磺酸基團(tuán)（SO3H）弱酸型

強(qiáng)酸型中等酸型結(jié)合酚羥基（OH）或羧基（COOH）

弱堿型

強(qiáng)堿型中等堿型季胺基團(tuán)（N(CH3)3），

叔胺（N(CH3)2）、仲胺（NHCH3）、伯胺（-NH2）

二乙基氨基乙基（DEAE）

離子交換層析分類陰離子交換劑陽(yáng)離子交換劑2/2/2023272/2/202328交換過(guò)程2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2/2/2023292/2/202330應(yīng)用

制備、純化生物物質(zhì)定量、定性測(cè)定混合物中各組分2/2/202331原理欲分離的大分子物質(zhì)S和相對(duì)應(yīng)的專一物質(zhì)L(配體)以次級(jí)鍵結(jié)合，能生成一種可解離的絡(luò)合物L(fēng)—S。其中的L又能與活化的基質(zhì)M以共價(jià)鍵首先結(jié)合，而形成M—L—S復(fù)合物。根據(jù)L—S之間能可逆地結(jié)合與解離的原理發(fā)展起來(lái)的層析方法稱為親和層析法。親和層析（affiuitychromatography）

2/2/202332+待純化分子配體a.待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子配體L基質(zhì)M待分離物質(zhì)SL-S復(fù)合物2/2/2023332/2/202334應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結(jié)構(gòu)與功能基質(zhì)纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex2/2/202335聚焦層析（Chromatofocusing）

該法是在等電點(diǎn)聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點(diǎn)的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過(guò)程叫做聚焦效應(yīng)。原理2/2/202336pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處。從此位置開(kāi)始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。在聚焦層析過(guò)程中，一種樣品分次加入時(shí)，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時(shí)間進(jìn)行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過(guò)程都能順利完成。2/2/2023371、pH梯度的形成2、蛋白質(zhì)行為3、聚焦效應(yīng)2/2/202338層析時(shí)的聚焦效應(yīng)示意圖pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動(dòng)速率2/2/202339幾種主要層析方法比較2/2/202340二、電泳技術(shù)

電泳的一般原理電泳技術(shù)的分類電泳的影響因素常用電泳技術(shù)2/2/202341電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場(chǎng)的作用下，各組分泳動(dòng)的方向和速度也各異，而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。2/2/202342電泳分類（一）按原理分四種1.區(qū)帶電泳：是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的電泳技術(shù)。

2.自由界面電泳：這是瑞典Uppsala大學(xué)的著名科學(xué)家Tiselius最早建立的電泳技術(shù)，是在Ｕ形管中進(jìn)行電泳，無(wú)支持介質(zhì)，因而分離效果差，現(xiàn)已被其他電泳技術(shù)所取代。

3.等速電泳：需使用專用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各電泳區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，并以等速向前運(yùn)動(dòng)。

4.等電聚焦電泳：由兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中自動(dòng)形成pH梯度，當(dāng)被分離的生物大分子移動(dòng)到各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶。2/2/202343（二）按支持介質(zhì)的不同可分為：

1.紙電泳

2.醋酸纖維薄膜電泳3.瓊脂凝膠電泳4.聚丙烯酰胺凝膠電泳

5.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）。2/2/202344（三）按支持介質(zhì)形狀不同1.薄層電泳；

2.板電泳；

3.柱電泳。（四）按用途不同可分為：

1.分析電泳；2.制備電泳；

3.定量免疫電泳；2/2/202345（五）按所用電壓不同可分為：

1.低壓電泳：100V～500V，電泳時(shí)間較長(zhǎng)，適于分離蛋白質(zhì)等生物大分子。

2.高壓電泳：1000V～5000V，電泳時(shí)間短，有時(shí)只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質(zhì)的分離。（六）按pH的連續(xù)性不同可分為：1.連續(xù)pH電泳：如紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳；2.非連續(xù)pH電泳：如聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳；2/2/202346電泳技術(shù)分類（按實(shí)驗(yàn)裝置分類）

紙電泳

薄膜電泳

凝膠電泳

毛細(xì)管電泳2/2/202347毛細(xì)管電泳2/2/202348三、影響電泳的因素（一）帶電顆粒的物理性狀（二）支持物介質(zhì)：（三）緩沖溶液(pH離子強(qiáng)度)（四）電場(chǎng)強(qiáng)度：（五）電滲現(xiàn)象：（六）焦耳熱對(duì)電泳的影響2/2/202349四、常用電泳技術(shù)1、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）3、SDS4、PAGE等電點(diǎn)聚焦3、瓊脂糖電泳4、毛細(xì)管電泳2/2/202350聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

凝膠聚合反應(yīng)及催化系統(tǒng)

不連續(xù)PAGE

可產(chǎn)生的三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)2/2/202351聚丙烯酰胺凝膠電泳（PolyacrylamidegelelectrophoresisPAGE），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過(guò)程需要有自由基催化完成。2/2/202352光聚合催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產(chǎn)生自由基，催化聚合反應(yīng)。聚合方式化學(xué)聚合通常是加入催化劑過(guò)硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基2/2/202353不連續(xù)表現(xiàn)：緩沖液及凝膠pH不連續(xù)凝膠孔徑不連續(xù)電位梯度不連續(xù)2/2/202354⊕–電極緩沖液pH8.3

Tris-Gly

分離膠pH：8.9Tris-HCl電極緩沖液pH8.3Tris-Gly

濃縮膠pH：6.7Tris-HCl

樣品

2/2/2023552/2/2023562/2/202357SDS原理：

當(dāng)SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了其原來(lái)的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時(shí)蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時(shí)產(chǎn)生的泳動(dòng)率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對(duì)數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。應(yīng)用:測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)亞基數(shù)2/2/202358SDSseparatesproteinsbyMW2/2/2023592/2/202360等電點(diǎn)聚焦（isoelectricfocusing）

原理:在一定抗對(duì)流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過(guò)時(shí)，便形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過(guò)程中，就被濃集在與其等電點(diǎn)相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量2/2/202361等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－2/2/2023622/2/202363等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)pI2/2/202364雙向電泳2/2/2023652/2/2023662/2/202367毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離，分離后的樣品依次通過(guò)設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測(cè)器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了快速和高效分離。

毛細(xì)管電泳是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測(cè)定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。2/2/202368毛細(xì)管電泳裝置示意圖高壓電源光